Za kvantificiranje aminokiselina koriste se metode. Kvalitativne reakcije na aminokiseline, peptide, proteine. Metode određivanja aminokiselina

Metode određivanja aminokiselina

Aminokiseline su biološki djelatne tvari, igraju važnu ulogu u životu ljudskog tijela, naširoko se koriste kao lijekovi. Neki od njih su nezamjenjivi i unose se u organizam hranom. Trenutno postoji niz metoda za kvantitativno određivanje aminokiselina u ljekovitom biljnom materijalu, u lijekovi i biološke tekućine u prehrambenim proizvodima.

Iz cijelog niza metoda za kvantitativno određivanje aminokiselina u različitim objektima mogu se razlikovati četiri glavne skupine: kromatografske, spektrofotometrijske, titrimetrijske i elektrokemijske metode analize.

Kromatografske metode

Tijekom proteklih desetljeća postignut je značajan napredak u području plinsko-tekućinske kromatografije aminokiselina. Predložena je metoda koja koristi mikropakirane kolone, koja omogućuje relativnu kratko vrijeme odvojiti gotovo potpuno 17 biološki važnih?-aminokiselina.

Razvijena je metoda za određivanje aminokiselina pomoću plinsko-tekućinske kromatografije u uzorcima seruma, plazme, urina i cerebrospinalne tekućine, koja se temelji na pripremi 2,3,4,5,6-pentafluorobenzoil-izobutil etera, a zatim separacija na koloni polidimetilsiloksana u modu programiranja temperature od 140°C do 250°C s plamenoionizacijskim detektorom. Vrijeme kromatografskog odvajanja je 28 minuta. Kao rezultat istraživanja, bilo je moguće odvojiti 27 aminokiselina.

Unatoč raznolikosti metoda tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti u analizi aminokiselina, verzija reverzne faze sa spektrofotometrijskom detekcijom je najizrazitija i najpristupačnija. Za uspješnu separaciju i detekciju aminokiseline se prevode u hidrofobne derivate i derivate koji apsorbiraju svjetlost, odnosno provodi se derivatizacija prije kolone. Kao reagensi za derivatizaciju koriste se ortoftalaldehid, naftalen-2,3-dikarboksialdehid, 9-fluorenilmetilkloroformat.

Razvijena je metoda za kvantitativno određivanje L-cistina, L-glutaminske kiseline i glicina u lijeku Eltacin, koji ima antioksidativno djelovanje u kombinaciji s antianginoznim učinkom. Glutaminska kiselina i glicin određeni su reverzno faznom tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti nakon derivatizacije prije kolone s ortoftalaldehid/N-acetil-L-cistein reagensom. Derivatizacija cisteina, prema autorima, teška je zbog nestabilnosti same aminokiseline i nastalih derivata. Stoga je analiza cisteina provedena metodom bromatometrijske titracije. Utvrđeno je da prisutnost značajnih količina cisteina u uzorku ne ometa određivanje produkata derivatizacije glicina i glutaminske kiseline s ortoftalaldehid / N-acetil-L-cistein reagensom. Metodu karakterizira visoka ponovljivost i točnost određivanja.

Mogućnost korištenja 4,7-fenantrolin-5,6-diona (fankinona) kao fluorogenog reagensa-obilježivača za formiranje njegovih derivata prije kolone za odvajanje i kvantitativnu analizu aminokiselina tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti je otkrivena. studirao. Budući da nema vlastitu fluorescenciju, fankinon reagira s amino skupinama aminokiselina (na 68 °C tijekom 160 minuta), stvarajući iminokinole, čija se fluorescencija mjeri na valnoj duljini od 460 nm. Izolirani derivati ​​identificirani su Tm, IR, masenim i PMR spektrom. Tekućinska kromatografija visoke djelotvornosti provedena je na kromatografu s fluorescentnim detektorom i stupcem s gradijentnom elucijom smjesama: otopina trietilamina - fosfatni pufer (pH 3) - metanol. Kinidin je korišten kao interni standard. Ova metoda prilično obećavajući u uvjetima velikih laboratorija i može se predložiti za analizu aminokiselina u gotovim oblicima doziranja.

Razvijena je tehnika za tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti s potenciometrijskim biosenzorom za kvantitativno određivanje lizina. Biosenzor je konstruiran pričvršćivanjem membrane koja sadrži lizin oksidazu na ion-selektivnu NH4+ elektrodu. Amonijevi ioni nastali tijekom enzimske razgradnje lizina detektiraju se potenciometrijski. Razvijena je kromatodenzitometrijska ekspresna metoda za analizu triptofana u tekućinama kulture. Tankoslojna kromatografija je provedena na Sorbfil pločama. Kromatografija je provedena u sustavu propanol-2 - 25% otopina amonijevog hidroksida (7:3) tijekom 25 minuta. Kromatogrami su osušeni na sobnoj temperaturi i držani na 120°C 15 minuta. Za detekciju mrlja na kromatogramima korišten je specifičan reagens - 4-dimetilaminobenzaldehid, selektivan na indolski prsten triptofana, u obliku 0,5%-tne otopine etanola uz dodatak 5%-tne koncentrirane sumporne kiseline. Nakon razvijanja kromatograma uranjanjem u teflonsku kivetu sa svježe pripremljenom otopinom 4-dimetilaminobenzaldehida, držani su 5-7 minuta na temperaturi od 110°C. Mjege triptofana skenirane su na valnoj duljini od 625 nm pomoću računalnog video denzitometra. Razvijena metoda, unatoč visokoj točnosti određivanja i produktivnosti, specifična je za triptofan.

Za analizu α-aminokiselina u biološkim tekućinama, lijekovima i prehrambenim proizvodima naširoko se koriste metode kapilarne elektroforeze, koje se temelje na odvajanju komponenata složene smjese u kvarcnoj kapilari pod djelovanjem primijenjenog električnog polja. Budući da su aminokiseline zwitterionske prirode, mogu se odvojiti pomoću elektrolitnih pufera odgovarajućeg pH, najčešće se koriste neutralni i bazični puferi za odvajanje.

Kako bi se povećala specifičnost i osjetljivost metode kapilarne elektroforeze za analizu pojedinih α-aminokiselina, koristi se njihova preliminarna derivatizacija, zatim separacija u kvarcnoj kapilari i spektrofotometrijsko određivanje produkata reakcije. Stoga se kao derivatizacijski agensi koriste 9-fluorenilmetil format, 9-(2-karbazol)-etil kloroformat i cijaninska boja. Perspektivnost metode je zbog njenih prednosti kao što su brza analiza, jednostavnost pripreme uzorka, mala potrošnja reagensa i jednostavnost instrumentacije.

I proteini

Poznato je da svih 20 varijanti kanonskih α-aminokiselina imaju istu strukturu, s tri varijante funkcionalnih skupina (slika 3.3). Nažalost, reakcije na amino i karboksi skupine nisu vrlo specifične, jer odnosno, karakteristični su za sve amine, brojne amide i karboksilne kiseline. Isto vrijedi i za većinu njihovih radikala = R, od kojih su 10 nepolarni, odnosno predstavljeni su alifatskim = ugljikovodičnim skupinama, od kojih je većina kemijski inertna. Specifičnost većine R polarnih aminokiselina također je relativno niska, u kojima se pojavljuju alkoholne (Ser, Tre, Tyr) amidne (Acn, Gln) i karboksilne skupine (Asp, Glu). Aktivnije su amino skupina (Liz), imidazol His i gvanidino skupina Arg, dok je najveća aktivnost tio skupine Cys. Stoga, najveći praktična vrijednost u kvaliteti i kvantitativna analizaα-aminokiseline, uključujući i analizatore aminokiselina, dobile su univerzalnu ninhidrinsku reakciju, specifičnu za istovremenu prisutnost amino i karboksi skupina na α-C atomu.

Riža. 3.3. Opće formule za strukturu α-aminokiselina i produkta njihove polimerizacije. Objašnjenja u tekstu.

Polimerizacija α-aminokiselina u strukturu peptida i proteina (slika 3.3) čuva sve vrste njihovih R, ali:

1. Ninhidrinska reakcija postaje negativna, jer s izuzetkom N- i C-terminala, α-amino i α-karboksi skupine troše se na stvaranje peptidnih veza. Pozitivna reakcija ninhidrina s proteinom prije ukazuje na prisutnost nečistoća aminokiselina u pripravku ili jelima.

2. Za sve peptide i proteine ​​specifična je biuretska reakcija na peptidnu skupinu, koja je odsutna u monomernim aminokiselinama.

3. Od specifičnijih reakcija na R aminokiseline, korisne su sljedeće: ksantoproteinska reakcija s koncentriranom dušičnom kiselinom, na aromatske R Phe, Tyr, Tri; reakcija s izatinom za peteročlani prsten Pro, kao i reakcije za imidazol R His, tio skupinu Cys i gvanidino skupinu Arg. Važno je uzeti u obzir da su neki od tih Rs skriveni unutar proteinskih globula, pa su kvalitativne reakcije na njih oslabljene. Stoga, prije nego što se provedu, proteini se obično denaturiraju na ovaj ili onaj način.

4. Za razliku od pravih otopina aminokiselina, koloidne otopine proteina karakteriziraju sedimentne reakcije povezana s razaranjem njihovih hidratacijskih ljuski i, kao rezultat toga, smanjenjem njihove topljivosti pod djelovanjem sredstava za uklanjanje vode: neutralne soli = isoljavanje, metanol = MeOH, etanol = EtOH, aceton, urea i drugi agensi.

Izvodeći kvalitativne reakcije, trebali biste:

1. Pažljivo se pridržavajte pravila zaštite od požara i rada s koncentriranim kiselinama i lužinama = EJ.

2. Staklografom ili flomasterom označite 2 reda epruveta iu jednu od njih stavite najviše 0,5 ml (2-5 kapi) 1% otopine aminokiselina i približno isti volumen 1% otopine proteina. u drugom.

3. U par epruveta s otopinama aminokiselina i proteina paralelno dodajte 3-5 kapi odgovarajućih reagensa i provedite ostale postupke naznačene za odgovarajuću reakciju.

4. Ako je potrebno zagrijati epruvete, skinite poklopac s lončića i šibicom zapalite suho gorivo. Zatim pričvrstite epruvetu u držač, čiji je primitivni dizajn vrlo nepouzdan. Stoga je bolje omotati par epruveta komadom papira presavijenim u traku i držeći ih palac, ravnomjerno provucite donje polovice epruveta kroz plamen, izbjegavanje smjera vratova na susjede i brzo vrenje otopine. Nakon završetka postupka, na vrijeme ugasite plamen poklopcem lončića.

5. Rezultate pokusa, prema predlošku, izraditi na širenju laboratorijske bilježnice u obliku tablice:

6. Nakon razmatranja rezultata i popunjavanja protokola, zajedno sa stalkom epruveta, predajte ih nastavniku na zaštitu.

1. Ninhidrinska reakcija. Na temelju deaminacije i dekarboksilacije α-aminokiselina alkoholnom otopinom ninhidrina:

Rezultirajući amonijak, reagirajući s dvije molekule ninhidrina, tvori obojeni derivat s maksimumom apsorpcije na 540 nm (za Pro - 440 nm).

Napredak: Dodajte 3-5 kapi 0,5% ispitnim uzorcima otopina alkohola ninhidrin. Lagano zagrijte epruvete sa smjesama na plamenu i nakon 2-3 minute registrirajte pojavu boje.

2. Ksantoproteinska reakcija. Kao što je gore spomenuto, temelji se na stvaranju nitro derivata aminokiselina s aromatskim R: Phen, Tyr, Tri.

Napredak: Uključite propuh nape, pažljivo dodajte nekoliko kapi koncentrirane dušične kiseline (HNO 3) u par epruveta s ispitnim otopinama. Lagano zagrijte epruvete na plamenu, izbjegavajući smjer grlića prema susjedima, i registrirajte razvoj boje.

3. Nitroprusid reakcija. Temelji se na alkalnoj hidrolizi aminokiseline cisteina koja sadrži sumpor, uz oslobađanje natrijevog sulfida (Na 2 S) koji daje crveni kompleks sa svježe pripremljenom otopinom natrijevog nitroprusida.

Napredak: Dodajte jednaki volumen 20% natrijevog hidroksida u obje epruvete s 5-10 kapi ispitivane otopine i kuhajte najmanje 3-5 minuta. U epruvete dodajte 3-5 kapi otopine natrijeva nitroprusida i zabilježite razvoj boje.

4. Biuretska reakcija. Temelji se na stvaranju u alkalnom mediju obojenog kompleksa peptidne veze s Cu 2+ ionom. Služi kao univerzalni test za detekciju peptida i proteina u otopinama. Budući da s povećanjem broja peptidnih veza, intenzitet boje otopine raste linearno, naširoko se koristi za fotometrijsko određivanje koncentracije proteina.

Napredak. U epruvete s 5-10 kapi ispitne otopine dodajte istu količinu 10% otopine natrijevog hidroksida. Dobro promiješajte i dodajte 2 kapi 1% otopine bakrenog sulfata (CuSO 4). Pomiješajte uzorke i nakon nekoliko minuta registrirajte razvoj boje.

5. Proba s kuhanjem. Na temelju toplinske denaturacije proteina.

Napredak. Zakiselite obje epruvete s ispitnim otopinama s najviše jednom kapi 1% otopine octene kiseline (AcOH) i zagrijte do vrenja. Nakon kuhanja otopina 2-3 minute, zabilježite rezultate i objasnite mehanizam pojave.

6. Taloženje sa solima teških metala(Mi) . Njihova denaturirajuća svojstva temelje se na sposobnosti teških Me kationa da reagiraju s funkcionalnim skupinama R proteinske molekule: tio-, amino-, karboksi-, aromatske. Također, njihovi jaki anioni uzrokuju ponovno punjenje ionogenih skupina u proteinskim molekulama, čime uništavaju ionske veze u njima.

Napredak. U obje epruvete s ispitivanim otopinama dodajte nekoliko kapi 5% otopine bakrenog sulfata (CuSO 4). Zabilježite i objasnite rezultate.

7. Taloženje organskim kiselinama. Temelji se na kiseloj denaturaciji proteina i stvaranju kovalentnih derivata tio-, amino- i aromatskih skupina R aminokiselina s organoklorovima.

Napredak. Dodajte nekoliko kapi 10% otopine trikloroctene kiseline (TCA) u epruvete s ispitnim otopinama i zabilježite rezultate za nekoliko minuta

Oprema i reagens: kromatografski papir; kromatografska komora; fotoelektrični kolorimetar; škare; staklene ploče (3x32 cm) - 3 kom .; držač za kromatograme; ormar za sušenje; mikropipete; epruvete s brušenim čepovima; bireta 25 ml; standardna mješavina aminokiselina; ispitna smjesa aminokiselina; butanol, octena kiselina, voda u omjeru 15:3:7; 1% otopina ninhidrina u 95% acetonu; etilni alkohol (75%), zasićen bakrenim sulfatom.

Završetak rada

Uzmite list kromatografskog papira dimenzija 18x28 cm i jednostavnom olovkom povucite vodoravnu crtu na udaljenosti od 3 cm od njegova kraćeg ruba. Zatim se podijeli na nejednake segmente u skladu s priloženom shemom, a granice primjene standardnih i ispitnih smjesa označene su strelicama i odgovarajući natpisi napravljeni su jednostavnom olovkom.

Papir se fiksira iznad površine stola i na startnu liniju, ograničenu strelicama, posebnom mikropipetom u tankoj liniji prvo se nanosi standardna smjesa dok se cijela otopina iz mikropipete ne prenese na startnu liniju (mikropipeta je napunjena). 2-3 cm). Masa nanesene otopine mjeri se vaganjem pipete napunjene standardnom smjesom (prije nanošenja otopine) i prazne (nakon nanošenja otopine). Na papir se obično nanosi 0,02-0,03 g standardne otopine. Zatim napunite čistu pipetu mješavinom aminokiselina koju želite testirati (koju je dao učitelj za studiju), izvažite je i nanesite smjesu na početnu liniju s odgovarajućom oznakom.

Pripremljeni kromatogram stavlja se u kromatografsku komoru u koju je prethodno uliven sustav otapala za odvajanje smjese aminokiselina, npr. smjese butanola, octene kiseline i vode u omjeru 15:3:7. Razdvajanje se provodi uzlaznom kromatografijom sve dok prednja linija ne dosegne 2-3 cm do gornjeg ruba kromatografskog papira (finiš linija). Nakon toga kromatogram se izvadi iz komore, a gornji kraj papira odmah se umetne u držač od tri staklene šipke pričvršćene gumenim prstenom i stavi u dimnu komoru na 20 min da se s papira uklone otapala.

Riža. 8. Shema rasporeda aminokiselina na kromatogramu:

A - točka nanošenja mješavine aminokiselina; I - cistin i cistein;

2 - lizin; 3 - histidin; 4 - arginin; 5 - asparaginska kiselina,

serija i glicin; 6 - glutaminska kiselina i treonin; 7 - alanin;

8 - prolin; 9 - tirozin; 10 - valin i metionin; II - triptofan;

12 - fenilalanin; 13 - leucin i izoleucin

Osušeni kromatogram umoči se u 1% otopinu ninhidrina u acetonu kako bi se na njemu odredili položaji aminokiselinskih mrlja. Zatim se kromatogram stavi na 10 minuta u komoru za odvodnjavanje da se ukloni aceton i prenese u pećnicu, gdje se ostavi 15 minuta na 70°C. Aminokiseline standardne i ispitne smjese detektiraju se kao plavo-ljubičaste mrlje raspoređene u lancu u smjeru sustava otapala od početne linije do gornjeg ruba kromatograma.

Identifikacija aminokiselina sadržanih u ispitivanoj smjesi provodi se podudaranjem položaja aminokiselina standardne i ispitivane smjese na kromatogramu (slika 8).

Da bi se odredio kvantitativni sadržaj aminokiselina u ispitivanim smjesama, kromatogram se crta jednostavnom olovkom tako da su obojene zone koje leže na istoj razini, a koje odgovaraju istoj aminokiselini, unutar približno identičnih pravokutnika (slika 9.) .

I II III IV

Riža. 9. Shema rasporeda aminokiselina na kromatogramu:

I - smjesa br. I; II - smjesa broj 2; 1U - smjesa broj 3; Š - standard

mješavina aminokiselina

Ocrtani dijelovi papira se izrežu i stave u epruvete čiji brojevi trebaju odgovarati broju točaka na kromatogramima. U svaku epruvetu iz birete se ulije 10 ml 75% otopine. etil alkohol, zasićen mednim sulfatom (u 500 ml etilnog alkohola dodajte 0,2 ml zasićene otopine bakrenog sulfata). Epruveta se zatvori plutenim čepom i uz povremeno miješanje postigne se potpuni prijelaz ciglastocrvene boje (bakrena sol Ruemanove plavoljubičaste) s papira u otopinu. To traje 15-20 minuta. Apsorbancija (optička gustoća) standardne i ispitne otopine mjeri se na fotoelektrokalorimetru sa filtrom zelene svjetlosti (540 nm). U referentni tok ugrađuje se kiveta sa 75% otopinom etilnog alkohola s bakrenim sulfatom.

Kvantitativni sadržaj aminokiselina u ispitivanoj otopini izračunava se iz omjera ekstinkcija ispitivanog i standardnog uzorka.

Primjer izračuna. Pretpostavimo da standardna smjesa sadrži 1,8 mg glicina u 1 ml, 0,02 g te standardne otopine nanese se na početnu traku. Dakle, kromatogram je dobio (1,8×0,02) = 0,036 mg glicina. Nadalje, složimo se da je apsorbancija obojenih otopina bila 0,288 za standardnu ​​i 0,336 za nepoznatu smjesu. Tada će sadržaj glicina u ispitnoj smjesi nanesenoj na kromatogram biti (36´0,336): 0,288=42 µg. Ako nadalje pretpostavimo da se ispitna smjesa nanosi na kromatogram u količini od npr. 0,0250 g, tada će sadržaj glicina u 1 ml ispitivane otopine biti (42:0,0250) = 1680 μg, odnosno 1,68 mg. / ml.

Izvedite rezultate vlastitog eksperimenta, izvucite zaključke iz njih.

Laboratorija #15

Odvajanje ionaFe 3+ , co 2+ , Ni 2+

Ovaj članak će razmotriti metode za određivanje aminokiselina koje se koriste ne samo u analizi proizvoda, već iu biokemiji i farmaceutskoj analizi.

Ukupna količina aminokiselina može se odrediti fotometrijskom metodom koja se temelji na određivanju amonijaka dobivenog iz aminokiselina prema Kjeldahlovoj metodi.

Reakcija s 1-naftolom. Za određivanje arginina, histidina, tirozina predložena je reakcija s 1-naftolom. U prisutnosti natrijeva hipoklorita (NaOCl) otopina postaje crvena. Otopina uzorka u 50% etanolu koja sadrži aminokiselinu ohladi se ledom i dodaju se 10% otopina NaOCl i otopina naftola. Produkt reakcije je obojen crveno (l max = 550 nm). Sadržaj aminokiselina određen je intenzitetom boje dobivene otopine.

Biuretska reakcija. Jedna od najvažnijih reakcija koja se koristi za određivanje aminokiselina je biuretska reakcija. Reakcija se provodi dodavanjem razrijeđene vodene otopine bakrove (II) soli u alkalnu otopinu biureta. U ovom slučaju, otopina je intenzivno obojena ljubičasta zbog stvaranja kompleksnog spoja.

U biuretsku reakciju ulaze spojevi koji sadrže najmanje 2 amidne skupine ili aminohidroksietilensku skupinu, kao i amidi i imidi aminokiselina. Proteini i koncentrirane otopine aminokiselina i amida daju ovu reakciju. Razrijeđene otopine aminokiselina ne daju biuretnu reakciju i stoga se reakcija može koristiti za utvrđivanje završetka hidrolize proteina. Reakcija se također koristi za kvalitativno i kvantitativno određivanje proteina. Metode koje se koriste u kliničkim dijagnostičkim laboratorijima za određivanje proteina u krvi i drugim biološkim tekućinama temelje se na biuretskoj reakciji.

ninhidrinska reakcija. Druga najvažnija reakcija koja se koristi za određivanje aminokiselina je ninhidrinska reakcija - obojena reakcija za a-aminokiseline, koja se provodi zagrijavanjem potonjih u alkalnoj otopini viška ninhidrina.

Ninhidrin provodi oksidativnu dekarboksilaciju a-aminokiselina uz stvaranje amonijaka, ugljičnog dioksida i aldehida koji sadrži jedan ugljikov atom manje od izvorne aminokiseline. Reducirani ninhidrin tada reagira s oslobođenim amonijakom i drugom molekulom ninhidrina, stvarajući obojeni proizvod kondenzacije s amonijakom.

Dobiveni spoj (pigment) ima ljubičasto-plavu boju (l max = 570 nm). Stvaranje ovog obojenog spoja koristi se u kvantitativnom testu za a-aminokiseline, s kojim se aminokiseline mogu detektirati, čak i njihova količina ne prelazi 1 μg.

Prolin i hidroksiprolin, koji nemaju a-amino skupinu, reagiraju s ninhidrinom stvarajući derivate žuta boja(l max = 440 nm). Reakcija nije specifična, jer obojeni produkt s ninhidrinom također daje amonijak i spojeve koji sadrže amino skupinu (amine, proteine, peptide). Međutim, s tim se spojevima ne oslobađa CO 2 . Oslobađanje ugljičnog dioksida karakteristično je samo za a-aminokiseline. Reakcija se koristi za kolorimetrijsko kvantitativno određivanje a-aminokiselina, uključujući i automatske analizatore aminokiselina (mjerenje volumena CO 2 ).

Ninhidrin reakcija se koristi za određivanje glicina, izoleucina, leucina; manje intenzivnu boju daju serin, fenilalanin, cistein, tirozin, triptofan itd.

Dobiveni proizvodi karakterizirani su prilično intenzivnom bojom (e = 1,8–3,3 10 4), ali su obojeni proizvodi nestabilni. Intenzitet boje se brzo smanjuje. Za stabilizaciju se dodaje CdCl2. S nastalim spojevima stvara stabilne komplekse. Kadmijev klorid također ubrzava reakciju.

Aminokiseline i neki drugi spojevi koji sadrže amino skupinu kondenziraju se u alkalnom mediju s 1,2-naftokinon - 4-sulfoksilatom i tvore crvene, žute, narančaste derivate 1,2-naftokinon monoimina.

Reakcijom se određuju a-aminokiseline (valin, izoleucin, leucin i dr.).

Reakcija s 4-dimetilaminobenzaldehidom može se koristiti za određivanje triptofana. Produkt reakcije je obojen ljubičasto, a intenzitet boje određuje sadržaj triptofana u analiziranoj otopini.

Međutim, treba napomenuti da se ova reakcija rijetko koristi u analizi hrane.

Za kvantitativno određivanje aminokiselina koje sadrže sumpor koristi se bromatometrijska metoda koja se temelji na sljedećoj reakciji:

Otopina cisteina u 1% otopini NaOH ulije se u tikvicu s brušenim čepom, 0,1 N. otopine kalijevog bromata, osuši kalijev bromid i zakiseli s 10% HCl.

BrO 3 - + 5Br - + 6H + → 3Br 2 + 3H 2 O

Brom koji nastaje kao rezultat reakcije, čija je količina jednaka količini kalijevog bromata, reagira s aminokiselinom. Nakon 10 minuta doda se kalijev jodid, koji reagira s neizreagiranim bromom, a oslobođeni jod se titrira s 0,1 N. otopina natrijevog tiosulfata sa škrobom kao indikatorom.

2I - + Br 2 → Br - + I 2

Količina tiosulfata korištena za titraciju je ekvivalentna količini broma koji nije reagirao s aminokiselinom. Po razlici između količine dodanog kalijevog bromata i tiosulfata određuje se količina broma koja je reagirala s aminokiselinom, a time i količina aminokiseline.

Slično se određuje metionin. Metionin se oksidira u sulfon:

Ova reakcija, pod određenim uvjetima, omogućuje vrlo precizno određivanje sadržaja metionina.



Aminokiseline se mogu detektirati pomoću obojenih reakcija: ninhidrin, ksantoprotein, Fol, Milon, biuret testovi itd. Ove reakcije su nespecifične, jer temelje se na otkrivanju pojedinačnih fragmenata u strukturi aminokiselina, koji se također mogu pojaviti u drugim spojevima.

Ninhidrinska reakcija, reakcija u boji koja se koristi za kvalitativno i kvantitativno određivanje aminokiselina, iminokiselina i amina. Zagrijavanjem u alkalnom mediju ninhidrina (triketohidrindenhidrata, C 9 H b O 4) sa tvarima koje imaju primarne amino skupine (-NH 2), nastaje produkt koji ima stabilnu intenzivnu plavo-ljubičastu boju s maksimalnom apsorpcijom od oko 570 nm. Budući da apsorpcija na ovoj valnoj duljini linearno ovisi o broju slobodnih amino skupina, ninhidrinska reakcija poslužila je kao osnova za njihovo kvantitativno određivanje kolorimetrijom ili spektrofotometrijom. Ova se reakcija također koristi za određivanje sekundarnih amino skupina (>NH) u iminokiselinama – prolinu i hidroksiprolinu; u ovom slučaju nastaje svijetlo žuti produkt. Osjetljivost - do 0,01%. Suvremena automatska analiza aminokiselina provodi se kombinacijom odvajanja aminokiselina ionskom izmjenom i njihovog kvantitativnog određivanja pomoću ninhidrinske reakcije. Kod razdvajanja smjesa aminokiselina papirnom kromatografijom, svaka aminokiselina se može odrediti u količini od najmanje 2-5 µg.

Količina aminokiselina može se procijeniti prema intenzitetu boje.

Ova reakcija je pozitivna ne samo sa slobodnim aminokiselinama, već i sa peptidima, proteinima itd.

ksantoproteinska reakcija omogućuje otkrivanje aromatskih aminokiselina (fenilalanin, tirozin, histidin, triptofan), na temelju reakcije elektrofilne supstitucije u aromatskoj jezgri (nitracija).

Pod djelovanjem koncentrirane dušične kiseline, na primjer, na tirozin, nastaje žuti produkt.

Fohlova reakcija. Ovo je reakcija na cistein i cistin. Tijekom alkalne hidrolize, "slabo vezani sumpor" u cisteinu i cistinu prilično se lako odvaja, što rezultira stvaranjem sumporovodika, koji, reagirajući s alkalijama, daje natrijeve ili kalijeve sulfide. Dodavanjem olovo(II) acetata nastaje sivo-crni talog olovo(II) sulfida.

Opis iskustva. U epruvetu ulijte 1 ml otopine cistina, dodajte 0,5 ml 20% otopine natrijevog hidroksida. Smjesa se zagrije do vrenja, a zatim se doda 0,5 ml otopine olovo(II) acetata. Uočava se sivo-crni talog olovo(II) sulfida:

Zimmermannova reakcija. Ovo je reakcija na aminokiselinu glicin.

Opis iskustva. U 2 ml 0,1% otopine glicina, podešene dodatkom 10% otopine lužine na pH = 8, ulije se 0,5 ml vodene otopine o-ftalnog dialdehida. Reakcijska smjesa polako postaje svijetlo zelena. Nakon nekoliko minuta pojavljuje se zeleni talog.

odgovor na triptofan. Triptofan reagira sa kisela sredina s aldehidima stvara obojene produkte kondenzacije. Na primjer, s glioksilnom kiselinom (koja je nečistoća koncentriranom octena kiselina) reakcija se odvija prema jednadžbi:

Reakcija triptofana s formaldehidom odvija se prema sličnoj shemi.

Sakaguchijeva reakcija. Ova reakcija na aminokiselinu arginin temelji se na interakciji arginina s α-naftolom u prisutnosti oksidirajućeg sredstva. Njegov mehanizam još nije u potpunosti razjašnjen. Očigledno, reakcija se odvija prema sljedećoj jednadžbi:

Budući da su derivati ​​kinonimina (u ovom slučaju naftokinona), u kojima je vodik imino skupine –NH– zamijenjen alkilnim ili arilnim radikalom, uvijek obojeni žuto-crvenim tonovima, tada je, očito, narančasto-crvena boja otopine tijekom Sakaguchijeve reakcije posljedica je pojave upravo derivata naftokinonimina. Međutim, nije isključena mogućnost stvaranja još složenijeg spoja zbog daljnje oksidacije preostalih NH skupina argininskog ostatka i benzenskog prstena α-naftola:

Opis iskustva. U epruvetu ulijte 2 ml 0,01%-tne otopine arginina, zatim dodajte 2 ml 10%-tne otopine natrijevog hidroksida i nekoliko kapi 0,2%-tne alkoholne otopine α-naftola. Sadržaj epruvete se dobro promiješa, doda se 0,5 ml otopine hipobromita i ponovno promiješa. Odmah se dodaje 1 ml 40% otopine uree kako bi se stabilizirala narančasto-crvena boja koja se brzo razvija.

Biuretska reakcija- koristi se kao reakcija boje za proteine. U alkalnoj sredini u prisutnosti bakrovih(II) soli daju ljubičastu boju. Boja je posljedica stvaranja bakrovog (II) kompleksnog spoja, zbog peptidne skupine -CO-NH-što je karakteristično za proteine. Ova reakcija je dobila naziv po derivatu uree - biuretu, koji nastaje zagrijavanjem uree uz eliminaciju amonijaka:

Osim proteina i biureta, drugi spojevi koji sadrže ovu skupinu također daju isto bojenje: amidi, imidi karboksilnih kiselina, kao i spojevi koji sadrže skupine -CS-NH- ili \u003d CH-NH- u molekuli. Proteini, neke aminokiseline, peptidi, biuret i srednji peptoni također daju reakciju.

Boja kompleksa dobivenog biuretskom reakcijom s različitim peptidima je nešto drugačija i ovisi o duljini peptidnog lanca. Peptidi s duljinom lanca od četiri aminokiselinska ostatka i više tvore crveni kompleks, tripeptidi - ljubičasti, a dipeptidi - plavi.

ketonski oblik polipeptida

enolni oblik polipeptida

Kada polipeptid međudjeluje s Cu (OH) 2, nastaje kompleks čija se struktura može prikazati na sljedeći način.