Реверсия нанобактерий в исходные формы. L-формы бактерий. Разнообразие систем регуляции биоплёнкообразования

Введение

На протяжении многих столетий ученые исследовали микробные популяции и механизмы их формирования, и только в конце прошлого века столкнулись с особой формой организации бактериальных культур - сообществом микроорганизмов, способных колонизировать объекты окружающей среды и существовать не только в виде микропланктона, но и специфически организованных биоплёнок. Биоплёнки - подвижные, постоянно изменяющиеся гетерогенные сообщества (Чеботарь, 2012), которые могут быть образованы бактериями одного или нескольких видов и состоять как из активно функционирующих клеток, так и из покоящихся или некультивируемых. Формирование подобных высокоспециализированных сообществ - одна из основных стратегий выживания бактериальных культур не только в окружающей среде, но и в организме человека. В целом, биоплёнки представляют собой группу микробных клеток, окруженных толстым, состоящим из высокомолекулярных веществ слизистым слоем.

Механизм формирования биоплёнок

Обычно микроорганизмы существуют в виде свободно плавающих масс или единичных колоний, но некоторые представители бактериального царства стремятся прикрепиться к определенному субстрату-поверхности и образовать биоплёнку, механизм образования которой сложен, строго регулируем и включает четыре последовательные стадии.

1 этап: обратимое (первичное) прикрепление к поверхности. Первый этап формирования биопленки характеризуется обратимой адгезией, связанной с действием неспецифических физико-химических сил между молекулами и структурами на поверхности микроорганизмов (элементами клеточной стенки, жгутиков, пилей) и твёрдого субстрата за счёт различных взаимодействий: Ван-дер-Вальсовых, гидрофобных, ионных, электростатических;

2 этап: необратимое прикрепление к поверхности. После адсорбции бактериальная клетка перемещается вдоль поверхности субстрата, прочно связываясь с ним посредством факторов адгезии, а также с помощью неполимерных адгезинов, которые различают структурные элементы поверхностей тканей хозяина - коллаген, эластин, гликопротеины, гиалуроновую кислоту. На этом же этапе, помимо прочного прикрепления к субстрату, происходят: потеря бактериями подвижности, межклеточные взаимодействия, обмен генами между микроорганизмами как одного, так и разных видов.

3 этап: созревание - maturation 1 . После прочного прикрепления к субстрату и обмена генами прикрепившиеся бактерии начинают синтезировать экзополисахаридный окружающий матрикс, известный как внеклеточное полимерное вещество (extracellular polymeric substance ), который является предохранительной «слизью» и составляет 85% всей зрелой биопленки (Чеботарь, 2012; Фролова, 2015). Этот матрикс способствует образованию первоначальной биоплёнки из мелких колоний бактерий. Компоненты экзополисахарида варьируют в зависимости от того, какие микроорганизмы являются его частью.

4 этап: рост - maturation 2 . На данном этапе образуется зрелая биоплёнка, после чего наступает пора вторичных колонизаторов, то есть клеток, которые прикрепляются к бактериям, уже локализованным на поверхности (Афиногенова, 2011).

Зрелые биопленки способны терять единичные фрагменты, которые, распространяясь по макроорганизму, прикрепляются к субстратам и образуют новые биопленки. Кроме того, в зрелых биоплёнках бактерии не делятся, так как окружены плотным матриксом, и сохраняют высокую жизнеспособность.

Формирование биоплёнки происходит достаточно быстро. Присоединение бактерий друг к другу происходит за несколько минут, прочно связанные колонии образуются за 2−4 часа, а выработка внеклеточного полимерного вещества происходит в течение 6−12 часов, после чего бактерии, образующие биоплёнку, становятся в значительной степени толерантными к антибиотикам, дезинфицирующим веществам, антисептикам. Кроме того, биоплёнки быстро восстанавливаются после механического воздействия (Чеботарь, 2012).

Ультраструктура биоплёнок

Ультраструктура биоплёнок установлена с помощью конфокальной сканирующей лазерной микроскопии. Внеклеточный матрикс микробных клеток имеет специфическое строение и образован трёхмерными грибовидными или колонноподобными структурами. Выделяемый на этапе созревания биопленок экзополисахарид представлен двуслойным гетерополисахаридом, универсальным для каждого вида микроорганизмов. Его наружный слой содержит полисахариды в гидратированном состоянии (декстран, гиалуроновую кислоту, целлюлозу), а внутренний наполнен мембранными везикулами, которые способны выступать в роли факторов патогенности (такие везикулы содержат щелочную фосфатазу С, протеазы, лизоцим). Вещества везикул также выполняют функцию лизиса ослабленных бактериальных клеток, фрагменты которых в дальнейшем являются ростовым фактором и источником питания для остальных членов биопленки.

Все составляющие матрикса разделены каналами, по которым осуществляется транспорт питательных веществ, кислорода, а также выделение конечных продуктов метаболизма бактериальных клеток. За образование и сохранение таких транспортных каналов несут ответственность поверхностные структуры - рамнолипиды, состоящие из смеси полисахаридов, белков, нуклеиновых кислот и других веществ.

В матриксе биопленки также находится экстрацеллюлярная ДНК, которая участвует в процессах адгезии, межклеточных взаимодействиях и обуславливает специфику существования биопленочных сообществ (Тец, 2012).

Морфология клеток, входящих в состав биоплёнки

С помощью электронной микроскопии установлено, что на начальных этапах формирования биопленки морфология микроорганизмов не меняется (Фролова, 2015). На последующих, более поздних этапах, бактериальные структуры приобретают морфологическую специфику, связанную с прикрепленным состоянием и коллективным сосуществованием. Кроме того, у клеток в составе биоплёнки происходит замена поверхностных структур, увеличивается частота обмена генетическим материалом между особями в сообществе, деформируется ультраструктурная организация.

Свойства и роль в защите бактериальных популяций

Биопленки являются одним из наиболее значимых факторов защиты, существенно повышая толерантность бактерий к стрессовым ситуациям (нехватка кислорода и питательных веществ в условиях голодания), к факторам иммунной системы человеческого организма, к действию внешних условий (антибиотики, дезинфекторы, стерилизация). Такая толерантность способствует приобретению абсолютной резистентности к факторам, которые могли бы уничтожить бактерий, находись они в свободном состоянии.

Защитная роль биопленок заключается в следующих свойствах:

1. Свойство барьера. Биоплёнки предотвращают глубокое проникновение в их матрикс крупных молекул и клеток, вызывающих воспаление, и служат диффузным барьером для маленьких антимикробных агентов;
2. Совокупные защитные свойства. Бактерии (как одного, так и разных видов) способны обмениваться факторами защиты (продуктами метаболизма или генами), то есть осуществлять взаимозащиту. Так, бактерии одного вида, резистентные к действию антибиотиков, могут передавать гены, ответственные за резистентность, бактериям другого вида, к данному антибиотику чувствительным, обеспечивая таким образом повышение их устойчивости к действию фактора;
3. Свойство обмена, обеспечивающее передачу между микроорганизмами, входящими в состав одной биоплёнки, генов и продуктов жизнедеятельности (Чеботарь, 2012; Тец, 2012);
4. Свойство бездействия, то есть образование неподвижных (неактивных, неметаболизирующих, спящих) субпопуляций - ключевое свойство, присущее исключительно биоплёнкам. Для того чтобы антибиотик подействовал на микроорганизм, он должен быть метаболически активным. Поэтому неактивные бактерии в биоплёнках являются наиболее устойчивыми к подобного рода воздействиям (Тец, 2012; Фролова, 2015).

Разнообразие систем регуляции биоплёнкообразования

Клетки в составе межклеточного матрикса обладают « чувством кворума» (quorum sensing ) - способностью передавать информацию и регулировать свое поведение за счёт секреции сигнальных молекул. Другими словами, это система регуляции, находящаяся внутри биоплёнки. Известно три системы, которые отличаются друг от друга природой аутоиндукторов:

1. Используется преимущественно грамотрицательными бактериями, а в качестве сигнальных молекул выступают ацилированный лактон гомосерина, который связывается с белком-регулятором, взаимодействующим с двумя регуляторными ферментами - люциферазой и гомосерин-лактоно-синтазой. Активация регуляторных белков индуцирует создание микробами кластеров биоплёнки (Тец, 2012; Туркутюков, 2013).
2. Характерна для грамположительных бактерий и функционирует с использованием линейных и циклических форм пептидов, фуранов, лактонов, их производных, секретируемых во внешнюю среду. Одни из них взаимодействуют с мембраносвязывающими сенсорными киназами, которые проводят сигнал через мембрану, другие транспортируются в клетку с помощью пермеаз, где связываются с внутриклеточными рецепторами. Сигнальным механизмом таких систем является каскад фосфорилирования-дефосфорилирования. Информационные молекулы взаимодействуют с двухкомпонентными системами, в состав которых входит сигнальный белок киназа, связанный с мембраной. Киназа определяет информационный пептид, а затем фосфорилирует и активирует белок-регулятор, связывающийся с ДНК и регулирующий транскрипцию. Сигнальные пептиды этой системы закодированы в хромосоме, а рецепторные белки - в плазмидах. Таким образом, с помощью подобной коммуникации транслоцируются плазмиды, несущие гены устойчивости к антибиотикам, гены гемолизинов, бактериоцинов и гены вирулентности.
3. Встречается у всех микроорганизмов, а сигнальные молекулы представлены бутиролактоном, хинолом, гидроксикетонами, люциферазой. У бактерий есть рецепторные сенсорные белки, которые связывают аутоиндукторы, образуя комплекс, взаимодействующий с мембраносвязанной киназой. Киназа фосфорилируется, фосфат переносится на цитоплазматический белок, затем на регуляторный белок, который связывается с ДНК. В дальнейшем происходит активация генов, кодирующих регуляторные РНК, что ведет к прекращению экспрессии компонентов клеточных структур, реализующих внутривидовые межклеточные коммуникации.

Такая сложная система регуляции, основанная на продукции сигнальных молекул-индукторов, осуществляется на разных уровнях воздействия: транскрипционном, трансляционном, посттрансляционном. Благодаря «чувству кворума» в популяции биоплёнки постоянно происходит два вида селекции - положительная и отрицательная, то есть сохраняются клетки с выгодными свойствами и уничтожаются бактерии с «ненужными» фенотипами (Тец, 2012).

Участие ТА системы (система токсин-антитоксин) в образовании биоплёнки

Говоря о биоплёнках, стоит отметить, что не каждый микроорганизм способен к их образованию. Процесс синтеза экзополисахаридного матрикса обусловлен определенными факторами. Согласно последним результатам исследования Страсбургского университета им. Луи Пастера можно утверждать, что для образования биоплёнки необходимо наличие специализированного белка. К примеру, для образования сообщества Staphylococcus aureus необходимо наличие SasG-белка (в комплексе с Zn 2+). SasG-белок представляет собой РНК-связывающий белок, который активизирует:

1) рост поверхностных структур бактерий - жгутиков, пилей;

2) синтез внеклеточных полисахаридов;

3) обеспечивает формирование толерантности.

За секрецию SasG-белка отвечает набор двух или более тесно связанных генов, которые в совокупности кодируют и белок, и соответствующий ему блокатор.

Данная система получила название TA-модуль. Она локализована в плазмиде. Это достаточно сложная система, которая обеспечивает не только возможность бактерий образовывать биоплёнки, но и обеспечивает ее жизнеспособность в целом. Согласно работе (Yamaguchi, 2011), если дочерняя клетка лишена плазмиды, то нестабильный антитоксин (блокатор), унаследованный с цитоплазмой материнской клетки, разрушается, а стабильный токсичный белок убивает клетку.

Помимо этого, ТА-модуль отвечает за:

1) регуляцию генов: некоторые токсины действуют как общие репрессоры экспрессии генов, в то время как другие более специфичны;

2) контроль роста: как отмечалось, бактериостатические токсины не убивают клетку-хозяина, а ограничивают её рост;

3) устойчивость клетки: в некоторых популяциях бактерий имеется субпопуляция клеток, обладающая устойчивостью к действию множества классов антибиотиков. Субпопуляция контролируется системами токсин-антитоксин. Эти медленнорастущие выносливые клетки страхуют популяцию от полного вымирания.

4) программируемую гибель клетки и выживание её «близких родственников» - различный уровень устойчивости клеток популяции к стрессовым условиям, обусловливающий программируемую гибель некоторых клеток, которая предотвращает вымирание всей популяции (погибшая клетка становится источником питания для остальных).

5) противодействие бактериофагам: когда бактериофаг нарушает транскрипцию и трансляцию клеточных белков, активация систем токсин-антитоксин ограничивает репликацию фага.

Клинический аспект изучения биоплёнок

В настоящее время достоверно доказана роль микробных биоплёнок в возникновении и развитии многих инфекционных заболеваний. Это инфекции сердечных клапанов и суставных протезов, инфекции раневых поверхностей. Раны представляют собой идеальный субстрат для микробной контаминации с последующим образованием биоплёнок. Биоплёнки в ране создают среду с определённым микроклиматом, для которого характерно низкое содержание кислорода. Биопленки задерживают миграцию и пролиферацию кератиноцитов, ингибируя тем самым защитные иммунные механизмы, а снаружи создают защитный слой, непроницаемый для противомикробных препаратов местного действия (Чеботарь, 2012а).

Характерными биоплёночными инфекционными патологиями являются гингивиты (воспаление десен), стоматиты (воспаление слизистой рта), образование зубного камня. Отиты - наиболее часто встречающаяся отоларингологическая проблема - также сопровождаются образованием биоплёнок, причем не только бактериальных, но и грибковых.

Помимо раневых инфекций, биоплёнки играют роль в хронизации заболеваний мочевыделительной системы, катетер- и имплант-ассоциированных инфекций (катетеры, водители ритма, сердечные клапаны, ортопедические устройства), заболеваний ССС (синуситах, эндокардитах). Иными словами, биоплёнки играют важнейшую роль в патогенезе широкого спектра как поверхностных, так и глубоких инфекционных заболеваний. Все эти заболевания трудны для лечения, имеют высокую частоту рецидивов и некоторые из них могут явиться причиной летальных исходов.

При подозрении на наличие биоплёнкообразующих микроорганизмов in vivo учитываются следующие факторы:

1) отслоение биоплёнок в кровотоке или мочевыводящем тракте может приводить к формированию эмболов;

2) биоплёнки грамотрицательных бактерий могут продуцировать эндотоксин (липополисахарид), что ведет к инфекционно-токсическому шоку и ДВС-синдрому;

3) бактерии в биоплёнках могут обмениваться плазмидами резистентности (передача резистентности от вида к виду);

4) бактерии в биоплёнке не поддаются воздействию иммунной системы хозяина;

5) биопленки могут снижать чувствительность бактерий к антимикробному агенту.

Последние три пункта указывают на то, что биоплёнки обладают высокой резистентностью к антибиотикам. Однако относительно них более уместно употребить термин толерантность. Примером возникновения феномена толерантности может служить SasG-белок Staphylococcus aureus . Его биосинтез провоцирует сбой в пострепликационном цикле, при котором нарушается функционирование бактериального фермента гиразы (аналог топоизомеразы-4 у бактерий). Это приводит к возникновению персистеров.

Персистеры - уникальные клетки бактериальных сообществ, которые, обладая тем же набором генов, что и остальные микроорганизмы сообщества, многократно устойчивы к внешним факторам в отличие от окружающих их клеток (Ульянов, 2014). Персистеры отличаются от обычных бактерий своей физиологией: даже в благоприятных условиях они формируют вокруг себя экзополисахаридный матрикс, часто растут гораздо медленнее обычных бактерий, и, как уже было сказано, отличаются высокой резистентностью к внешним факторам. Персистеры составляют небольшую часть бактериального сообщества, но их количество возрастает в стационарной фазе роста. Интересно, что дочерние клетки обладают такой же резистентностью к внешним факторам, как и родительские клетки-персистеры.

Рассмотрим механизм резистентности персистеров. Предположим, что на бактериальную колонию действует внешний фактор - например, антибиотик. Антибиотик ингибирует активность гиразы (топоизомеразы-4), в результате чего в бактериальной клетке возникают двуцепочечные разрывы ДНК, но только в тех участках, где гираза активна, то есть, в районе «репликативной вилки». Если клетки защищены внеклеточным полимерным веществом, и количество таких мест не больше двух-четырех, то клеточные системы защищают бактерию от гибели, восстанавливая повреждения. У обычных быстрорастущих бактериальных клеток подобных разрывов много и ДНК при применении антибиотика деградирует, в то время как ДНК персистеров сохраняется. Действие антибиотиков может быть различным, но они все встречаются с одной и той же проблемой: медленно развивающиеся, хорошо защищённые персисторы менее подвержены стрессу и успевают «законсервироваться», прежде чем им будет нанесен необратимый ущерб.

Приведенная информация не исчерпывает данных об особенностях микробных биоплёнок. Следует отметить, что, несмотря на большой теоретический материал и важность проблемы, остаются нерешёнными вопросы, связанные с биоплёнкообразующей активностью патогенных и условно патогенных микроорганизмов в составе нозокомиальной микрофлоры медицинских стационаров различного профиля. Отсутствуют препараты, обладающие эффективностью против биоплёнок и микрофлоры в составе внеклеточных матриксов, а также средства борьбы со зрелыми биоплёнками. Эта проблема требует дальнейших разработок.

Библиография

1. Yamaguchi Y., Inouye M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nature Reviews Microbiology 2011, 9(11):779-790.

2. Афиногенова А.Г., Доровская Е.Н. Микробные биопленки ран: состояние вопроса // Травмотология и ортопедия. – 2011. – №3. – С.119–125.

3. Балко А.Б., Балко О.И., Авдеева Л.В. Формирование биопленки штаммами Pseudomonas aeruginosa // Микробиологический журнал. – 2013. – №2. – С.50–56.

4. Мальцев С.В., Мансурова Г.Ш. Что такое биопленка? // Практическая медицина. – 2011. – №53. – С.7–10.

5. Тец В.В., Тец. Г.В. Микробные биопленки и проблемы антибиотикотерапии // Практическая пульмонология. – 2013. – №4. – С. 60–64.

6. Туркутюков В.Б., Ибрагимова Т.Д., Фомин Д.В. Молекулярные особенности морфологии биопленок формируемых штаммами неферментирующих грамнегативных бактерий // Тихоокенский медицинский журнал. – 2013. – №4. – С.44–47.

7. Ульянов В.Ю., Определенцева С.В., Швиденко И.Г., Норкин И.А., Коршунов Г.В., Гладкова Е.В. Биологическая кинетика биопленок клинических штаммов Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa, выделенных у больных с бронхолегочными осложнениями при травматической болезни спинного мозга // Клиническая лабораторная диагностика. – 2014. – №8. – С.43–47.

8. Фролова Я.Н. Биологические свойства биопленок токсигенных штаммов Corinobacterium Diphtheriae gravis TOX + : дис. … канд.биол.наук: 12.06.2015 / Фролова Яна Николаевна. – Ростов, 2015. – 118 с.

9. Чеботарь И.В. Механизм антибиопленочного иммунитета // Вестник Российской академии медицинских наук. – 2012. – Т.67. – №12. – С.22–29.

10. Чеботарь И.В., Кончалова Е.Д., Бугрова М.Л. Везикулярные структуры в системе «Нейтрофил – Биопленка Staphylococcus aureus» // Инфекционная иммунология. – 2012а. – №61. – С.35–39.

Накоплен экспериментальный материал, демонстрирующий способность НФ возобновлять рост в благоприятных условиях. Условия реверсии включают использование различных индукторов реверсии (физических, химических, биотических), но могут заключаться и только в отмене неблагоприятных воздействий, как, например, показано для микроорганизмов, подвергнутых воздействию гамма-лучей.

Среди физических факторов наиболее часто к реверсии приводит повышение температуры с 0,5-6оС до 20-22о С или до 37оС, кратковременный прогрев до 45оС. Быстрое увеличение КОЕ в микрокосмах рассматривается как подтверждение реверсии, а не возобновление роста нескольких выживших клеток.

В ряде случаев оптимизацией температуры не удается стимулировать реверсию. V. parahaemolyticus реверсирует при повышении температуры до 25оС в сочетании с использованием минимальной солевой среды. НФ V. harveyi and V. fischeri возобновляют рост при добавлении органических или неорганических источников азота, углерода или деструкторов перекиси водорода.

Среди химических индукторов реверсии НФ известна группа соединений, разрушающих перекись водорода (антиоксиданты). К таким соединениям относят пируват натрия, каталазу, витамин Е. Их вводят непосредственно в микрокосмы в качестве протекторов или в состав питательных сред, предназначенных для реверсии. Это позволило получить реверсию E. coli, V. parahaemolyticus. На эффективность реверсии влияет химический состав среды и ее агрегатное состояние (предпочтительнее жидкие питательные среды).

Для реверсии НФ в питательные среды добавляют ростовые биотические факторы: фетальную сыворотку, супернатант растущей культуры или выделенный из нее рекомбинантный белок Rpf. Сообщается о влиянии цитокинов на реверсию НФ. Некультивируемые вирулентные штаммы сальмонелл реверсировали in vitro и in vivo в присутствии фактора некроза опухоли (ФНО) .

Иногда единственно эффективный способ реверсии - это пассаж через восприимчивый организм. Так, например, рекультивация НФ патогенных штаммов сальмонелл при введении в организм чувствительных животных всегда приводила к положительному результату. Параллельная рекультивация тех же суспензий in vitro не давала положительных результатов .

Истинность реверсии, а не возобновление роста выживших клеток, остается наиболее дискуссионным вопросом. В качестве доказательства реверсии используют рост из небольшого инокулюма. Рост культуры из маленького количества у вегетативных клеток происходит гораздо медленнее, чем в вариантах с НФ .

Клеточные структуры точно не изучались, поскольку сами клетки не культивировались, а известны исключительно по фрагментам ДНК. Видимо, все-таки придется выделять "некультивируемых" в чистые культуры. Однако для этого нужны дешевые, быстрые и доступные любой лаборатории методы генетического анализа. Тогда, например, обнаружив в образце ДНК "некультивируемых", можно начать подбирать среды и условия, каждый раз проверяя генетическими методами: выросшая колония - это искомый "некультивируемый микроорганизм", или нет? Если нет - опять варьировать среды и условия, пока, наконец "некультивируемый" не станет культивироваться. Другой возможный способ "взглянуть им в лицо" - это попробовать посадить на выделенную "некультивируемую" ДНК какую-нибудь флуоресцентную или радиоактивную метку, запустить в природу и посмотреть, с кем она сгибридизируется по принципу комплиментарности. Что же касается организации ДНК - в основном для диагностики используют не всю ДНК, а только участок, кодирующий 16S рибосомальную РНК, и здесь каких либо принципиальных отличий между бактериями, археями и "некультивируемыми", нет. 16S РНК выбрана по ряду вполне биологически обоснованных причин. Но такой подход еще и "от бедности": анализировать целую ДНК очень накладно и трудоемко, полное секвенирование генома выполнено для очень немногих прокариот (вспомните, сколько сил и лабораторий по всему миру было задействовано на геном человека, а ведь у бактерии всего в 10 раз меньше генов, чем у нас) .

Исследование реверсии протопластов бактерий и грибов выявило сходство протекания у них данного процесса. Условно он может быть разделен на три этапа: 1) регенерация клеточной стенки, 2) реверсия, появление клеток-ревертантов, 3) восстановление нормального цитокинеза и появление клеток исходной формы.

Вместе с тем каждой группе микроорганизмов присущи свои особенности протекания реверсии протопластов, связанные со строением клеток и клеточных стенок, характером метаболизма и цитокинеза.

Реверсия бактериальных протопластов . Если при обработке лизоцимом или пенициллином в изотонической среде клеточная стенка с бактериальной клетки полностью не удалена, то при исключении этих агентов из среды происходит быстрое восстановление клеток. Если же клеточная стенка удалена полностью, образовавшийся истинный протопласт неспособен в обычных условиях ее регенерировать. Одним из условий, позволяющих таким формам ревертировать к исходному состоянию, является наличие в среде культивирования твердой или полутвердой основы. Ею может быть желатина (5-30%), агар (0,7-2%), мембранные фильтры, убитые бактериальные клетки или клеточные стенки. Причем использование твердого субстрата предпочтительнее.

Реверсия протопластов мицелиальных грибов . Реверсия к мицелиальным формам у грибных протопластов происходит как в жидкой, так и на поверхности твердой среды, или в слое полужидкого агара. Многие исследователи показали, что реверсия грибных протопластов может проходить тремя способами, различающимися характером формирования первичного мицелия. При первом способе протопласты первоначально образуют цепочку из дрожжеподобных клеток (до 20 клеток). Затем терминальная, уже осмотически устойчивая, продуцирует первичную гифу, образующую мицелий. Второй способ реверсии начинается с регенерации протопластами клеточной стенки, вследствие чего они становятся резистентными к осмотическому шоку. После чего протопласт образует зародышевую трубку. Третий способ реверсии грибных протопластов необычен. Протопласт, сохраняя сферическую форму, формирует новую оболочку в виде полочки, затем туда переносится содержимое материнского протопласта. Если появляется цепочка таких оболочек, то цитоплазма передвигается по этой цепочке, оставляя позади себя "тени" из клеточных стенок. Последняя клетка цепочки образует первичную гифу. Грибные протопласты могут ревертировать одним из трех способов, или у одного вида наблюдается все три способа реверсии. Трудно сказать, что влияет на выбор способа реверсии, возможно, видовые особенности организма, тип его цитокинеза, метод получения и условия инкубации протопластов или состав регенерационной среды.

Растущие и ревертирующие протопласты - хорошая модель для изучения биосинтеза клеточной стенки и взаимоотношений между ростом и ядерным делением клетки.

4.2. Культивирование растительных клеток

Идея возможности культивирования клеток вне организма была высказана еще в конце XIX века. Период с 1892 по 1902 гг. можно считать предысторией развития метода культуры клеток и тканей растений. В это время немецкие ученые Х. Фехтинг, К. Рехингер, Г. Габерландт предпринимали попытки выращивать изолированные из растений кусочки тканей, группы клеток, волоски. Не достигнув экспериментальных успехов, эти первые исследователи, однако высказали ряд идей, реализованных позднее.

В последующие 20 лет были получены первые результаты по культивированию тканей животных на питательных средах с добавлением сывороток. Но в растительном мире каких-либо значительных успехов достигнуть не удалось, не смотря на попытки создания оптимальных питательных сред, способных обеспечивать длительное существование и размножение клеток растений in vitro.

В 1922 году В. Роббинс и Котте независимо показали возможность культивирования на синтетических питательных средах клеток меристемы кончика корня томатов и кукурузы. Эти опыты положили начало применению метода культивирования изолированных клеток и органов растений.

В 30-60-е годы, благодаря работе большого числа ученых (Ф. Уайт, Р. Готре и другие), число видов растений, клетки и ткани которых выращивали in vitro, достигло значительного количества (более 150). Были описаны составы питательных сред, определены потребности культур в витаминах и стимуляторах роста, разработаны методы получения и выращивания больших масс клеточных суспензий, а также культивирования отдельной, выделенной из суспензии клетки. Ф. Стюард, работая с культурой изолированной флоэмы моркови, получил из нее в 1958 году целые растения. Значительный вклад в развитие культуры клеток и тканей растений внесли исследования Р. Г. Бутенко и ее сотрудников, использовавших эти методы для изучения физиологии растительных клеток и морфогенеза растений.

В последующие годы были предложены методы получения изолированных протопластов из растительных тканей, найдены условия культивирования, при которых они способны образовывать новую клеточную стенку, делиться и давать начало клеточным линиям. С использованием изолированных протопластов были разработаны методы гибридизации соматических клеток путем слияния протопластов с помощью ПЭГ (полиэтиленгликоля) и введения в них вирусных РНК, клеточных органелл, клеток бактерий. С помощью метода культуры меристем были получены безвирусные экономически важные растения с высоким коэффициентом размножения.

В настоящее время активно продолжается разработка методов глубинного культивирования клеток, методов электрослияния изолированных протопластов и т. д.

Использование методов получения сомаклональных вариантов, экспериментальных гаплоидов, скрининга биохимических мутантов привели к появлению более продуктивных и приспособленных к условиям культивирования клеточных штаммов, используемых для создания новых форм и сортов сельскохозяйственных, лекарственных, декоративных и других растений.

Возбудители туберкулеза - кислотоустойчивые микобактерии, открытые Р. Кохом в 1882 г. Известно несколько видов микобактерии туберкулеза: Mycobacterium tuberculosis (человеческий вид), Mycobacterium africanum (промежуточный вид) и Mycobacterium bovis (бычий вид), которые относятся к роду Mycobacterium, семей­ству Mycobacteriacae, порядку Actinomycetalis. Возбудителями ту­беркулеза у человека наиболее часто (в 92% случаев) являются микобактерии туберкулеза человеческого вида, микобактерии бычь­его и промежуточного видов вызывают развитие туберкулеза у человека соответственно в 5 и 3% случаев. В современной мик­робиологической классификации микобактерии птичьего вида (М. avium) относят к нетуберкулезным микобактериям комплекса avium - intracellular, которые могут быть возбудителями мико-бактериоза у человека и животных.

Микобактерии туберкулеза - тонкие, прямые или незначительно изогнутые палочки длиной 1-10 (чаще 1-4) мкм, шириной 0,2-0,6 мкм, гомогенные или зернистые со слегка закругленными концами (рис 1.1), Они неподвижны, не образуют эндоспор, конидий и капсул. Морфология и размеры бактериальных клеток значительно колеблются, что зависит от возраста клеток и особенно от условий существования и состава питательной среды. С помощью электрон­ной микроскопии выделены основные структурные элементы мико­бактерии туберкулеза: клеточная стенка, цитоплазматическая мем­брана и ее производное - мезосома, цитоплазма, ядерное вещест­во - нуклеотид.

Клеточная стенка ограничивает клетку снаружи, обеспечивая механическую и осмотическую защиту. Электронно-микроскопиче-ски в клеточной стенке выделяют три слоя толщиной по 10 нм, поверхностный - микрокапсула - состоит из полисахаридов и играет важную роль в жизнедеятельности микобактерии, в том числе обеспечивает их устойчивость к неблагоприятным воздейст­виям. В клеточной стенке находятся видоспецифические антигены. Вакцины, приготовленные из клеточных стенок туберкулезных ми­кобактерии, имеют разные вирулентность и иммуногенность. Наи­более выраженный иммунитет вызывают вакцины из клеточных стенок высоковирулентных микобатерий. Клеточные стенки вызы­вают в организме здоровых животных развитие повышенной чув­ствительности замедленного типа (ПЧЗТ), антителообразование. Од­нако их сильные сенсибилизирующие свойства и наличие в них токсического корд-фактора (фактора вирулентности) значительно осложняют гипериммунизацию этой фракцией микобактерии тубер-

Рис 11 Микобактерия туберкулеза Негативное контрастирование х 35 ООО

кулеза [Авербах М. М. и др., 1976; Романова Р. Ю., 1981]. Задача заключается в выделении из фракций клеточных стенок компонен­тов, обладающих высокой протективной активностью.

Согласно современным представлениям, в состав цитоплазмати-ческой мембраны, расположенной под клеточной стенкой, входят липопротеидные комплексы. С ней связаны различные ферментные системы, в частности окислительно-восстановительные. В цитоплаз-матической мембране осуществляются процессы, ответственные за

специфичность реакций микобактериальной клетки на окружающую среду.

Цитоплазматическая мембрана микобактерии туберкулеза пу­тем инвагинации в цитоплазму формирует внутрицитоплазмати-ческую мембранную систему, или мезосому. Мезосомы полифун­кциональны. С ними связана локализация многих ферментных систем, они участвуют в синтезе материала клеточной стенки, выполняют роль посредника между ядром и цитоплазмой. Отме­чено слабое развитие или отсутствие мезосом у авирулентных штаммов микобактерии туберкулеза и их L-форм [Кац Л. Н., Волк А. В., 1974]. Цитоплазма микобактерии туберкулеза состоит из гранул и вакуолей различной величины. Основная часть мелко­гранулярных включений представлена рибосомами, на которых синтезируется специфический белок.

Ядерная субстанция микобактерии туберкулеза определяет спе­цифические свойства клетки, важнейшими из которых являются синтез белка и передача наследственных признаков потомству. Ус­тановлено, что основным способом размножения этих бактерий яв­ляется деление материнских клеток на две дочерние.

Установлено, что носителем генетической информации бактерий являются не только хромосомы, но и в нехромосомные элементы - плазмиды. Основное различие между хромосомами и плазмидами заключается в их размерах. Хромосома во много раз крупнее плаз-миды и соответственно несет большое количество генетической ин­формации. Возможно взаимодействие плазмид с хромосомой. Плаз-миды благодаря малому размеру хорошо приспособлены к переносу из клетки в клетку. Исследования плазмид имеют не только тео­ретическое, но и практическое значение. Существует мнение, что гены устойчивости микобактерии туберкулеза к химиопрепаратам локализованы как на хромосоме, так и на плазмиде .

Описаны многочисленные морфологические варианты микобак­терии: гигантские формы с колбовидно утолщенными разветвлени­ями, нитевидные, мицелиеподобные и булавовидные, дифтероидные и актиномикотические формы. Микобактерии туберкулеза могут быть длиннее или короче, толще или тоньше обычных, гомогенны или зернисты. Иногда они представляют собой цепочки или отдель­ные скопления кокковидных зерен.

Явление изменчивости микобактерии туберкулеза было обна­ружено вскоре после их открытия. Уже в 1888 г. И. И. Мечников сообщил, что в культурах, кроме типичных палочек Коха, встре­чаются полиморфные формы этих микроорганизмов в виде корот­ких, соединенных попарно звеньев и гигантских образований с колбовидными разветвлениями. Первое сообщение о возможности существования у микобактерии туберкулеза фильтрующихся форм относится к 1910 г. (A. Fontes). При химиотерапии эксперимен­тального деструктивного туберкулеза, а также после ее прекра­щения в гомогенатах из стенки каверны, пропускаемых через бактериальные фильтры с размером пор 0,2 мкм, были обнаружены

очень мелкие, с упрощенной структурой формы возбудителя ту­беркулеза, названные ультрамелкими (рис. 1.2). Затем было по­казано, что эти формы путем многократных биологических пас­сажей способны реверсировать в классическую палочковидную фор­му [ХоменкоА. Г. и др., 1982, 1989]. Одним из видов изменчи­вости многих бактерий является образование L-форм. Доказана способность к образованию L-форм и у микобактерии туберкулеза [Дорожкова И. Р., 1974; Шмелев Н. А., ЗемсковаЗ. С, 1974]. При этом было обнаружено, что трансформация микобактерии в L-формы усиливается под влиянием противотуберкулезных препара­тов. В мокроте «абациллярных» больных с деструктивными фор­мами туберкулеза могут находиться L-формы микобактерии, спо­собные длительно пребывать в организме и в дальнейшем при соответствующих условиях реверсировать в палочковидный вариант [ХоменкоА. Г. и др., 1980]. Следовательно, абациллирование ка­верн таких больных еще не означает их стерилизации в отношении микобактерии туберкулеза.

Наряду с морфологической изменчивостью микобактериям ту­беркулеза свойственна широкая изменчивость и других признаков, в частности кислотоустойчивое™. Последняя проявляется способно­стью сохранять окраску даже при интенсивном обесцвечивании кис­лым спиртом и является характерной особенностью всех видов ми­кобактерии, обусловленной высоким содержанием в них миколовой кислоты и липидов. Частичная или полная утрата кислотоустойчи­вости ведет к образованию смешанной, состоящей из кислотоустой­чивых и некислотоустойчивых особей, или полностью некислото­устойчивой популяции.

Микобактерии туберкулеза весьма устойчивы к воздействию фак­торов окружающей среды. В естественных условиях при отсутствии солнечного света их жизнеспособность может сохраняться в течение нескольких месяцев, при рассеянном свете возбудители погибают через 1-IV2 мес. В уличной пыли микобактерии туберкулеза со­храняются до 10 дней, на страницах книг - до 3 мес, в воде - до 5 мес В то же время облученная солнечным светом культура микроорганизмов погибает в течение IV2 ч, а под воздействием ультрафиолетовых лучей - через 2-3 мин. При кипячении влажной мокроты микобактерии погибают через 5 мин, высушенной мокро­ты - через 25 мин. Соединения, выделяющие свободный активный хлор (3-5% растворы хлорамина, 10-20% растворы хлорной из­вести и др.), вызывают гибель микобактерии туберкулеза в течение 3-5 ч.

Микобактерии туберкулеза считаются аэробами, хотя имеются сведения, что некоторые их виды можно рассматривать как факуль­тативные анаэробы. Размножаются эти микобактерии очень мед­ленно (одно деление клетки происходит за 14-18 ч). Микроскопи­чески видимый рост микроколоний, культивируемых на жидких средах при температуре 37°С, выявляется на 5-7-е сутки, видимый рост колоний на плотных средах, культивируемых при той же температуре, - на 14-20-е сутки.

Для нормального развития микобактерии туберкулеза требуются специальные питательные среды, содержащие углерод, азот, кисло­род, водород, фосфор, магний, калий, натрий, железо, хлор и серу. Эти микроорганизмы нуждаются и в некоторых факторах роста, к числу которых относятся соединения, родственные витаминам груп­пы В, биотин, никотин, рибофлавин и др. Все эти факторы входят в состав применяемых для культивирования микобактерии тубер­кулеза специальных питательных сред, из них выделяют среды, содержащие глицерин, белковые (яичные, сывороточные, картофель­ные) и безбелковые (синтетические) среды, в состав которых входят минеральные соли. По консистенции различают плотные, полужид­кие и жидкие среды. Наиболее широко применяются плотные яичные среды Левенштейна-Йенсена, Огавы, Петраньяни и Гельбера, раз­нообразные агаровые среды Миддбрука, синтетические и полусин­тетические среды Сотона, Дюбо, Проскауэра-Гека, Шулы, Школь-никовой и др.

На жидких питательных средах микробактерии туберкулеза рас­тут в виде сухой морщинистой пленки (Р-форма) кремового цвета, поднимающейся на стенки сосуда, среда при этом остается прозрач­ной. При внутриклеточном развитии микобактерии, а также при культивировании их на жидких средах хорошо выделяется харак­терный корд-фактор (трегалоза-6,6-димиколат). Он обнаруживается на поверхности клеток многих микобактерии и, по мнению неко­торых исследователей, имеет отношение к их вирулентности, спо­собствуя сближению микробных клеток и росту их в виде серпан-тинообразных кос.

На плотных средах микобактерии туберкулеза растут в виде светло-кремового морщинистого или суховатого чешуйчатого налета, образуют колонии с неровными краями, приподнятые в центре, по мере роста они приобретают бородавчатый вид, напоминающий цветную капусту.

Под влиянием антибактериальных веществ микобактерии тубер­кулеза могут приобретать лекарственную устойчивость. Культуры таких микобактерии не всегда типичны, они могут быть влажными, мягкими (S-вариант), иногда содержать отдельные гладкие или пиг­ментированные колонии.

1.2. ПАТОГЕНЕЗ

Микобактерии туберкулеза могут попадать в организм различ­ными путями: аэрогенно, энтерально (через желудочно-кишечный тракт), через поврежденную кожу и слизистые оболочки, через плаценту при развитии плода. Однако основным путем заражения является аэрогенный.

Определенную защитную роль при аэрогенном заражении иг­рает система мукоциллиарного клиренса, позволяющая частично вывести попавшие в бронхи частицы пыли, капли слизи, слюны и мокроты, содержащие микроорганизмы. При энтеральном зара­жении определенное значение может иметь всасывающая функция кишечника.

Локальные изменения в месте внедрения микобактерии обуслов­лены прежде всего реакцией полинуклеарных клеток, которая сме­няется более совершенной формой защитной реакции с участием макрофагов, осуществляющих фагоцитоз и разрушение микобакте­рии. Процесс взаимодействия легочных макрофагов с различными микроорганизмами, в том числе микобактериями туберкулеза, сло­жен и до конца не изучен. Результат взаимодействия макрофагов и микобактерии определяется состоянием иммунитета, уровнем ПЧЗТ, развивающейся в процессе туберкулезной инфекции, а также рядом других факторов, в том числе обусловливающих перевари­вающую способность макрофагов.

Фагоцитоз состоит из трех фаз: фазы соприкосновения, когда макрофаги с помощью рецепторов на клеточной мембране фикси­руют микобактерии; фазы проникновения микобактерии внутрь мак­рофага путем инвагинации стенки макрофага и «окутывания» ми­кобактерии; фазы переваривания, когда лизосомы макрофагов сли­ваются с фа госомами, содержащими микобактерии. Выделяющиеся в фаголизосомы ферменты разрушают микобактерии. В процессе фагоцитоза важная роль принадлежит также механизмам перекис-ного окисления .

Микобактерии туберкулеза, как и некоторые другие микроорга­низмы, попадая в макрофаги, могут сохраняться и даже продолжать размножение. В тех случаях, когда процесс переваривания мико­бактерий блокируется, происходят разрушение макрофагов и выход микобактерии из поглотивших их клеток.

Макрофаги, фагоцитировавшие микобактерии и осуществляющие их переваривание, выделяют во внеклеточное пространство фраг­менты разрушенных микобактерии, протеолитические ферменты, медиаторы (в том числе интерлейкин-1), которые активируют Т-лимфоциты, в частности Т-хелперы. Активированные Т-хелперы выделяют медиаторы - лимфокины (в том числе интерлейкин-2), под влиянием которых происходит миграция новых макрофагов к месту локализации микобактерии. Одновременно подавляется синтез фактора угнетения миграции, возрастает ферментативная активность макрофагов под влиянием фактора активации макрофагов. Активи­рованные лимфоциты выделяют также кожно-реактивный фактор, который обусловливает воспалительную реакцию, повышение сосу­дистой проницаемости. С этим фактором связывают подавление ПЧЗТ и положительной туберкулиновой реакции [Медуницын Н. В. и др., 1980]. Кроме Т-хелперов, на состояние иммунитета значительно влияют Т-супрессоры и суп рессорные моноциты, которые угнетают иммунный ответ.

Помимо Т-лимфоцитов и макрофагов, важная роль в патогенезе туберкулезного процесса принадлежит веществам, освобождающимся при разрушении микобактерии. Эти вещества (фракции) подробно изучены . Доказано, что корд-фактор (фактор вирулентности микобактерии туберкулеза, обуслов­ливающий их рост на плотной питательной среде в виде «кос»), провоцирует острый воспалительный процесс, а сульфатиды повы­шают токсичность корд-фактора и, главное, подавляют образование фаголизосом в макрофагах, что предохраняет внутриклеточно рас­положенные микобактерии от разрушения.

При интенсивном размножении микобактерии в организме че­ловека вследствие малоэффективного фагоцитоза выделяется боль­шое число токсичных веществ, индуцируется резко выраженная ПЧЗТ, которая способствует появлению экссудативного компонента воспаления с развитием казеозного некроза и его размножения. В этот период увеличивается число Т-супрессоров, снижается число Т-хелперов, что приводит к угнетению ПЧЗТ. Это обусловливает прогрессирование туберкулезного процесса.

При сравнительно небольшой бактериальной популяции в усло­виях ПЧЗТ и эффективного фагоцитоза отмечается образование туберкулезных гранулем. Такая гранулема развивается в результате реакций ПЧЗТ [Авербах М. М. и др., 1974]. Скопление мононук-леаров вокруг нейтрофилов, содержащих антиген, и их последующая трансформация происходят под регулирующим влиянием лимфоки-нов, вырабатываемых Т-лимфоцитами (в частности, Т-хелперами) и являющихся медиаторами гранулематозной реакции. Поскольку величина бактериальной популяции, а также характер течения им­мунологических ракций на разных этапах туберкулезной инфекции меняются, морфологические реакции у заболевших туберкулезом характеризуются большим разнообразием.

В зависимости от места внедрения микобактерии туберкулеза воспалительный очаг, или первичный аффект, может образоваться в легких, ротовой полости, миндалинах, кишечнике и др. В ответ на образование первичного аффекта развивается специфический процесс в регионарных лимфатических узлах и формируется пер­вичный туберкулезный комплекс. Установлено, что первичный ту­беркулез, развивающийся в результате первого контакта макроор­ганизма с возбудителем, может проявляться не только в виде пер­вичного туберкулезного комплекса, как это считалось ранее. В результате первичного заражения возможно развитие туберкулеза внутригрудных лимфатических узлов, плеврита, туберкулемы, оча­гового процесса.

Первичный туберкулез в результате «свежего» заражения раз­вивается лишь у 7-10% инфицированных лиц, остальные переносят первичную туберкулезную инфекцию без клинических проявлений. Наступившее заражение проявляется лишь в изменении туберку­линовых реакций.

Еще В. И. Пузик (1946), А. И. Каграманов (1954) и др. устано­вили, что формированию первичного комплекса нередко предшест­вует период «латентного микробизма», при котором микобактерии туберкулеза, попадая в организм, какое-то время находятся в нем, не вызывая воспалительной реакции. При этом микобактерии чаще обнаруживаются в лимфатических узлах, особенно внутригрудных. В этих случаях локальные изменения в легких или других органах в виде очагов первичного туберкулеза возникают в поздний период первичной инфекции и не в месте проникновения микобактерии в организме, а в участках, наиболее благоприятных для развития туберкулезного воспаления.

Отсутствие клинико-морфологических проявлений первичной ту­беркулезной инфекции может быть объяснено высоким уровнем естественной резистентности к туберкулезу, а также может быть следствием приобретенного в результате вакцинации БЦЖ имму­нитета.

При наличии локальных проявлений первичный туберкулез мо­жет протекать с развитием распространенного процесса по ослож­ненному типу или, что в настоящее время наблюдается значительно чаще, по неосложненному типу с ограниченной воспалительной реакцией.

Как правило, первичный туберкулез заживает с небольшими остаточными изменениями, что, по-видимому, связано с высокой естественной резистентностью и проведением массовой вакцинации и ревакцинации БЦЖ.

Сохраняющиеся в остаточных очагах микобактерии или их из­мененные формы должны рассматриваться как туберкулезный ан­тиген, наличие которого необходимо для поддержания сенсибили­зированными лимфоцитами специфического иммунитета. Опреде­ленная, правда, еще малоизученная роль в поддержании противо­туберкулезного иммунитета принадлежит В-клеточному иммунитету и генетическим механизмам.

Получены доказательства роли наследственности в течение ту» беркулезного процесса. Генетические факторы влияют на ответ им­мунной системы при размножении микобактерии туберкулеза в организме человека и, в частности, определяют взаимодействие между макрофагами, Т- и В-лимфоцитами, продукцию лимфокинов, монокинов и других цитокинов Т- и В-лимфоцитами и макрофагами, комплексный иммунный ответ, от которого зависит чувствительность или устойчивость к развитию туберкулеза. Выявлено сцепление HLA-генотипов с заболеванием туберкулезом в семьях, в которых больны туберкулезом родители и дети.

Накопление некоторых специфичных типов HLA в группах боль­ных с неблагоприятным течением болезни свидетельствует об ассо­циации определенных генов HLA-комплекса (преимущественно ло-кусов В и DR с предрасположенностью к туберкулезу) [Хоменко А. Г., 1985].

Период первичного инфицирования может завершиться излече­нием с минимальными (малыми) или довольно выраженными оста­точными изменениями. У таких людей развивается приобретенный иммунитет. Сохранение в остаточных очагах персистирующих ми­кобактерии не только поддерживает приобретенный иммунитет, но и одновременно создает риск эндогенной реактивации туберкулез­ного процесса вследствие реверсии измененных форм возбудителя туберкулеза в бактериальную форму и размножения микобактери-альной популяции.

Реверсия персистирующих форм микобактерии в размножающие­ся происходит в условиях эндогенной реактивации туберкулезных очагов и других остаточных изменений. Механизм эндогенной ре­активации, а также развитие туберкулезного процесса изучены не­достаточно.

В основе реактивации лежат прогрессирующее размножение бак­териальной популяции и увеличение количества микобактерии [Хо­менко А. Г., 1986]. Однако до настоящего времени остается неиз­вестным, что именно и какие условия способствуют реверсии воз­будителя туберкулеза, находившегося в персистирующем состоянии. Установлено, что реактивация туберкулеза и развитие различных его клинических форм чаще наблюдаются у лиц с остаточными изменениями при наличии факторов, снижающих иммунитет.

Возможен и другой путь развития вторичного туберкулеза - экзогенный, связанный с новым (повторным) заражением микобак-териями туберкулеза (суперинфекция). Но и при экзогенном пути развития вторичного туберкулеза недостаточно проникновения ми­кобактерии в уже инфицированный организм даже при массивной повторной суперинфекции. Необходима совокупность ряда условий и факторов риска, снижающих иммунитет. Вторичный туберкулез характеризуется большим разнообразием клинических форм. Основ­ные разновидности патоморфологических изменений в легких и других органах характеризуются: а) очагами с преимущественно продуктивной тканевой реакцией, благоприятным, хроническим те­чением и тенденцией к заживлению; б) инфильтративно-пневмо­ническими изменениями с преимущественно экссудативной тканевой реакцией и тенденцией к развитию казеозного некроза или расса­сыванию возникшей воспалительной реакции; в) туберкулезной ка­верной - результатом разложения образовавшихся казеозных масс и их отторжения через дренажные бронхи с образованием полости распада.

Различные сочетания основных патоморфологических измене­ний туберкулеза создают предпосылки для чрезвычайно большого разнообразия туберкулезных изменений, особенно при хроническом течении болезни со сменой периодов обострения и затихания процесса. К этому нужно добавить, что из сформировавшихся зон поражения микобактерии могут распространяться с током лимфы или крови в непораженные участки и различные органы. Исход болезни зависит от ее течения - прогрессирующего или регрес­сирующего, эффективности лечения и обратимости изменений, сформировавшихся в процессе болезни. Доказано, что в условиях голодания и даже при недостаточном питании, особенно когда в рационе недостаточное количество белков и витаминов, нередко возникает реактивация туберкулеза. К факторам, способствующим реактивации, относятся и различные заболевания: сахарный диа­бет, лимфогранулематоз, силикоз, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, состояние после резекции желудка и двенадцатиперстной кишки, хронические воспалительные заболе­вания легких, психические заболевания, протекающие с депрес­сивным синдромом, алкоголизм, стрессовые ситуации, СПИД, дли­тельный прием глюкокортикоидов, цитостатиков и иммунодепрес-сантов. Течение и исходы туберкулеза следует рассматривать толь­ко в условиях проводящейся специфической химиотерапии, которая применяется всем больным активным туберкулезом. В процессе химиотерапии отмечается уменьшение популяции микобактерии вследствие разрушающего влияния химиопрепаратов на возбуди­телей туберкулеза. Вследствие этого резко снижается число ми­кобактерии, создаются более благоприятные условия для репара-тивных процессов и саногенеза. Вместе с тем при применении самых эффективных комбинаций современных химиопрепаратов отмечается разное течение туберкулезного процесса: регрессия с последующим заживлением, стабилизация процесса без клиниче­ского излечения с сохранением каверны, туберкулемы или других изменений, временное затихание воспалительного процесса с по­следующим возникновением обострения, развитием хронического процесса или прогрессированием заболевания.

Таким образом, уменьшение популяции микобактерии под вли­янием специфических химиопрепаратов далеко не всегда приводит к излечению. Прекращение туберкулезного процесса и последую­щее излечение зависят не только от уменьшения популяции ми­кобактерии, но и от способности репаративных процессов орга­низма обеспечить регрессию туберкулезного процесса и его пре­кращение.

1.3. ПАТОЛОГИЧЕСКАЯ АНАТОМИЯ

1.3.1. Туберкулезное воспаление

Патоморфологические изменения в органах и тканях при тубер­кулезе многообразны и зависят от формы, стадии, локализации и распространенности патологического процесса.

Общими для большинства форм туберкулеза являются специфи­ческие изменения в сочетании с неспецифическими или параспе-цифическими реакциями. К специфическим изменениям относится туберкулезное воспаление, течение которого сопровождается фор­мированием туберкулезного бугорка, или гранулемы, и более круп­ного очага. Неспецифическими изменениями являются различные реакции, обусловливающие так называемые маски туберкулеза.

Морфология туберкулезного воспаления зависит от реактивности организма и вирулентности возбудителя. В туберкулезном очаге могут преобладать явления экссудации, некроза или пролиферации, и очаг в соответствии с этим может быть преимущественно экссу-дативным, некротическим или продуктивным. В развитии туберку­лезного воспаления большая роль принадлежит иммунологическим процессам. В участке воспаления сначала развивается реакция, не имеющая признаков, типичных для туберкулеза. В ней в разной степени выражены явления альтерации и экссудации. На первое место выступают нарушения в микроциркуляторном русле. Они за­трагивают тонкую структуру стенки альвеолы, и механизмы их раз­вития можно проследить на ультраструктурном уровне [Ерохин В. В., 1987]. На ранних стадиях воспаления изменения в субмикроскопиче­ской организации составных элементов стенки альвеолы связаны с повышением капиллярной проницаемости, развитием внутриклеточ­ного интерстициального и внутриальвеолярного отека с вымыванием отечной жидкостью альвеолярного сурфактанта.

В дальнейшем дистрофические изменения в альвеолярной ткани нарастают, однако наряду с ними возникают и компенсаторно-вос­становительные процессы, направленные на развитие внутриклеточ­ной организации, повышение функциональной активности сохраня­ющихся клеток межальвеолярной перегородки. В следующей фазе воспаления - пролиферативной - появляются специфические для туберкулеза элементы (эпителиоидные и гигантские клетки Пиро-гова-Лангханса), формируются участки своеобразного гомогенного казеозного (творожистого) некроза в центре туберкулезного очага (рис. 1.3). На основании данных электронной микроскопии и авто­радиографии о динамике клеточной трансформации установлена генетическая связь клеток гранулемы по линии моноцит - гигант­ская клетка [Серов В. В., Шехтер А. Б., 1981; Ерохин В. В., 1978, 1987; Danneberg А. М., 1982; SpectorW. G., 1982]. Макрофаги ак­тивно синтезируют и накапливают лизосомные ферменты, выпол­няют фагоцитарную функцию. Поглощенный материал, среди ко­торого находятся и микобактерии туберкулеза, находится и пере­варивается в фагосомах и фаголизосомах. Эпителиоидные клетки

образуются из мононуклеаров и макрофагов, скапливающихся в очаге туберкулезного воспаления в первые фазы воспалительной реакции. Они имеют крупное ядро овальной формы, обычно с 1-2 ядрышками Цитоплазма этих клеток содержит митохондрии, гра­нулы, аппарат Гольджи, хорошо развитую систему канальцев и цистерны зернистой и незернистой цитоплазматической сети, еди­ничные фагосомы небольших размеров. Число митохондрий, эле­ментов ретикулума, лизосомных включений широко варьирует и определяется функциональным состоянием клетки.

Гигантские клетки Пирогова-Лангханса могут образовываться из эпителиоидных клеток или макрофагов при их пролиферации, а также в результате слияния эпителиоидных клеток. Цитоплазма гигантских клеток содержит большое число ядер, обычно распола­гающихся в виде кольца или подковы по периферии клеток, мно­жество митохондрий, лизосом, элементов зернистой цитоплазмати­ческой сети, хорошо развитый комплекс Гольджи. Гигантские клетки способны к фагоцитозу, в их цитоплазме обнаруживаются различные остаточные включения Они характеризуются высокой активностью гидролитических и дыхательных ферментов.

Помимо эпителиоидных и гигантских клеток, туберкулезная гра­нуляционная ткань обычно содержит значительное число лимфоид-ных и плазматических клеток, а также нейтрофильный лейкоцитов. В периферических отделах грануляционного слоя выявляются фиб­робласты. Вокруг очага воспаления нередко имеется перифокальная зона неспецифической воспалительной реакции. При прогрессиро-вании процесса наблюдаются увеличение казеозного некроза, уси­ление инфильтрации грануляционной ткани мононуклеарами и лим-фоидными клетками, а также нейтрофилами, расширение зоны пе-рифокального воспаления. Специфический процесс распространяется контактным и лимфатическим путем.

При заживлении туберкулезного очага массы казеозного некроза уплотняются, в последних отмечается отложение мелких зерен солей кальция. В грануляционной ткани увеличивается количество фиб-робластов и фибрилл коллагена, объединяющихся в коллагеновые волокна, которые вокруг туберкулезного очага формируют соеди­нительнотканную капсулу. В последующем специфическая грану­ляционная ткань все больше замещается фиброзной тканью. Число клеточных элементов между коллагеновыми волокнами уменьша­ется, иногда коллагеновые волокна подвергаются гиалинозу. В по­добных очагах и посттуберкулезных очагах обнаружены измененные формы микобактерии туберкулеза, в частности L-формы, что по­зволяет лучше понять роль старых туберкулезных очагов в пато­генезе вторичных форм туберкулеза [Пузик В. И., Земскова 3. С, Дорожкова И. Р., 1981, 1984]. В основе реактивации туберкулеза и формирования различных форм вторичного туберкулеза легких ле­жат реверсия и размножение бактериальной популяции на фоне развития недостаточности специфической и неспецифической защи­ты микроорганизма.

Полностью или частично утратившие клеточную стенку или предшественников ее биосинтеза, растущие в виде характерных мелких колоний. Впервые открыты в 1935 г. Клинебергер (E. Klieneberger) в культуре Streptobacillus moniliformis, выделенной К. Левадити с сотр. в 1932 г. из суставной жидкости больного эпидемической суставной эритемой. Streptobacillus moniliformis - грамотрицательная, гемоглобинофильная палочка с четковидными вздутиями на концах, хорошо растущая на кровяном (10-20%) агаре и свернутой сыворотке.

При изучении экспериментальной инфекции у крыс Клинебергер выделила несколько штаммов, содержащих, помимо типичных бактериальных форм, полиморфные микроорганизмы, весьма сходные по виду колоний и морфологии с плевропневмониеподобными организмами - pleuropneumoniae like organism (P PL О). Эти микроорганизмы были названы в честь Ин-та им. Листера - L-формой.

В течение многих лет Клинебергер рассматривала L-формы как представителей PPLO-симбионтов бактерий Streptobacillus moniliformis. Доказательством симбиотического существования двух разных микроорганизмов являлось отсутствие реверсии бактерий из L-форм на протяжении 13 лет (350 пересевов).

Разнообразные эксперименты амер. исследователя Дайнеса (L. Dienes) и др. доказали ошибочность концепции Клинебергер. Было показано, что L-формы Streptobacillus moniliformis, Fusiformis necrophorus и других бактерий способны реверсировать в исходный вид бактерий. Образование L-форм бактерий описано под названиями «L-трансформация», «L-конверсия», «индукция L-форм».

В. Д. Тимаковым и Г. Я. Каган были получены L-формы многих видов бактерий, изучены их биол, свойства и роль в патологии (ревмокардит, септический эндокардит, менингоэнцефалит, хрон, гонорея и др.).

Превращение в L-форму - свойство, по всей вероятности, присущее всем бактериям. Препараты, оказывающие L-трансформирующее действие, либо блокируют определенные звенья биосинтеза клеточных стенок, преимущественно пептидогликана (муреина), либо их разрушают. К препаратам, индуцирующим L-формы бактерий, относят: 1) антибиотики соответствующего спектра действия, напр, пенициллин, циклосерин, лизостафин и др.; 2) муролитические ферменты - лизоцим, эндоацетилгексозаминидазу фагоассоциированного лизина стрептококка группы С и др.; 3) нек-рые аминокислоты (глицин и др.).

Индукция L-форм бактерий зависит от условий и сред культивирования: необходимо создание физ.-хим. окружения, способствующего стабилизации осмотически хрупкой мембраны бактерий и предохраняющего L-формы от гибели.

Состав среды и условия культивирования варьируют в зависимости от вида бактерий, обязательны полутвердая и полужидкая концентрация агарового геля, присутствие нормальной лошадиной сыворотки и подбор осмотической концентрации солей, способствующих сохранению целостности цитоплазматической мембраны L-форм бактерий.

Различают нестабильные и стабильные L-формы бактерий. Нестабильные формы сохраняют нек-рые элементы клеточной стенки или ее предшественников и при пассажах на средах без L-индуцирующего агента реверсируют в исходный вид бактерий. Стабильные формы полностью утрачивают компоненты клеточной стенки и не способны ее восстановить, поэтому они не реверсируют в исходный вид бактерий, даже при многократном пассировании на средах без индуцирующего агента, а также на средах, содержащих сукцинат натрия или желатину, способствующих реверсии бактерий из L-форм.

L-формы бактерий растут в виде двух типов колоний - А. и В. Колонии типа А чаще присущи стабильным L-формам бактерий, они очень мелкие (50-100 мкм), врастают в агар, хорошо растут группами, единичные колонии часто не дают роста. Минимальные репродуцирующиеся элементы колоний типа А, полностью лишенные клеточной стенки, не имеют фаговосприимчивых рецепторов. Колонии типа В чаще присущи нестабильным L-формам бактерий, они более крупные, размером 0,5-2 мм, с нежным кружевным краем и врастающим в среду центром. В колониях преобладают шаровидные тела разной оптической плотности; субмикроскопических элементов в них меньше, чем в колониях типа А. Они сохраняют нек-рые элементы клеточной стенки, фаговосприимчивые рецепторы и могут агглютинироваться сывороткой исходного вида.

Дифференциация колоний на типы А и В условна, так же как и явление стабилизации L-форм. В культурах стабильных L-форм бактерий могут содержаться, колонии типа В, а в культурах нестабильных L-форм- колонии типа А.

В составе колоний L-форм бактерий содержатся: 1) сферические тела разной оптической плотности и размеров; 2) элементарные тельца или гранулы, располагающиеся группами, а также интрацеллюлярно в более крупных сферических образованиях или вакуолях; 3) плохо контурированные, бесформенные, все время растущие тела; 4) извитые формы; 5) крупные тела с включениями в виде вакуолей. L-формы бактерий отличаются полиморфизмом (рис. 1, 1-6) и вместе с тем принципиально одинаковы у разных видов бактерий/ что не позволяет дифференцировать их по морфол, признаку.

Наряду с утратой клеточной стенки у L-форм бактерий утрачиваются мезосомы, что приводит к непосредственному прикреплению цитоплазматической мембраны к нуклеоиду; восстановления мезосом в процессе реверсии не наблюдается.

Отсутствие клеточной стенки обусловливает дезорганизацию деления и множественность морфол, проявлений при воспроизведении L-форм бактерий. Размножаются L-формы бактерий делением, почкованием или дезинтеграцией клетки на мелкие гранулы.

Физиол., антигенные и патогенные особенности этих форм детерминированы структурой их цитоплазматической мембраны, и, возможно, цитоплазмы.

L-формы бактерий образуются не только in vitro, но и in vivo, они могут сохраняться в организме и реверсировать в исходную бактериальную форму.

На рисунке 2 приведены результаты получения L-форм S. typhi in vivo под влиянием пенициллина. Бактерии и антибиотик вводили одновременно интраперитонеально мышам. При введении 100 ЕД пенициллина на 1 г веса образовывались нестабильные L-формы, реверсирующие в исходные бактериальные формы через 24-48 час., к-рые вызывали гибель животных. При введении 2000 ЕД пенициллина на 1 г веса в течение 24-48 час. образовывались стабильные L-формы, подвергавшиеся фагоцитозу; гибели животных в ближайшие 5 сут. не наблюдалось. Аналогичные данные получены при изучении индукции in vivo L-форм других бактерий.

Разработана оригинальная схема выделения L-форм из патол, материала, к-рая позволила выделить и идентифицировать L-формы бактерий из цереброспинальной жидкости больных гнойным менингитом и ревмокардитом.

На рисунке 3 представлены микрофотографии L-форм, выделенных из крови больного ревмокардитом, и их ревертантов, образовавшихся в результате реверсии в стрептококки, впоследствии идентифицированные как Streptococcus hemolyticus группы А.

Антитела к стабильным L-формам Streptococcus hemolyticus обнаружены у 87,9% больных ревматизмом, у 77% больных инфекционно-аллергическим миокардитом и всего лишь у 11% здоровых людей (В. Д. Тимаков, Г. Я. Каган, 1973). L-формы разных видов бактерий обнаруживаются при хрон, бактериурии, пиелонефритах, абактериальных формах туберкулеза, ревмокардите и др.

Патогенность L-форм бактерий доказана экспериментально, известны хрон, артриты, вызванные интраартикулярным введением L-форм Streptococcus hemolyticus, ангина обезьян, осложненная интерстициальным миокардитом, индуцированная внутривенным введением L-форм Streptococcus hemolyticus, пиелонефриты крыс и кроликов, обусловленные L-формами бактерий рода Proteus и Streptococcus faecalis, менингоэнцефалит кроликов, связанный с L-формами менингококка, и листериоз овец и кроликов, вызванный введением L-форм Listeria monocytogenes. Патол, процессы, обусловленные L-формами бактерий, отличаются постепенным развитием патол. явлений, пролонгированным течением и персистенцией возбудителя в L-форме, поддерживающей переход заболевания в хрон, форму. Персистенция L-форм бактерий установлена экспериментально на L-формах Mycobacterium tuberculosis и Streptococcus hemolyticus.

При однократном внутрибрюшинном заражении белых мышей стабильными L-формами Streptococcus hemolyticus и последующем наблюдении в течение года антиген L-форм сохраняется во всех внутренних органах. На рисунке 4, 1 приведен пример локализации L-форм Streptococcus hemolyticus в селезенке через 3 нед. после инфицирования, на рисунке 4, 2 - через 27 нед. Длительная персистенция L-форм в организме сопровождается нарастанием повреждающего эффекта; развитием интерстициального миокардита и тяжелого гломерулонефрита.

Образование L-форм бактерий in vivo, их связь со многими хронически протекающими процессами, возможность реверсии бактериальных форм с восстановлением их вирулентности и возникновение вследствие этого не поддающихся эффективной терапии рецидивов поставили перед мед. микробиологией проблему изыскания способов борьбы с вариантами микроорганизмов, утратившими клеточную стенку (сферопласты, протопласты, L-формы). Поиски ведутся с двух диаметрально противоположных позиций: 1) предотвращение возможности индукции L-форм in vivo (путь, трудно контролируемый); 2) использование средств, индуцирующих образование L-форм, с последующим применением других препаратов, недейственных в отношении интактных клеток, но проникающих внутриклеточно лишь в L-формы бактерий и разрушающих их. Этот путь наиболее перспективный. Имеются данные об эффективности комбинаций пенициллина и канамицина, используемых для терапии пиелонефритов. Пенициллин индуцирует образование L-форм бактерий, к-рые разрушаются внутриклеточным проникновением канамицина, не действующего на интактные бактерии.

Библиогр.: Пешков М. А. Цитология бактерий, с. 151, М.-Л., 1955; Тимаков В.Д, и Каган Г. Я. L-формы бактерий и семейство mycoplasmataceae в патологии, М., 1973, библиогр.; они же, L-формы бактерий, семейство mycoplasmataceae и проблема микробного персистиро-вания, Журн, микр., эпид, и иммун., № 4, с. 3, 1977, библиогр.; Di enes L. The morphology of the Li of Klieneberger and its relationship to streptobacillus monoli-formis, J. Bact., v. 54, p. 231, 1947; D i e-nes L. a. Weinberger H. The L-forms of bacteria, Bact. Rev., v. 15, p. 245, 1951; Klieneberger E. The natural occurrence of pleuropneumonialike organisms, its apparent symbiosis with streptobacillus moniliformis and the other bacteria, J. Path. Bact., v. 40, p. 93, 1935; K li eneb erger-N obel E. Pleuropneumonia-like organisms (PPLO) mycoplasmataceae, L.- N. Y., 1962; Microbial protoplasts, spheroplasts and L-forms, ed. by L. B. Guze, Baltimore, 1968.

В. Д. Тимаков, Г. Я. Каган.