Se utilizan métodos para cuantificar los aminoácidos. Reacciones cualitativas a aminoácidos, péptidos, proteínas. Métodos para determinar aminoácidos.

Métodos para determinar aminoácidos.

Los aminoácidos son biológicamente sustancias activas, juegan un papel importante en la vida del cuerpo humano, se utilizan ampliamente como medicamentos. Algunos de ellos son esenciales y entran al organismo con los alimentos. Actualmente, existen varios métodos para la determinación cuantitativa de aminoácidos en materiales vegetales medicinales, incluidos medicamentos y fluidos biológicos, en productos alimenticios.

De la variedad de métodos para la determinación cuantitativa de aminoácidos en diversos objetos, se pueden distinguir cuatro grupos principales: métodos de análisis cromatográficos, espectrofotométricos, titrimétricos y electroquímicos.

Métodos cromatográficos

En las últimas décadas, se han logrado avances significativos en el campo de la cromatografía gas-líquido de aminoácidos. Se ha propuesto un método que utiliza columnas microempaquetadas, que permite relativamente poco tiempo separar casi por completo 17 α-aminoácidos biológicamente importantes.

Se ha desarrollado un método para la determinación de aminoácidos mediante cromatografía gas-líquido en muestras de suero, plasma, orina y líquido cefalorraquídeo, basado en la preparación de éteres de 2,3,4,5,6-pentafluorobenzoil-isobutilo seguida de separación en una columna de polidimetilsiloxano en modo de programación de temperatura desde 140°C hasta 250°C con detector de ionización de llama. El tiempo de separación cromatográfica es de 28 minutos. Como resultado de la investigación se separaron 27 aminoácidos.

A pesar de la variedad de métodos de cromatografía líquida de alta resolución para el análisis de aminoácidos, el más rápido y accesible es la versión de fase inversa con detección espectrofotométrica. Para una separación y detección exitosas, los aminoácidos se convierten en derivados hidrofóbicos y absorbentes de luz, es decir, se lleva a cabo una derivatización previa a la columna. Como reactivos de derivatización se utilizan aldehído ortoftálico, naftaleno-2,3-dicarboxialdehído y cloroformiato de 9-fluorenilmetilo.

Se ha desarrollado un método para la determinación cuantitativa de L-cistina, ácido L-glutámico y glicina en el fármaco "Eltacin", que tiene actividad antioxidante en combinación con un efecto antianginoso. El ácido glutámico y la glicina se determinaron mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa después de la derivatización previa a la columna con el reactivo ortoftalicdehído/N-acetil-L-cisteína. Según los autores, la derivatización de la cisteína es difícil debido a la inestabilidad del propio aminoácido y de los derivados resultantes. Por tanto, el análisis de cisteína se realizó mediante titulación bromatométrica. Se encontró que la presencia de cantidades significativas de cisteína en la muestra no interfiere con la determinación de los productos de derivatización de glicina y ácido glutámico con el reactivo aldehído ortoftálico/N-acetil-L-cisteína. El método se caracteriza por una alta reproducibilidad y precisión de determinación.

Se consideró la posibilidad de utilizar 4,7-fenantrolina-5,6-diona (fanquinona) como reactivo de marcado fluorogénico para la formación previa a la columna de sus derivados con el fin de separar y analizar cuantitativamente aminoácidos mediante cromatografía líquida de alta resolución. investigado. Al no tener fluorescencia intrínseca, la fanquinona reacciona con los grupos amino de los aminoácidos (a 68 °C durante 160 minutos), formando iminoquinoles, cuya fluorescencia se mide a una longitud de onda de 460 nm. Los derivados aislados se identificaron mediante espectros de Tm, IR, masa y PMR. La cromatografía líquida de alta resolución se realizó en un cromatógrafo con detector fluorescente y una columna con elución en gradiente con mezclas: solución de trietilamina - tampón fosfato (pH 3) - metanol. Se utilizó quinidina como patrón interno. este método es bastante prometedor en grandes laboratorios y puede proponerse para el análisis de aminoácidos en formas farmacéuticas terminadas.

Se ha desarrollado una técnica de cromatografía líquida de alta resolución con biosensor potenciométrico para la determinación cuantitativa de lisina. El biosensor se construye uniendo una membrana que contiene lisina oxidasa a un electrodo NH4+ selectivo de iones. Los iones de amonio generados durante la degradación enzimática de la lisina se detectan potenciométricamente. Se ha desarrollado un método cromatodensitométrico rápido para el análisis de triptófano en líquidos de cultivo. La cromatografía en capa fina se llevó a cabo en placas Sorbfil. La cromatografía se llevó a cabo en el sistema propanol-2 - solución de hidróxido de amonio al 25% (7:3) durante 25 minutos. Los cromatogramas se secaron a temperatura ambiente y se mantuvieron a 120°C durante 15 min. Para detectar manchas en los cromatogramas se utilizó un reactivo específico: 4-dimetilaminobenzaldehído, selectivo para el anillo indol de triptófano, en forma de una solución de etanol al 0,5% con la adición de ácido sulfúrico concentrado al 5%. Después de revelar los cromatogramas por inmersión en una cubeta de teflón con una solución recién preparada de 4-dimetilaminobenzaldehído, se mantuvieron durante 5-7 minutos a una temperatura de 110°C. El escaneo de manchas de triptófano se llevó a cabo a una longitud de onda de 625 nm en un videodensitómetro de computadora. El método desarrollado, a pesar de su alta precisión de determinación y productividad, es específico para triptófano.

Para el análisis de β-aminoácidos en fluidos biológicos, medicamentos y productos alimenticios, se utilizan ampliamente los métodos de electroforesis capilar, basados ​​​​en la separación de los componentes de una mezcla compleja en un capilar de cuarzo bajo la influencia de un campo eléctrico aplicado. Dado que los aminoácidos son de naturaleza zwitteriónica, se pueden separar utilizando soluciones tampón de electrolitos con un valor de pH apropiado; la mayoría de las veces se utilizan tampones de separación neutros y básicos.

Para aumentar la especificidad y sensibilidad del método de electroforesis capilar para el análisis de β-aminoácidos individuales, se utiliza su derivatización preliminar, seguida de separación en un capilar de cuarzo y determinación espectrofotométrica de los productos de reacción. Por tanto, como agentes derivatizantes se utilizan formiato de 9-fluorenilmetilo, cloroformiato de 9-(2-carbazol)-etilo y colorante de cianina. Las perspectivas del método se deben a ventajas tales como análisis rápido, facilidad de preparación de muestras, bajo consumo de reactivos y simplicidad de instrumentación.

y proteínas

Se sabe que las 20 variedades de α-aminoácidos canónicos tienen la misma estructura, con tres variantes de grupos funcionales (fig. 3.3). Desafortunadamente, las reacciones a los grupos amino y carboxi no son muy específicas, porque respectivamente, son característicos de todas las aminas, varias amidas y ácidos carboxílicos. Lo mismo se aplica a la mayoría de sus radicales = R, 10 de los cuales son apolares, es decir, representados por grupos alifáticos = hidrocarbonados, la mayoría de los cuales son químicamente inertes. La especificidad de la mayoría de los aminoácidos polares R, que contienen alcohol (Ser, Tre, Tyr), amida (Asn, Gln) y grupos carboxi (Asp, Glu), también es relativamente baja. El grupo amino (Lys), el imidazol His y el grupo guanidino Arg son más activos, y la actividad del grupo tio Cys es máxima. Por lo tanto el mayor significado práctico en calidad y análisis cuantitativo Los α-aminoácidos, incluidos los analizadores de aminoácidos, recibieron una reacción universal de ninhidrina, específica para la presencia simultánea de grupos amino y carboxi en el átomo de α-C.

Arroz. 3.3. Fórmulas generales para la estructura de los α-aminoácidos y el producto de su polimerización. Explicaciones en el texto.

La polimerización de α-aminoácidos en la estructura de péptidos y proteínas (Fig. 3.3) conserva todos sus tipos R, pero:

1. La reacción de la ninhidrina se vuelve negativa porque A excepción de los terminales N y C, los grupos α-amino y α-carboxi se gastan en la formación de enlaces peptídicos. Una reacción positiva de la ninhidrina con la proteína probablemente indica la presencia de impurezas de aminoácidos en la preparación o el recipiente.

2. Para todos los péptidos y proteínas, una reacción de biuret es específica de un grupo peptídico que está ausente en los aminoácidos monoméricos.

3. De las reacciones más específicas a los aminoácidos R, son útiles las siguientes: reacción de xantoproteína con ácido nítrico concentrado, a los aromáticos R Fen, Tyr, Tri; reacción con isatina en el anillo Pro de cinco miembros, así como reacciones en el imidazol R His, el grupo tio Cys y el grupo guanidino Arg. Es importante tener en cuenta que algunos de estos R están ocultos dentro de los glóbulos proteicos y, por lo tanto, las reacciones cualitativas hacia ellos se debilitan. Por ello, antes de llevarse a cabo, las proteínas suelen desnaturalizarse de una forma u otra.

4. A diferencia de las verdaderas soluciones de aminoácidos, las soluciones coloidales de proteínas se caracterizan reacciones sedimentarias, asociado con la destrucción de sus capas de hidratación y, como resultado, una disminución de su solubilidad bajo la influencia de agentes eliminadores de agua: sales neutras = sal, metanol = MeOH, etanol = EtOH, acetona, urea y otros agentes.

Al realizar reacciones cualitativas, debes:

1. Siga cuidadosamente las reglas de seguridad contra incendios y trabaje con ácidos y álcalis concentrados = EZh.

2. Marque 2 filas de tubos de ensayo con un gráfico de vidrio o un rotulador y en uno de ellos no coloque más de 0,5 ml (2-5 gotas) de una solución de aminoácidos al 1%, y aproximadamente el mismo volumen de 1 % de solución de proteína en el otro.

3. En un par de tubos de ensayo con soluciones de aminoácidos y proteínas, agregar en paralelo 3-5 gotas de los reactivos correspondientes y realizar el resto de procedimientos indicados para la reacción correspondiente.

4. Si es necesario calentar los tubos de ensayo, retire la tapa del crisol y encienda el combustible seco con una cerilla. Luego, sujete el tubo de ensayo en un soporte, cuyo diseño primitivo es muy poco confiable. Por lo tanto, es mejor envolver un par de tubos de ensayo con un trozo de papel doblado en forma de tira y, sujetándolos pulgar, pasar las mitades inferiores de los tubos de ensayo uniformemente a través de la llama, evitando apuntar con el cuello a los vecinos y hacer que la solución hierva violentamente. Después de completar la operación, apague rápidamente la llama con la tapa del crisol.

5. Se elaboran los resultados de los experimentos, de acuerdo con la plantilla. sobre la difusión del cuaderno de laboratorio en forma de tabla:

6. Habiendo considerado los resultados obtenidos y habiendo completado el protocolo, junto con una gradilla de tubos de ensayo, presentarlos al docente para su protección.

1. Reacción de ninhidrina. Basado en la desaminación y descarboxilación de α-aminoácidos con una solución alcohólica de ninhidrina:

El amoníaco resultante, al reaccionar con dos moléculas de ninhidrina, forma un derivado coloreado con un máximo de absorción a 540 nm (para Pro - 440 nm).

Progreso del trabajo: Añadir 3-5 gotas de 0,5% a las muestras de prueba solución de alcohol ninhidrina. Calentar suavemente los tubos de ensayo con las mezclas al fuego y después de 2-3 minutos, registrar la apariencia del color.

2. Reacción de xantoproteínas. Como se mencionó anteriormente, se basa en la formación de nitroderivados de aminoácidos con R aromáticos: Fen, Tyr, Tri.

Progreso del trabajo: Encendiendo el tiro de la campana extractora, agregue con cuidado unas gotas de ácido nítrico concentrado (HNO 3) a un par de tubos de ensayo con las soluciones de prueba. Caliente suavemente los tubos de ensayo al fuego, evitando apuntar con el cuello a los vecinos, y registre la evolución del color.

3. Reacción del nitroprusiato. Se basa en la hidrólisis alcalina del aminoácido azufrado cisteína, con liberación de sulfuro de sodio (Na 2 S), que da un complejo rojo con una solución recién preparada de nitroprusiato de sodio.

Avance del trabajo: Agregue un volumen igual de hidróxido de sodio al 20% a ambos tubos de ensayo con 5 a 10 gotas de las soluciones de prueba y hierva durante al menos 3 a 5 minutos. Agregue de 3 a 5 gotas de solución de nitroprusiato de sodio a los tubos de ensayo y registre el desarrollo del color.

4. Reacción de Biuret. Se basa en la formación de un complejo coloreado de un enlace peptídico con un ion Cu 2+ en un ambiente alcalino. Sirve como prueba universal para identificar péptidos y proteínas en soluciones. Dado que al aumentar el número de enlaces peptídicos la intensidad del color de la solución aumenta linealmente, se utiliza ampliamente para la determinación fotométrica de concentraciones de proteínas.

Progreso del trabajo. Agregue la misma cantidad de solución de hidróxido de sodio al 10% a los tubos de ensayo con 5 a 10 gotas de las soluciones de prueba. Mezclar bien y agregar 2 gotas de solución de sulfato de cobre al 1% (CuSO 4). Mezcle las muestras y registre el desarrollo del color después de unos minutos.

5. Prueba de ebullición. Basado en la desnaturalización térmica de proteínas.

Progreso del trabajo. Acidificar ambos tubos de ensayo con las soluciones de prueba con no más de una gota de solución de ácido acético (AcOH) al 1% y calentar hasta ebullición. Después de hervir las soluciones durante 2-3 minutos, registre los resultados y explique el mecanismo del fenómeno.

6. Precipitación por sales de metales pesados.(Bueno) . Sus propiedades desnaturalizantes se basan en la capacidad de los cationes Me pesados ​​​​para reaccionar con los grupos funcionales R de la molécula de proteína: tio, amino, carboxi, aromático. Además, sus fuertes aniones provocan la recarga de grupos iónicos en las moléculas de proteínas, destruyendo así los enlaces iónicos que contienen.

Progreso del trabajo. Agregue unas gotas de una solución de sulfato de cobre al 5% (CuSO 4) a ambos tubos de ensayo con las soluciones de prueba. Registre y explique los resultados obtenidos.

7. Precipitación con ácidos orgánicos. Basado en la desnaturalización ácida de proteínas y la formación de derivados covalentes de grupos tio, amino y aromáticos de aminoácidos R con organoclorados.

Progreso del trabajo. Agregue unas gotas de una solución al 10% de ácido tricloroacético (TCA) a los tubos de ensayo con las soluciones de prueba y, después de unos minutos, registre los resultados.

Equipo y reactivo: papel de cromatografía; cámara de cromatografía; colorímetro fotoeléctrico; tijeras; placas de vidrio (3´32 cm) - 3 piezas; soporte de cromatograma; gabinete de secado; micropipetas; tubos de ensayo con tapón esmerilado; bureta 25 ml; mezcla estándar de aminoácidos; mezcla de prueba de aminoácidos; butanol, ácido acético, agua en una proporción de 15:3:7; Solución al 1% de ninhidrina en acetona al 95%; alcohol etílico (75%), saturado con sulfato de cobre.

Hacer el trabajo

Tome una hoja de papel cromatográfico de 18 x 28 cm y dibuje una línea horizontal con un simple lápiz a una distancia de 3 cm de su borde corto. Luego se divide en secciones desiguales de acuerdo con el diagrama adjunto y los límites de aplicación de las mezclas estándar y de prueba se marcan con flechas y las inscripciones correspondientes se hacen con un simple lápiz.

El papel se refuerza sobre la superficie de la mesa y primero se aplica la mezcla estándar a la línea de inicio, limitada por las flechas, usando una micropipeta especial en una línea delgada hasta que toda la solución de la micropipeta se transfiere a la línea de inicio (la micropipeta es lleno hasta 2-3 cm). La masa de la solución aplicada se mide pesando la pipeta llena con la mezcla estándar (antes de aplicar la solución) y vacía (después de aplicar la solución). Generalmente se aplican al papel entre 0,02 y 0,03 g de solución estándar. Luego llene una pipeta limpia con la mezcla de prueba de aminoácidos (expedida por el profesor para el estudio), pésela y aplique la mezcla a la línea de inicio con la marca correspondiente.

El cromatograma preparado se coloca en una cámara de cromatografía en la que previamente se vierte un sistema de disolvente para separar una mezcla de aminoácidos, por ejemplo, una mezcla de butanol, ácido acético y agua en una proporción de 15:3:7. La separación se realiza mediante cromatografía ascendente hasta que la línea frontal alcanza 2-3 cm hasta el borde superior del papel de cromatografía (línea de llegada). Después de esto, se retira el cromatograma de la cámara y el extremo superior del papel se inserta inmediatamente en un soporte formado por tres varillas de vidrio sujetas con un anillo de goma y se coloca en una campana extractora durante 20 minutos para eliminar los disolventes del papel.

Arroz. 8. Esquema de disposición de los aminoácidos en el cromatograma:

A - punto de aplicación de una mezcla de aminoácidos; I - cistina y cisteína;

2 - lisina; 3 - histidina; 4 - arginina; 5 - ácido aspártico,

series y glicina; 6 - ácido glutámico y treonina; 7 - alanina;

8 - prolina; 9 - tirosina; 10 - valina y metionina; II - triptófano;

12 - fenilalanina; 13 – leucina e isoleucina

El cromatograma seco se sumerge en una solución de ninhidrina al 1% en acetona para detectar la posición de las manchas de aminoácidos en él. Luego se coloca el cromatograma en una campana extractora durante 10 minutos para eliminar la acetona y se transfiere a una cabina de secado, donde se deja durante 15 minutos a 70°C. Los aminoácidos de las mezclas estándar y de prueba se detectan en forma de manchas azul violeta ubicadas en una cadena en la dirección del movimiento del sistema solvente desde la línea de inicio hasta el borde superior del cromatograma.

La identificación de los aminoácidos contenidos en la mezcla de prueba se realiza mediante la coincidencia en el cromatograma de las posiciones ocupadas por los aminoácidos de las mezclas estándar y de prueba (Fig. 8).

Para determinar el contenido cuantitativo de aminoácidos en las mezclas de prueba, el cromatograma se dibuja con un simple lápiz de modo que las zonas coloreadas que se encuentran en el mismo nivel, correspondientes al mismo aminoácido, estén contenidas dentro de rectángulos aproximadamente idénticos (Fig. 9). .

I II III IV

Arroz. 9. Disposición de aminoácidos en el cromatograma:

I - mezcla No. I; II - mezcla nº 2; 1U - mezcla nº 3; Ш - estándar

mezcla de aminoácidos

Las áreas delineadas del papel se recortan y se colocan en tubos de ensayo, cuyo número debe corresponder al número de puntos en los cromatogramas. Se vierten 10 ml de una solución al 75% en cada tubo de ensayo con una bureta. alcohol etílico saturado con sulfato de miel (agregue 0,2 ml de solución saturada de sulfato de cobre a 500 ml de alcohol etílico). Se tapa el tubo de ensayo y, revolviendo ocasionalmente, el color rojo ladrillo (sal de cobre azul violeta de Ruemann) se transfiere completamente del papel a la solución. Esto lleva entre 15 y 20 minutos. La absorción (densidad óptica) de las soluciones estándar y de prueba se mide en un calorímetro fotoeléctrico con un filtro de luz verde (540 nm). En el flujo de referencia se instala una cubeta con una solución al 75% de alcohol etílico con sulfato de cobre.

El contenido cuantitativo de aminoácidos en la solución problema se calcula a partir de la relación entre las extinciones de las muestras problema y estándar.

Ejemplo de cálculo. Supongamos que la mezcla estándar contiene 1,8 mg de glicina en 1 ml y se aplican 0,02 g de esta solución estándar a la tira inicial. Por tanto, el cromatograma recibió (1,8 × 0,02) = 0,036 mg de glicina. Acordemos además que la absorción de las soluciones coloreadas fue 0,288 para la mezcla estándar y 0,336 para la mezcla desconocida. Entonces el contenido de glicina en la mezcla en estudio, representado en el cromatograma, será (36´0,336): 0,288=42 μg. Si asumimos además que la mezcla de prueba se aplica al cromatograma en una cantidad de, por ejemplo, 0,0250 g, entonces el contenido de glicina en 1 ml de la solución de prueba será (42:0,0250) = 1680 μg, o 1,68 mg/ ml.

Presenta los resultados de tu propio experimento y saca conclusiones de ellos.

Trabajo de laboratorio No. 15.

Separación de ionesfe 3+ , Co 2+ , Ni 2+

Este artículo discutirá los métodos para determinar los aminoácidos, utilizados no solo en el análisis de productos, sino también en bioquímica y análisis farmacéutico.

La cantidad total de aminoácidos se puede determinar mediante un método fotométrico basado en la determinación del amoníaco obtenido a partir de aminoácidos mediante el método Kjeldahl.

Reacción con 1-naftol. Para determinar arginina, histidina y tirosina se propuso una reacción con 1-naftol. En presencia de hipoclorito de sodio (NaOCl), la solución se vuelve roja. Se enfría con hielo una solución de muestra en etanol al 50% que contiene un aminoácido y se añaden una solución de NaOCl al 10% y una solución de naftol. El producto de la reacción está coloreado de rojo (l máx = 550 nm). El contenido de aminoácidos está determinado por la intensidad del color de la solución resultante.

reacción de biuret. Una de las reacciones más importantes utilizadas para determinar los aminoácidos es la reacción de biuret. La reacción se lleva a cabo añadiendo una solución acuosa diluida de sal de cobre (II) a una solución alcalina de biuret. En este caso, la solución se vuelve intensamente púrpura debido a la formación de un compuesto complejo.

En la reacción de biuret intervienen compuestos que contienen al menos 2 grupos amida o un grupo aminohidroxietileno, así como amidas e imidas de aminoácidos. Esta reacción se lleva a cabo mediante proteínas y soluciones concentradas de aminoácidos y amidas. Las soluciones diluidas de aminoácidos no producen una reacción de biuret y, por lo tanto, la reacción puede usarse para determinar el final de la hidrólisis de proteínas. La reacción también se utiliza para la determinación cualitativa y cuantitativa de proteínas. La reacción de biuret es la base de los métodos utilizados en los laboratorios de diagnóstico clínico para determinar las proteínas en la sangre y otros fluidos biológicos.

Reacción de la ninhidrina. La segunda reacción más importante utilizada para determinar los aminoácidos es la reacción de la ninhidrina, una reacción de color a los aminoácidos a, que se lleva a cabo calentando estos últimos en una solución alcalina de un exceso de ninhidrina.

La ninhidrina lleva a cabo la descarboxilación oxidativa de los aminoácidos a con la formación de amoníaco, dióxido de carbono y aldehído, que contienen un átomo de carbono menos que el aminoácido original. La ninhidrina reducida reacciona aún más con el amoníaco liberado y una segunda molécula de ninhidrina, formando un producto de condensación coloreado con amoníaco.

El compuesto resultante (pigmento) tiene un color azul violeta (l máx = 570 nm). La formación de este compuesto coloreado se utiliza en la prueba cuantitativa de a-aminoácidos, que puede detectar aminoácidos incluso en cantidades tan pequeñas como 1 µg.

La prolina y la hidroxiprolina, que no tienen un grupo a-amino, reaccionan con la ninhidrina para formar derivados. amarillo(l máx = 440 nm). La reacción no es específica, porque El amoníaco y los compuestos que contienen un grupo amino (aminas, proteínas, péptidos) también producen un producto coloreado con ninhidrina. Sin embargo, con estos compuestos no se libera CO 2 . La liberación de dióxido de carbono es característica únicamente de los a-aminoácidos. La reacción se utiliza para la determinación cuantitativa colorimétrica de a-aminoácidos, incluso en analizadores automáticos de aminoácidos (medición del volumen de CO 2).

La reacción de la ninhidrina se utiliza para determinar glicina, isoleucina, leucina; la serina, la fenilalanina, la cisteína, la tirosina, el triptófano, etc. dan una coloración menos intensa.

Los productos resultantes se caracterizan por un color bastante intenso (e = 1,8–3,3·10 4), pero los productos coloreados son inestables. La intensidad del color disminuye rápidamente. Se añade CdCl 2 para estabilización. Forma complejos estables con los compuestos resultantes. El cloruro de cadmio también acelera la reacción.

Los aminoácidos y algunos otros compuestos que contienen un grupo amino se condensan en un medio alcalino con 1,2-naftoquinona - 4-sulfoxilato para formar derivados rojos, amarillos y naranjas de 1,2-naftoquinona monoimina.

La reacción se utiliza para determinar los a-aminoxilatos (valina, isoleucina, leucina, etc.).

Para determinar el triptófano se puede utilizar la reacción con 4-dimetilaminobenzaldehído. El producto de la reacción está coloreado de color púrpura y el contenido de triptófano en la solución analizada está determinado por la intensidad del color.

Sin embargo, cabe señalar que esta reacción rara vez se utiliza en el análisis de alimentos.

Para la determinación cuantitativa de aminoácidos que contienen azufre se utiliza un método bromatométrico, basado en la siguiente reacción:

Se vierte una solución de cisteína en una solución de NaOH al 1% en un matraz con tapón esmerilado y se agrega 0,1 N. solución de bromato de potasio, bromuro de potasio seco y acidificado con HCl al 10%.

BrO 3 – + 5Br – + 6H + → 3Br 2 + 3H 2 O

El bromo formado como resultado de la reacción, cuya cantidad es equivalente a la cantidad de bromato de potasio, reacciona con el aminoácido. Después de 10 minutos, se añade yoduro de potasio, que reacciona con el bromo que no ha reaccionado, y el yodo liberado se titula con 0,1 N. Solución de tiosulfato de sodio con almidón como indicador.

2I – + Br 2 → Br - + Yo 2

La cantidad de tiosulfato utilizada para la titulación es equivalente a la cantidad de bromo que no reaccionó con el aminoácido. Con base en la diferencia entre la cantidad de bromato y tiosulfato de potasio agregados, se encuentra la cantidad de bromo que entró en reacción con el aminoácido y, por lo tanto, la cantidad de aminoácido.

La metionina se determina de manera similar. La metionina se oxida a una sulfona:

Esta reacción, en determinadas condiciones, permite determinar con mucha precisión el contenido de metionina.



Los aminoácidos se pueden detectar mediante reacciones cromáticas: ninhidrina, xantoproteína, Foly, Milone, prueba de biuret, etc. Estas reacciones son inespecíficas porque se basan en la detección de fragmentos individuales en la estructura de los aminoácidos, que también se pueden encontrar en otros compuestos.

Reacción de ninhidrina, una reacción de color utilizada para la determinación cualitativa y cuantitativa de aminoácidos, iminoácidos y aminas. Cuando se calienta en un ambiente alcalino, la ninhidrina (tricetohidrina deshidratada, C 9 H b O 4) con sustancias que tienen grupos amino primarios (-NH 2), se forma un producto que tiene un color azul violeta intenso estable con una absorción máxima de aproximadamente 570 Nuevo Méjico. Dado que la absorción a esta longitud de onda depende linealmente del número de grupos amino libres, la reacción de la ninhidrina sirvió de base para su determinación cuantitativa mediante colorimetría o espectrofotometría. Esta reacción también se utiliza para determinar grupos amino secundarios (>NH) en iminoácidos: prolina e hidroxiprolina; en este caso se forma un producto de color amarillo brillante. Sensibilidad: hasta 0,01%. El análisis automático moderno de aminoácidos se lleva a cabo combinando la separación de aminoácidos por intercambio iónico y su determinación cuantitativa mediante la reacción de ninhidrina. Al separar mezclas de aminoácidos mediante cromatografía en papel, es posible determinar cada aminoácido en una cantidad de al menos 2-5 μg.

La intensidad del color se puede utilizar para juzgar la cantidad de aminoácidos.

Esta reacción es positiva no sólo con aminoácidos libres, sino también con péptidos, proteínas, etc.

Reacción de xantoproteína permite la detección de aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, histidina, triptófano), basándose en la reacción de sustitución electrófila en el núcleo aromático (nitración).

Cuando el ácido nítrico concentrado actúa, por ejemplo, sobre la tirosina, se forma un producto de color amarillo.

Sigue la reacción. Esta es una reacción a la cisteína y la cistina. Durante la hidrólisis alcalina, el "azufre débilmente unido" en la cisteína y la cistina se separa con bastante facilidad, lo que da como resultado la formación de sulfuro de hidrógeno que, al reaccionar con el álcali, produce sulfuros de sodio o potasio. Cuando se añade acetato de plomo (II), se forma un precipitado gris oscuro de sulfuro de plomo (II).

Descripción de la experiencia. Se vierte 1 ml de solución de cistina en un tubo de ensayo y se añaden 0,5 ml de solución de hidróxido de sodio al 20%. La mezcla se calienta hasta ebullición y luego se añaden 0,5 ml de solución de acetato de plomo (II). Se observa un precipitado gris negruzco de sulfuro de plomo (II):

Reacción de Zimmerman. Esta es una reacción al aminoácido glicina.

Descripción de la experiencia. A 2 ml de una solución de glicina al 0,1%, ajustada añadiendo una solución alcalina al 10% a pH = 8, añadir 0,5 ml de una solución acuosa de dialdehído o-ftálico. La mezcla de reacción comienza lentamente a tornarse de color verde brillante. Al cabo de unos minutos aparece un precipitado verde.

Reacción al triptófano. El triptófano reacciona en ambiente ácido Con aldehídos forma productos de condensación coloreados. Por ejemplo, con ácido glioxílico (que es una mezcla de concentrado ácido acético) la reacción procede según la ecuación:

La reacción del triptófano con formaldehído se produce según un esquema similar.

La reacción de Sakaguchi. Esta reacción al aminoácido arginina se basa en la interacción de la arginina con α-naftol en presencia de un agente oxidante. Su mecanismo aún no ha sido completamente dilucidado. Al parecer, la reacción se lleva a cabo según la siguiente ecuación:

Dado que los derivados de las quinonaiminas (en este caso, la naftoquinona), en los que el hidrógeno del grupo imino –NH– se sustituye por un radical alquilo o arilo, siempre tienen un color amarillo-rojo, entonces, aparentemente, el color rojo anaranjado de la solución durante la reacción de Sakaguchi se explica por la aparición del derivado de naftoquinona imina. Sin embargo, no se puede excluir la posibilidad de que se forme un compuesto aún más complejo debido a una mayor oxidación de los grupos NH restantes del residuo de arginina y del anillo de benceno del α-naftol:

Descripción de la experiencia. Se vierten 2 ml de una solución de arginina al 0,01% en un tubo de ensayo, luego se añaden 2 ml de una solución de hidróxido de sodio al 10% y unas gotas de una solución alcohólica de α-naftol al 0,2%. Se mezcla bien el contenido del tubo de ensayo, se añaden 0,5 ml de solución de hipobromito y se vuelve a mezclar. Agregue inmediatamente 1 ml de solución de urea al 40% para estabilizar el color rojo anaranjado que se desarrolla rápidamente.

reacción de biuret– utilizado como reacción de color a las proteínas. En ambiente alcalino en presencia de sales de cobre (II), dan un color violeta. El color se debe a la formación de un compuesto complejo de cobre (II) debido al grupo peptídico. -CO-NH-, que es característico de las proteínas. Esta reacción debe su nombre a un derivado de la urea, el biuret, que se forma cuando la urea se calienta con la eliminación del amoníaco:

Además de las proteínas y el biuret, la misma coloración la dan otros compuestos que contienen este grupo: amidas, imidas de ácidos carboxílicos, así como compuestos que contienen los grupos -CS-NH- o =CH-NH- en la molécula. También reaccionan proteínas, algunos aminoácidos, péptidos, biuret y peptonas medias.

El color del complejo obtenido mediante la reacción de biuret con varios péptidos es algo diferente y depende de la longitud de la cadena peptídica. Los péptidos con una longitud de cadena de cuatro residuos de aminoácidos y más forman un complejo rojo, tripéptidos, violeta y dipéptidos, azules.

forma cetona del polipéptido

forma enol del polipéptido

Cuando un polipéptido interactúa con Cu (OH) 2, se forma un complejo, cuya estructura se puede mostrar de la siguiente manera.