tercero Métodos de diagnóstico de laboratorio de helmintiasis. Examen de las deposiciones

7.7. Métodos para determinar la viabilidad de huevos y larvas de helmintos.

La viabilidad de los huevos de helmintos está determinada por apariencia, por tinción con colorantes vitales, por cultivo en condiciones óptimas y establecer una muestra biológica.

7.7.1. Determinación de la viabilidad de huevos o larvas de helmintos por apariencia.

Los huevos de helmintos se observan primero con un aumento bajo y luego con un aumento alto. En los huevos de helmintos deformados y muertos, la cáscara se rompe o se dobla hacia adentro, el plasma está turbio, suelto. En los huevos segmentados, las bolas de división (blastómeros) tienen un tamaño desigual, una forma irregular y, a menudo, se desplazan hacia un polo. A veces hay óvulos anormales que, al tener deformidades externas, se desarrollan normalmente. En las larvas vivas de gusanos redondos, la granularidad fina está presente solo en la parte media del cuerpo, a medida que mueren, se extiende por todo el cuerpo, aparecen grandes vacuolas hialinas brillantes, las llamadas "cadenas de perlas".

Para determinar la viabilidad de los huevos maduros de ascáridos, tricocéfalos, oxiuros, los movimientos activos de las larvas deben provocarse calentando ligeramente la preparación (a una temperatura que no supere los 37 ° C). Es más conveniente observar la viabilidad de las larvas de áscaris y tricocéfalos después de aislarlas de la cáscara del huevo presionando el cubreobjetos de la preparación con una aguja de disección o unas pinzas.

En las larvas invasoras de ascáridos, a menudo se ve un sombrero que se ha exfoliado en el extremo de la cabeza, y en las larvas de tricocéfalos que han completado su desarrollo en el huevo, se encuentra un estilete en este lugar con gran aumento. Las larvas muertas de helmintos, independientemente de su ubicación (en el huevo o fuera de él), notan la descomposición del cuerpo. En este caso, la estructura interna de la larva se vuelve grumosa o granular, y el cuerpo se vuelve turbio y opaco. Se encuentran vacuolas en el cuerpo y roturas en la cutícula.

La viabilidad de las oncósferas teniidas (tenia bovina, porcina, etc.) está determinada por el movimiento de los embriones cuando se exponen a Enzimas digestivas. Los huevos se colocan en un cristal de reloj. jugo gastrico perros o jugo duodenal artificial. La composición de este último: pancreatina - 0,5 g, bicarbonato de sodio - 0,09 g, agua destilada - 5 ml. Los vasos de reloj con huevos se colocan en un termostato a 36 - 38 ° C durante 4 horas. En este caso, los embriones vivos se liberan de las membranas. Las cubiertas de las oncósferas vivas también se disuelven en pepsina acidificada y en una solución alcalina de tripsina después de 6 a 8 horas en un termostato a 38 °C.

Si los huevos tenidos se colocan en una solución de sulfuro de sodio al 1 % o en una solución de hipoclorito de sodio al 20 %, o en una solución de agua clorada al 1 % a 36 - 38 °C, los embriones maduros y vivos se liberan de las cáscaras y no cambiar durante 1 día. Las oncosferas inmaduras y muertas se arrugan o se hinchan y se agrandan dramáticamente y luego se "disuelven" en 10 minutos a 2 horas. Los embriones vivos de teniids también se mueven activamente en una mezcla de solución de cloruro de sodio al 1%, solución de bicarbonato de sodio al 0,5% y bilis a 36 - 38 ° C.

La viabilidad de fasciolia adolescariae recolectada de plantas y otros objetos de cuerpos de agua se verifica examinándolas en un portaobjetos de vidrio en solución salina bajo un microscopio con una etapa de calentamiento. Cuando se calienta, las larvas de trematodos en el quiste comienzan a moverse.

Para determinar la viabilidad de los huevos de la tenia pigmea, el método de Ionina N.S. es el más simple: en huevos vivos, el par mediano de ganchos embrionarios es paralelo a los laterales, o estos últimos forman un ángulo en la base de menos de 45° con la mediana. En los huevos muertos, los pares laterales forman un ángulo en la base con un par mediano de más de 45°, o los anzuelos están dispersos al azar (se pierde su disposición en pares); a veces hay arrugas en el embrión, la formación de granularidad. Un método más preciso se basa en la aparición de movimientos de la oncosfera durante un cambio brusco de temperatura: de 5 - 10 ° a 38 - 40 ° C.

La determinación de la viabilidad de los huevos inmaduros de nematodos se debe estudiar en cámara húmeda (placas Petri), colocando huevos de ascaris en una solución de formalina al 3% preparada en una solución isotónica de cloruro de sodio a una temperatura de 24 - 30 °C, huevos de tricocéfalos en una solución de 3 % de solución de ácido clorhídrico a una temperatura de 30 - 35 ° C; huevos de oxiuros en solución isotónica de cloruro de sodio a 37 °C. Las cajas de Petri deben abrirse de 1 a 2 veces por semana para una mejor aireación y humedecer nuevamente el papel filtro con agua limpia.

Las observaciones del desarrollo de los huevos de helmintos se realizan al menos 2 veces por semana. La ausencia de signos de desarrollo dentro de 2-3 meses indica su inviabilidad. Los signos del desarrollo de los huevos de helmintos son primero las etapas de trituración, la división del contenido del huevo en blastómeros separados. Durante los primeros días, se desarrollan hasta 16 blastómeros, que pasan a la segunda etapa: mórula, etc.

Los huevos de anquilostomiasis se cultivan en un cilindro de vidrio (50 cm de alto y 7 cm de diámetro) cerrado con un tapón. Una mezcla de volúmenes iguales de arena estéril, carbón y heces con huevos de anquilostoma, diluida con agua hasta obtener una consistencia semilíquida, se vierte con cuidado en el fondo del cilindro utilizando un tubo de vidrio. Durante 1 - 2 días de asentamiento en la oscuridad a una temperatura de 25 - 30 ° C, las larvas rabditoides eclosionan de los huevos, y después de 5 - 7 días ya se vuelven filariformes: las larvas trepan por las paredes del cilindro, donde se son visibles incluso a simple vista.

Los huevos de trematodos que se desarrollan naturalmente en el agua, como opisthorchis, diphyllobothriids, fasciols y otros, se colocan en un vidrio de reloj, una placa de Petri o en otro recipiente, y se vierte una pequeña capa de agua corriente. Al cultivar huevos de fasciola, se debe tener en cuenta que se desarrollan más rápido en la oscuridad, mientras que los huevos vivos se forman miracidios a una temperatura de 22–24 ° C después de 9–12 días. Cuando la microscopía de los huevos de trematodos en desarrollo, los movimientos de miracidio son claramente visibles. Fasciola miracidium emerge de las cáscaras de huevo solo a la luz.

Método Fulleborn. Las larvas de anquilostomiasis y estrongílidos se cultivan en agar en una placa de Petri con carbón animal. Después de mantener en un termostato a una temperatura de 25 - 30 ° C durante 5 - 6 horas, las larvas se esparcen sobre el agar, dejando tras de sí un camino de bacterias.

Método de Harada y Mori. Se añaden 7 ml de agua destilada a tubos de ensayo colocados en una gradilla. Tomar 0,5 g de heces con un palo de madera y hacer un frotis sobre papel filtro (15 x 150 mm) a 5 cm del borde izquierdo (esta operación se realiza sobre una hoja de papel para proteger la superficie de la mesa de laboratorio). Luego, la tira con el frotis se inserta en el tubo de modo que el extremo izquierdo libre del frotis llegue al fondo del tubo. Cubra el extremo superior con un trozo de celofán y envuélvalo bien con una banda elástica. En el tubo de ensayo escriba el número, el nombre del sujeto. En este estado, los tubos de ensayo se almacenan durante 8-10 días a una temperatura de 28 °C. Para estudiar las larvas, retire y retire la cubierta de celofán y retire una tira de papel de filtro con unas pinzas. Se debe tener cuidado en este caso, ya que una pequeña cantidad de larvas infectantes pueden moverse hacia el extremo superior del papel de filtro o hacia la pared del tubo de ensayo y penetrar debajo de la superficie del celofán.

Los tubos se colocan en un baño de agua caliente a 50°C durante 15 minutos, después de lo cual se agita el contenido y se vierte rápidamente en un tubo de sedimentación de larvas de 15 ml. Después de la centrifugación, se retira el sobrenadante y el precipitado se transfiere a un portaobjetos de vidrio, se cubre con un cubreobjetos y se observa bajo un microscopio de bajo aumento.

Para diagnóstico diferencial larvas filariformes, debe utilizar los datos de la Tabla 3.

Tabla 3

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE LARVAS FILARIADAS DE A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, trICHOStrONGYLUS SP.

larvas	Dimensiones	Rasgos característicos
A. duodenal	Longitud del cuerpo alrededor de 660 micras, tapa - 720 nm	La estría del casquete es menos pronunciada, la protrusión de la boca es menos notoria, el extremo anterior del cuerpo (pero no el casquete) es romo, el diámetro del tubo intestinal es menor que el del bulbo esofágico, el extremo caudal es romo
n. americano	Longitud del cuerpo alrededor de 590 μm, tapa - 660 nm	La vaina está notablemente estriada, especialmente en la parte caudal del cuerpo, la boca aparece oscura, el extremo anterior del cuerpo (pero no la vaina) es redondeado como un extremo angosto. Gallina, huevo, la parte anterior del tubo intestinal de un diámetro como el bulbo del esófago, el extremo de la cola es puntiagudo
S. stercoralis	Longitud del cuerpo alrededor de 500 µm	Larva sin vaina, el esófago mide aproximadamente la mitad de la longitud del cuerpo, la cola es roma o ramificada
Trichostrongylus sp.	Longitud del cuerpo alrededor de 750 micras	La luz intestinal no es recta, sino en zigzag, el extremo caudal es redondeado y tiene forma de botón

7.7.2. Métodos para teñir huevos y larvas de helmintos.

Los tejidos muertos en la mayoría de los casos perciben los colores más rápido que los vivos. Estas características se utilizan en helmintología para determinar la viabilidad de huevos y larvas de helmintos. Sin embargo, en algunos casos, algunas pinturas son mejor percibidas por los tejidos vivos que por los muertos.

Para la determinación diferencial de huevos y larvas vivos y muertos, se utilizan las siguientes pinturas y métodos.

La leucobase azul de metileno se usa a menudo para teñir tejidos vivos y muertos. Una célula o tejido vivo reduce el azul de metileno a una leucobase incolora; el tejido muerto no tiene esta capacidad y, por lo tanto, adquiere un color.

El criterio para el estado del huevo es la tinción del embrión, pero no de la cáscara. Esta habilidad está relacionada con las condiciones de muerte del huevo. En aquellos casos en que la cáscara fibrosa del huevo muerto no pierda sus propiedades semipermeables, no pasará colorantes, por lo tanto, el embrión muerto no se manchará. Un embrión coloreado siempre indica la muerte del huevo.

Para colorear los huevos de Ascaris, puede usar azul de metileno en una solución de ácido láctico con álcali cáustico (azul de metileno 0,05 g, soda cáustica 0,5 g, ácido láctico - 15 ml). Los huevos vivos no perciben el color; los embriones de huevos muertos se vuelven azules. Las larvas de Ascaris se tiñen con una solución básica de pintura azul de cresilo brillante a una concentración de 1:10.000 de la siguiente manera: se aplica una gota de líquido con huevos de Ascaris y una gota de la solución de pintura básica a un portaobjetos de vidrio. La preparación se cubre con un cubreobjetos, que se presiona firmemente contra el portaobjetos de vidrio con ligeros golpecitos con una aguja de disección. Bajo el microscopio, se observa el número de larvas eclosionadas y el grado de tinción; luego de lo cual se vuelve a revisar el mismo fármaco al cabo de 2 a 3 horas. Solo las larvas no deformadas que no se han teñido durante 2 horas se consideran vivas. Las larvas muertas no emergen de los huevos o se tiñen cuando la cáscara se rompe (parcial o completamente).

Al determinar la viabilidad de los huevos de aves ascaridias, es posible teñir preparaciones con 5% solución de alcohol yodo. Cuando se aplica a la droga, los embriones de huevos de ascáridos muertos durante 1 - 3 segundos. se tiñen de naranja.

Los huevos muertos de opisthorchis y las oncosferas de tenia bovina se tiñen con una solución de azul de toluidina (1:1000) y las oncosferas muertas de tenia bovina se tiñen con una solución de azul de cresilo brillante (1:10000). Al mismo tiempo, los embriones y las cáscaras de los huevos vivos y muertos adquieren color. Por lo tanto, después de la tinción, los huevos y las oncósferas se lavan en agua limpia y adicionalmente teñirlos con safranina (en una dilución de 1:10.000 alcohol 10°C). El alcohol elimina el tinte de las conchas y la safranina las tiñe de rojo. Como resultado, los huevos vivos se vuelven rojos; huevos con embriones muertos - en azul, y la cáscara permanece roja. Los embriones muertos de oncósferas de tenia bovina se tiñen rápidamente, en pocos minutos, de color rojo brillante o rosa con safranina o azul con azul de cresilo brillante a una dilución de 1:4000, o con índigo carmín a una dilución de 1:1000 - 1 :2000. Los embriones vivos no cambian bajo la influencia de estos colores incluso después de 2 a 7 horas.

Para determinar la viabilidad de los huevos de tenia pigmea, se recomienda utilizar las siguientes pinturas:

1. Azul de creasilo brillante (1:8000): después de 1 hora, la oncosfera de los huevos muertos se tiñe de manera especialmente brillante, lo que se destaca nítidamente contra el fondo pálido o incoloro del resto del huevo.

2. Safranina (1:8000 por 2 horas y 1:5000 por 3 a 5 horas).

3. Solución de ácido pirogálico al 50% en una dilución 1:2 - cuando se expone durante 1 hora a una temperatura de 29 - 30 ° C (cuanto más baja es la temperatura, más largo es el proceso de tinción).

7.7.3. Método luminiscente para el estudio de huevos y larvas de helmintos.

La microscopía de fluorescencia permite diferenciar objetos vivos y muertos sin dañar el huevo. Para la fluorescencia no se utilizan los rayos ultravioleta, sino la parte azul-violeta de la luz visible, con un microscopio convencional y portaobjetos de vidrio; Se agrega un conjunto especial de filtros de color al iluminador OI-18.

Los huevos vivos y muertos de lombrices intestinales, lombrices intestinales, tenias pigmeas, tenias bovinas, tenias y otros helmintos tienen una luminiscencia diferente. Este fenómeno se observa tanto durante la luminiscencia primaria sin el uso de colorantes, como cuando se tiñe con fluorocromos (naranja de acridina, corifosfina, primulina, aurolina, sulfato de berlerina, tripaflavina, rivanol, quinacrina, etc.).

Los huevos de lombrices vivas, no segmentadas, sin teñir, brillan de color verde brillante con un tinte amarillento; en los huevos muertos, la cáscara emite una luz verde mucho más brillante que la parte embrionaria de color verde oscuro; en los huevos de ascáride con larva, solo aparece la cáscara, mientras que en los muertos, tanto la cáscara como la larva son de color amarillo brillante.

Los huevos vivos no pigmentados y no segmentados de oxiuros y tenias enanas emiten una luz de color amarillo verdoso; en los huevos muertos, la cáscara se ilumina intensamente sobre el fondo de una masa embrionaria de color verde oscuro.

Con luminiscencia secundaria (cuando se tiñe con naranja de acridina a una dilución de 1:10000 y 1:50000 de 30 minutos a 2 horas), el caparazón de los nematodos, trematodos y cestodos vivos y muertos se ilumina de manera diferente.

La cáscara de los huevos vivos y muertos de ascáridos, toxocar, oxiuros, tenias pigmeas, tenias de rata, tenias de toro, tenias se vuelve de color rojo anaranjado. Los embriones de huevos vivos de ascaris, toxascaris, tenia de rata, tenia ancha y oncosfera de tenia bovina se iluminan en un color verde oscuro opaco o gris verdoso. Los embriones muertos de los huevos de estos helmintos emiten un color rojo anaranjado "quemante". Las larvas vivas de oxiuros y los toxocares (cáscaras de huevo) emiten una luz gris verdosa opaca, cuando mueren, el color cambia desde el extremo de la cabeza a un verde claro "quemante", luego amarillo, naranja y finalmente a naranja brillante.

Cuando se tiñen con fluorocromos: coryphosphyllum, primulin, huevos muertos de ascarids y tricocéfalos muestran un brillo de amarillo lila a rojo cobre. Los huevos viables no se iluminan, sino que se vuelven de color verde oscuro.

Los huevos vivos de trematodos (Paragonimus y Clonorchis) no se iluminan después de teñirlos con naranja de acridina, y los huevos muertos tienen un color verde amarillento.

El método de luminiscencia también se puede utilizar para determinar la viabilidad de las larvas de helmintos. Entonces, fluorocromizado con una solución de naranja de acridina (1:2000), larvas de estrongilato, rhabdita brillan: vivo - verde (con un tinte), muerto - luz naranja brillante.

Los miracidios vivos que han emergido del caparazón emiten una luz azulada tenue con una corola de cilios de color amarillo claro apenas perceptible, pero 10-15 minutos después de la muerte aparecen como una luz verde brillante "ardiendo" y luego una luz naranja-roja.

7.7.4. método de ensayo biológico

Por ejemplo, para determinar la viabilidad de los huevos de ascaris (ascaris cerdos, humanos, toxocara, toxascaris, etc.) por animal (cobayas, ratones), se necesitan al menos 100 - 300 huevos con una larva desarrollada. Los huevos de Ascaris en solución isotónica de cloruro de sodio se pipetean a través de la boca de un ratón o cobayo. Después de 6-7 días, el animal se sacrifica, se abre y su hígado y pulmones se examinan por separado para detectar la presencia de larvas de ascaris. Para ello, el hígado y los pulmones se cortan en pequeños trozos con unas tijeras y se examinan según el método de Berman o Supryaga (sección 6.1.2).

Si los animales estaban infectados con huevos invasivos vivos, entonces en la autopsia en el hígado y los pulmones, se encuentran larvas migratorias de ascaris.

En caso de infección, los huevos de Fasciola en las heces de animales de laboratorio pueden detectarse en conejos después de 2 meses, en conejillos de indias- después de 50 días, en ratones - después de 35 - 40 días.

Para una respuesta más rápida, los animales de laboratorio se abren después de 20 a 30 días y se examina el hígado para detectar la presencia de fascioles jóvenes.

Para determinar la viabilidad de los huevos de tenia pigmea, también se recomienda alimentarlos con ratones blancos previamente no infectados, seguido de la autopsia de los animales después de 92 a 96 horas y la detección de cisticercos en las vellosidades intestinales o cestodos en el lumen intestinal.

Para determinar la viabilidad de los huevos de opisthorchis, se recomienda un método (German S.M., Beer S.A., 1984), basado en la activación fisicoquímica de la glándula de eclosión del miracidio y la estimulación de la actividad motora de la larva, que conduce a la apertura del huevo. tapa y la liberación activa de miracidium en condiciones experimentales.

Una suspensión de huevos de opisthorchis en agua se enfría previamente a 10 - 12 ° C (todas las operaciones posteriores se llevan a cabo a temperatura ambiente 19 - 20 ° C). Se agrega 1 gota de una suspensión que contiene 100-150 huevos a un tubo de centrífuga. El tubo de ensayo se coloca en un trípode durante 5-10 minutos. Durante este tiempo, todos los huevos tienen tiempo de hundirse hasta el fondo. Luego, con una tira de papel de filtro, se succiona cuidadosamente el exceso de agua y se agregan 2 gotas de un medio especial al tubo de ensayo. El medio se prepara en tampón Tris-HCl 0,005 M; Se añaden al tampón solución de etanol al 12 - 13% y colorante (magenta, safranina, eosina, azul de metileno, etc.). El tubo de ensayo se agita, su contenido se transfiere con una pipeta a un portaobjetos de vidrio y se deja durante 10 minutos, agitando ligeramente. Luego agregue 2 gotas del medio indicado. La preparación está lista para microscopía bajo un microscopio de luz convencional con un aumento de 20x.

Durante este tiempo, la tapa de las larvas viables se abre y el miracidio ingresa activamente al medio indicado. Debido a la presencia de etanol en él, se inmovilizan después de 2 a 5 minutos y luego se tiñen con un tinte. Se pueden detectar y contar fácilmente bajo microscopía.

Nivel inicial de conocimientos y habilidades.

El estudiante debe saber:

1. Representantes de trematodos opisthorch, paragonim, fasciola, dicrocelia.

2. Ciclos de vida, vías de infección de los trematodos, cuadro clinico enfermedades, vida útil de las heces

El estudiante debe ser capaz de:

1. Identifique los huevos de trematodos a partir de figuras y tablas.

2. Formar medidas preventivas.

3. Prepare un frotis nativo, un frotis grande, un frotis de Kato, evalúe su trabajo, trabaje con un microscopio.

4. Determinar los huevos de trematodos en preparaciones, cumplir con las normas de protección laboral, cumplir con las normas de san.-epid. modo.

Estructura de la lección:

Parte teórica:

Ø Microconferencia.

Parte práctica:

Ø Preparación de frotis nativo, frotis de gran tamaño, frotis de Kato, evaluación del rendimiento, microscopía

Microconferencia.

Recogida y entrega de material.

El diagnóstico final de las helmintiasis sólo puede establecerse en base a los resultados investigación de laboratorio. método principal diagnóstico de laboratorio helmintiasis es la detección de huevos o larvas de helmintos en heces, orina, sangre y otros fluidos biológicos durante el examen microscópico. Los materiales para la investigación son heces, contenidos. duodeno, sangre, esputo, tejidos de biopsia y otros materiales.

La recolección de material para la investigación se realiza en platos limpios de vidrio o plástico, la cual se acompaña de una referencia indicando el nombre completo del sujeto. Durante un examen masivo, se permite recolectar heces en vasos de papel encerado, bolsas de plástico.

Las heces para análisis deben entregarse al laboratorio a más tardar un día, y si se sospecha estrongiloidiasis, inmediatamente después de aislarlas. Si se viola esta regla, el diagnóstico relacionado con la destrucción de huevos o larvas a menudo se vuelve difícil o imposible.

Para la identificación de huevos y larvas de algunos tipos de helmintos se utilizan métodos especiales: método de Bormann, raspado perianal, método de frotis con cinta adhesiva, cultivo de larvas en papel filtro (método de Harada y Mori), etc.

Parte práctica:

Los métodos más comunes para examinar las heces para detectar la presencia de huevos de helmintos son los métodos de frotis nativo, frotis grueso bajo celofán y frotis grandes.

Al estudiar los huevos de helmintos bajo un microscopio, es recomendable comparar imagen visible con sus características en el determinante de huevos de helmintos.

Método de frotis nativo

Equipo:

portaobjetos de vidrio;

cubeta ancha;

palos de plástico;

lápiz;

Solución acuosa de glicerina al 50% (mezcle partes iguales de glicerina y agua destilada);

un recipiente con una solución al 0,5% de polidez;

microscopio.

Progreso

1. Organice los portaobjetos en una cubeta, numere los portaobjetos.

2. Aplicar con una pipeta 2 gotas de solución acuosa de glicerina al 50% a una distancia de 4 cm entre sí en portaobjetos de vidrio.

3. Tome un trozo de heces con un palo, del tamaño de la cabeza de un fósforo (30-50 mg), agréguelo a una gota de glicerina y muela hasta obtener una suspensión uniforme.

4. En cada vaso se preparan dos frotis nativos, los cuales no deben fusionarse entre sí y no llegar a los bordes para no manchar los dedos del auxiliar de laboratorio. Se utilizan nuevos palos para cada muestra.

5. Sin cubrir las preparaciones con cubreobjetos, examinar al microscopio (objetivo 8x, ocular 10-15x).

6. Al final del estudio, sumerja las preparaciones en un recipiente con una solución de polidez al 0,5%.

Método de gota gruesa bajo celofán.

El método fue propuesto por K. Kato, M. Miur en 1954. Un frotis es una capa de heces sin diluir sobre un portaobjetos de vidrio, presionada bajo una hoja de celofán higroscópico delgado impregnado con glicerina.

Arroz. Preparación de un frotis grueso bajo celofán:

a - frotis nativo; b - presionando un bulto de heces cubierto con celofán con un tapón de goma; c - una mancha gruesa debajo de celofán (según Yu.A. Berezantsev y E.G. Avtushenko, 1976)

Equipo:

cubeta ancha;

tiras de celofán de 22x30 mm tratadas con mezcla Kato durante 24 horas;

Mezcla Kato (solución al 3% de verde malaquita -6 ml, solución al 6% de fenol - 500 ml, glicerina - 500 ml, 3,5 ml de la mezcla es suficiente para 100 tiras);

grandes tapones de goma;

pinzas anatómicas;

palos de plástico;

lápiz;

microscopio.

Progreso

1. Organice los portaobjetos en una cubeta, numere los portaobjetos.

2. Recoja las heces del tamaño de medio guisante (50-60 mg) con un palito y colóquelas en un portaobjetos de vidrio en el centro.

3. Retire la tira de celofán tratada con Kato del frasco con unas pinzas y colóquela sobre una muestra de heces en un portaobjetos de vidrio.

4. Presione el celofán con un tapón de goma para que las heces se distribuyan de manera uniforme, sin fluir más allá de los bordes de la tira.

5. Deje la preparación hasta que se aclare durante 60 minutos y luego examínela al microscopio (objetivo 8-40x, ocular 10x).

6. Al final del estudio, el medicamento se baja a un recipiente con una solución de polidez al 0,5%.

7. Eliminar lugar de trabajo, Lavar las manos.

Método de frotis grandes.

El método fue propuesto por Yu.A. Berezantsev y E.G. Avtushenko en 1973. La esencia del método se basa en el uso de un microscopio binocular y un frotis nativo en vidrio de 6x9 cm, que permite examinar simultáneamente hasta 200-300 mg de heces.

Equipo:

portaobjetos de vidrio de 6x9 cm y 7x10 cm;

palos de plástico;

Solución de glicerina al 50% (glicerina y agua destilada a partes iguales);

un recipiente con una solución al 0,5% de polidez;

microscopio;

cubeta esmaltada;

lápiz.

Progreso

1. Disponer los portaobjetos de 7x10 cm en una cubeta, numerar los portaobjetos.

2. Luego coloque una segunda diapositiva de 6x9 cm en cada diapositiva.

3. Pipetee 15-20 gotas de solución de glicerol al 50% en un portaobjetos de vidrio de 6x9 cm.

4. Saca un palo diferentes lugares trozos de heces del tamaño de un guisante promedio (200-300 mg) y bájelo en una solución de 50% de glicerol en un portaobjetos de vidrio.

5. Frote un trozo de heces en glicerina con un palo hasta que quede suspendido uniformemente de modo que el área que ocupa sea de unos 33-34 cm 2. No cubra el frotis con cubreobjetos.

6. Coge un cubreobjetos grande de 7x10 cm por los bordes, junto con la mancha grande que tiene (para no ensuciarte los dedos).

7. Examine una mancha grande con un aumento de 34x (objetivo 2x, ocular 17x) y 50x (objetivo 4x, ocular 12,5x). En casos dudosos, los estudios se realizan a gran aumento.

8. Al final del estudio, el medicamento se baja a un recipiente con una solución de polidez al 0,5%.

9. Limpie el lugar de trabajo, lávese las manos.

Con este método de investigación, se determinan los huevos grandes de helmintos (ascáride, tricocéfalo, anquilostoma, oxiuros, tenia ancha, teniid, fascioli). Se ven un poco diferentes y, por lo tanto, se necesita algo de experiencia para detectarlos rápidamente. Se pueden usar hisopos grandes para detectar huevos de esquistosomas y larvas de acné. Un frotis grande contiene de 6 a 10 veces más material de prueba que un frotis nativo. Su eficacia es mucho mayor.

Información similar.

Material para investigación: heces, orina, contenido duodenal, esputo, sangre, piel, dendrita perianal, tejido muscular.

Los métodos de investigación microscópica se basan en la detección de huevos y larvas de helmintos. Dependiendo de los objetivos del estudio, se dividen en cualitativos y cuantitativos.

1. Método de gota gruesa según Kato. El principio del método es que los huevos de helmintos se encuentran en una mancha espesa de heces, se aclaran con glicerina y se tiñen con verde malaquita. El método es más eficaz para la ascariasis, la tricuriasis, la difilobotriasis, la teniidosis y, en menor medida, para la anquilostomiasis y la tenia enana.

3. Método de enriquecimiento(Kofoid - Barbera) se basa en el principio de huevos flotantes en una solución saturada sal de mesa. Puede encontrar huevos de trematodos, tenia ancha, oncósferas, ténidos, huevos no fertilizados de lombrices intestinales.

4. Método Kalantaryan- el principio es el mismo que en el anterior, pero como solución de flotación se utiliza una solución saturada de nitrato de nitrógeno.

5. Existir métodos especiales examen de las heces para detectar la presencia de fascioliasis, estrongiloidiasis, anquilostomiasis.

6. Método preanal y perianal-rectal diagnóstico de enterobiasis. El raspado se realiza por la mañana (antes de ir al baño y defecar) o por la noche durante el sueño.

es muy importante saber

Métodos simples

método macroscópico. Al examinar las heces, se pueden detectar helmintos, sus cabezas, segmentos, fragmentos de estróbilos, que se destacan solos o después de la desparasitación. Este método está especialmente recomendado para la detección de enterobiasis, teniasis y teniarrincosis.

Se mezclan pequeñas porciones de heces con agua en un baño plano o en una placa de Petri y, mirando con buena luz sobre un fondo oscuro, usando una lupa si es necesario, se eliminan los helmintos y todas las formaciones blancas sospechosas con pinzas o una pipeta. El material recolectado se transfiere a otro vaso con agua o sobre un portaobjetos de vidrio en una gota de glicerina diluida o solución isotónica de cloruro de sodio para su estudio posterior.

Con el método de sedimentación, toda la porción de prueba de las heces se debe mezclar con agua en un cilindro de vidrio, luego se debe drenar cuidadosamente la capa superior de agua. Esto se repite varias veces. Cuando el líquido se vuelve transparente, se drena y se observa el precipitado en pequeñas porciones en un baño de vidrio o placa de Petri, como se indicó anteriormente.

Los métodos microscópicos son el principal método de examen de las heces para detectar huevos o larvas de helmintos. Varios métodos estudios se describen a continuación. Para aumentar la confiabilidad del examen, los análisis pueden repetirse varias veces al día o con un intervalo de 1 a 3 días.

Método de frotis nativo. El frotis nativo es el método más común y técnicamente disponible para examinar las heces. En un frotis nativo se pueden encontrar huevos y larvas de helmintos de todo tipo. Sin embargo, con una pequeña cantidad de huevos en las heces, no siempre se encuentran. Por lo tanto, el estudio de las heces solo con la ayuda de un frotis nativo no está completo y debe complementarse con métodos de enriquecimiento. La eficiencia del examen de frotis nativo mejora notablemente cuando se observan cuatro preparaciones preparadas a partir de una muestra fecal en dos portaobjetos de vidrio sin cubreobjetos, lo que permite examinar un total de aproximadamente la misma cantidad de heces que con el método Kato (ver más abajo).

Una pequeña cantidad (del tamaño de la cabeza de un fósforo) de heces revueltas se unta finamente con un palo de madera en la superficie de un portaobjetos de vidrio en una gota de solución de glicerina al 50%. Por lo general, se preparan dos frotis en un vaso. El frotis se observa bajo un microscopio de bajo aumento (ob. 8, ap. 7). En casos dudosos, se cubre con un cubreobjetos y se examina con gran aumento (ob. 40).

Para preparar un frotis nativo grande, se muelen 200-300 mg de heces (del tamaño de un guisante grande) en un vaso de 6x9 cm en 15-20 gotas de una solución acuosa de glicerina al 50%. Visto bajo un microscopio estereoscópico binocular (vol. 4, aprox. 12,5 o vol. 2, aprox. 17) en luz transmitida sin cubreobjetos. En casos dudosos, puede trasladar la lente a un aumento mayor. En tales frotis, los huevos de helmintos grandes y coloreados son claramente visibles, y los huevos transparentes de la tenia pigmea son algo peores. Este método no es adecuado para detectar huevos pequeños. Al mismo tiempo, un gran volumen del material estudiado y un gran campo de visión con una gran profundidad de campo proporcionan una eficiencia significativa de esta modificación en comparación con un frotis nativo convencional.

El frotis de celofán grueso (método de Kato) es más efectivo que el examen de frotis nativo, pero también debe combinarse con métodos de enriquecimiento. Se detectan huevos de todo tipo de helmintos, sin embargo, para detectar huevos de tenia pigmea (huevos transparentes) u opisthorchis (huevos pequeños), el ayudante de laboratorio debe tener especial cuidado de no pasarlos por alto (Fig. 21).

El método se basa en la detección de huevos de helmintos en una gota espesa de heces, clarificadas con glicerina y teñidas con verde malaquita. El celofán hidrófilo se corta preliminarmente en placas de 20 x 40 mm y se sumerge en una mezcla de Kato (6 ml de una solución acuosa al 3% de verde malaquita, 500 ml de glicerol, 500 ml de una solución de fenol al 6%). 3-5 ml de la mezcla son suficientes para 100 platos, que están listos para usar en un día y se pueden almacenar en la misma mezcla en un recipiente bien cerrado a temperatura ambiente durante 6 meses. En ausencia de verde malaquita (recomendado para reducir la fatiga ocular del ayudante de laboratorio) y fenol ( desinfectante) puede usar solo una solución acuosa de glicerol al 50%, la efectividad del estudio no se reduce.

Arroz. 20. Método para preparar una gota gruesa de heces con celofán según Kato

Se aplican 100 mg de excremento a un portaobjetos de vidrio, se cubre con una placa de celofán tratada como se indicó anteriormente y se presiona con un tapón de goma para que el excremento no se extienda por debajo del celofán. La microscopía a bajo o alto aumento del microscopio se lleva a cabo a más tardar 1 hora (en clima cálido, 30-40 minutos) después de la preparación del frotis. El motivo de la opacidad de la preparación puede ser una capa gruesa de heces, un procesamiento deficiente de la placa en la mezcla de Kato, un tiempo de exposición insuficiente de la preparación bajo celofán. El aclarado prolongado con glicerina y el secado excesivo de la preparación también dificultan la detección de huevos.

Método de torsión según S.S. Shulman. El método fue propuesto para la detección de larvas de helmintos en las heces, principalmente Strongyloid. Solo se examinan las heces recién excretadas, de las cuales 2-3 g se transfieren a un frasco de vidrio, se agita con una varilla de vidrio en un movimiento circular con 3-5 veces la cantidad de solución salina, sin tocar las paredes del recipiente. En el centro se acumulan huevos y larvas de helmintos. Después de mezclar, la gota en el extremo de la barra se transfiere rápidamente a un portaobjetos de vidrio, se cubre con un cubreobjetos y se examina bajo un microscopio.

métodos de enriquecimiento. Los métodos de enriquecimiento se basan en la diferencia de la gravedad específica de los huevos y la solución salina utilizada, lo que permite detectar una pequeña cantidad de ellos. Si la gravedad específica de los huevos es mayor que la gravedad específica del líquido, entonces los huevos se concentran en el sedimento, que se examina bajo un microscopio. Este método de sedimentación se utiliza para los huevos de trematodos. Con una mayor gravedad específica de la solución, los huevos flotan hacia la superficie del líquido y luego se examina la película. Estos son métodos de flotación (flotación), son más efectivos para detectar huevos de anquilostoma, tricocéfalo y tenia pigmea.

métodos de flotación. El método Fulleborn se basa en la flotación de huevos de helmintos en una solución saturada de cloruro de sodio, que tiene una densidad relativa alta (1,2), lo que permite detectar huevos con un número reducido de ellos. El método es más efectivo que estudiar un frotis nativo, aunque es más difícil. Las ventajas del método son el bajo costo y la disponibilidad. Se recomienda combinar el estudio del frotis nativo y el método Fülleborn.

Se prepara una solución saturada disolviendo 400 g de cloruro de sodio en 1 litro de agua mientras hierve. La densidad relativa de la solución es 1.18-1.22. La solución se almacena en una botella cerrada. Para el análisis, se colocan 2-3 g de heces en un frasco con un volumen de 30-50 ml y, mientras se agita con un palo, se agrega una solución saturada de cloruro de sodio casi hasta la parte superior. Una tira de papel elimina rápidamente las partículas grandes flotantes. Después de 45-60 min. sedimentando con un asa de alambre, retire la película superficial y transfiérala a un portaobjetos de vidrio en una gota de solución acuosa de glicerol al 50%. En lugar de quitar la película con un bucle, puede agregar la solución en el frasco en la parte superior, cubrir con un portaobjetos de vidrio, a cuya superficie se adhieren los huevos flotantes. Se están preparando varios preparados. Además, se observan de 2 a 4 preparaciones del sedimento, recogiéndolas con una pipeta ocular en 2 portaobjetos de vidrio. Además de la película superficial, también es necesario examinar el sedimento, ya que en esta solución no flotan los huevos de trematodos, teniidos, huevos de áscaris no fertilizados. Los huevos de varios helmintos no flotan inmediatamente en una solución salina. Entonces, si la cantidad máxima de huevos de la tenia pigmea flota después de 15 a 20 minutos, entonces ascaris, después de 1,5 a 2 horas, látigo, después de 2 a 3 horas.

Por lo tanto, las ventajas de este método incluyen su bajo costo y disponibilidad, las desventajas son la necesidad de ver las preparaciones en la película superficial y el sedimento, así como la duración de la sedimentación.

El método de E. V. Kalantaryan también es un método de enriquecimiento, pero es más eficiente y más simple que el método Fülleborn. Se utiliza una solución saturada de nitrato de sodio con una densidad relativa de 1,38. Por lo tanto, los huevos de la mayoría de los helmintos flotan y se encuentran en la película superficial; no es necesario examinar los sedimentos.

Para preparar una solución saturada de nitrato de sodio, se disuelve 1 kg de sal de nitrato de sodio (nitrato de sodio) en 1 litro de agua y se hierve hasta que se disuelva por completo y se forme una película en la superficie. Sin filtración, vierta en una botella seca. En ausencia de nitrato de sodio, se puede reemplazar con nitrato de amonio (nitrato de amonio), disolviendo 1,7 kg por 1 litro de agua. La densidad relativa de la solución resultante es 1,3, lo que reduce un poco la eficiencia en comparación con la solución de nitrato de sodio.

Ventajas del método: los huevos de la mayoría de los helmintos emergen rápidamente y se encuentran en la película superficial, lo que elimina la necesidad de estudiar el sedimento. Las desventajas del método son la deficiencia de nitrato de sodio, así como el hecho de que los huevos de trematodos, las oncosferas de teniidos no flotan y permanecen en el sedimento. Debe tenerse en cuenta que con la exposición prolongada (más de 1-2 horas) de heces en una solución, los huevos de algunos helmintos comienzan a hincharse y asentarse, desapareciendo de la película superficial.

métodos de sedimentación

El método de P. P. Goryachev se basa en el principio de la sedimentación del huevo. El frotis en este caso es ligero, sin impurezas gruesas, lo que facilita la detección de pequeños huevos de trematodos (opistorquia, etc.). La gravedad específica de los huevos de opistorco es alta, por lo que no flotan en soluciones salinas.

Se vierten 70-100 ml de una solución saturada de cloruro de sodio en un cilindro con un diámetro de 2-3 cm. Por separado, revuelva bien 0,5 g de heces en 20-25 ml de agua y filtre con cuidado a través de un embudo con dos capas de gasa en un cilindro en solución salina, evitando mezclar (de manera que se formen dos capas claramente delimitadas). Después de 2-3 horas, la capa superior con heces se succiona con una pipeta y la solución salina restante se deja reposar durante 12-20 horas o se centrifuga. El precipitado se pipetea sobre un portaobjetos de vidrio, se cubre con un cubreobjetos y se observa al microscopio.

El método de Goryachev se propuso para la detección de huevos de opistorca y demostró ser más efectivo que el examen de frotis nativo y el método Fülleborn. Actualmente, para el diagnóstico de opistorquiasis (clonorquiasis), se recomiendan los métodos de Kato y Kalantaryan como bastante efectivos y técnicamente más simples.

Método Krasilnikov. Bajo la influencia de los tensioactivos, que forman parte de detergentes(detergentes), los huevos de helmintos se liberan de las heces y se concentran en el sedimento.

Preliminarmente se prepara una solución al 1% de detergente en polvo Lotus. Para ello, se disuelven 10 g de polvo en 1 litro. agua del grifo. En ausencia de "Lotus" puedes usar otros detergentes en polvo, pero cada uno de ellos debe tomarse tanto como se disuelva sin la formación de un precipitado en 1 litro de agua del grifo. Se vierten 20-30 ml de solución de detergente en un recipiente de vidrio con una capacidad de 30-50 ml, se coloca allí una pequeña porción de excremento y se mezcla bien. La proporción de heces y solución debe ser de aproximadamente 1:20. Las heces deben estar en la solución durante al menos un día. Durante este tiempo, se forma un sedimento de 2-3 capas en el fondo. La capa inferior consiste en partículas gruesas y pesadas, los huevos de helmintos se acumulan en la capa intermedia, la capa superior son copos de color gris blanquecino. Luego, con una pipeta, se recogen 2-3 gotas de líquido de la capa intermedia y se transfieren a un portaobjetos de vidrio. Se preparan 2 preparaciones en un vaso, se cubren con un cubreobjetos y se observan al microscopio.

El método Krasilnikov le permite detectar huevos de todo tipo de helmintos excretados con heces.

El método de sedimentación con éter-formalina y el método de sedimentación química son muy laboriosos y de gran eficacia, especialmente en los exámenes de masas, por lo que es más conveniente utilizar el método del éter-acético. Permite, tras un procesamiento adicional del sedimento con reactivos químicos, obtener en él prácticamente solo huevos de helmintos, lo que facilita la identificación de pequeños huevos de trematodos. Este método resultó ser universal, revelando los huevos de todos los helmintos intestinales, quistes de protozoos intestinales, también puede usarse para cuantificación intensidad de invasión.

Vierta 7 ml de una solución al 10 % en tubos graduados de centrífuga. ácido acético y agregue 1 g de heces hasta la marca de 8 ml. Las heces se mezclan bien con un palo hasta que se forme una mezcla homogénea, y luego se filtran a través de dos capas de gasa en otro tubo de centrífuga (de modo que el nuevo tubo de la solución filtrada tenga nuevamente 8 ml, si es menos, entonces puede enjuagar adicionalmente el embudo con un vendaje con una solución de ácido acético al 10%, a través de quien filtró la solución fecal). A este tubo agregar 2 ml de éter (hasta la marca de 10 ml), tapar y agitar enérgicamente durante 30 segundos. La mezcla se centrifuga a 3000 rpm durante 1 minuto (o 2 minutos a 1500 rpm). La capa de coagulante (en forma de corcho en la parte superior del tubo) se separa de las paredes del tubo con un palo y se escurre cuidadosamente junto con el sobrenadante. El precipitado (generalmente pequeño, incoloro) se aplica a portaobjetos de vidrio con una pipeta, se cubre con un cubreobjetos y se observa al microscopio.

La mayoría de las veces, la infección con helmintos ocurre a través de alimentos y agua contaminados y también a través de manos sin lavar.

Métodos directos e indirectos para el diagnóstico de helmintiasis.

Hasta la fecha, se han desarrollado muchos métodos diagnóstico helmintiasis, pero todas ellas se pueden dividir en dos grandes grupos: directo e indirecto. Los métodos de diagnóstico directo incluyen aquellos estudios que le permiten identificar directamente los helmintos, sus fragmentos, larvas o huevos. Los métodos indirectos para diagnosticar helmintiasis se basan en la identificación de cambios secundarios característicos de una variedad particular de helmintiasis.

Los métodos directos más populares para el diagnóstico de helmintiasis son los métodos de investigación macro y microhelmintoscópicos.

Métodos de investigación macrohelmintoscópica

Preguntas de los lectores

18 de octubre de 2013, 17:25 Buenas tardes. Desde hace aproximadamente un año he estado sintiendo picazón alrededor del ano. Ninguna dolor. Dime a quien contactar y que puede ser? Gracias

Hacer una pregunta

Métodos de investigación de microhelmintoscopia.

Métodos de investigación inmunológica.

El diagnóstico de las helmintiasis se basa en la detección de anticuerpos específicos contra ciertos helmintos en el suero sanguíneo. Para los estudios inmunológicos se utiliza el método de hemaglutinación indirecta, inmunoensayo enzimático, inmunoelectroforesis, inmunoabsorción y otros métodos serológicos de análisis de sangre.

Los métodos de investigación inmunológica se utilizan para diagnosticar alveococosis, equinococosis, cisticercosis, ascaridiasis, esquistosomiasis y otras helmintiasis.

Análisis de contenido biliar y duodenal

Biopsia

Diagnóstico de electropunción

El diagnóstico de electropunción se basa en el análisis de la resistencia de la piel cuando está irritada por su débil descarga eléctrica. El diagnóstico de electropunción para sospecha de helmintiasis se puede realizar de dos maneras: por el método Voll o por prueba de resonancia.

Métodos de investigación instrumentales

Con helmintiasis, también se lleva a cabo. procedimiento de ultrasonido, FEDGS y diagnósticos por computadora. Estos métodos le permiten determinar el grado de daño causado por los helmintos, así como determinar la condición de los órganos individuales.