วิธีการใช้ในการหาปริมาณกรดอะมิโน ปฏิกิริยาเชิงคุณภาพต่อกรดอะมิโน, เปปไทด์, โปรตีน วิธีการหากรดอะมิโน

วิธีการหากรดอะมิโน

กรดอะมิโนมีอยู่ทางชีวภาพ สารออกฤทธิ์พวกเขามีบทบาทสำคัญในชีวิตของร่างกายมนุษย์ พวกเขาใช้กันอย่างแพร่หลายเป็น ยา- บางชนิดมีความจำเป็นและเข้าสู่ร่างกายด้วยอาหาร ในปัจจุบัน มีวิธีการหลายวิธีในการตรวจวัดปริมาณกรดอะมิโนในวัสดุจากพืชสมุนไพร ได้แก่ ยาและของเหลวชีวภาพในผลิตภัณฑ์อาหาร

จากวิธีการที่หลากหลายในการตรวจวัดเชิงปริมาณของกรดอะมิโนในวัตถุต่าง ๆ สามารถจำแนกกลุ่มหลักได้สี่กลุ่ม: วิธีการวิเคราะห์โครมาโตกราฟี, สเปกโตรโฟโตเมทริก, ไทไตรเมทริกและเคมีไฟฟ้า

วิธีโครมาโตกราฟี

ในช่วงหลายทศวรรษที่ผ่านมา มีความก้าวหน้าที่สำคัญในด้านโครมาโทกราฟีแบบแก๊ส-ของเหลวของกรดอะมิโน มีการเสนอวิธีการที่ใช้คอลัมน์ไมโครแพ็ค ซึ่งช่วยให้ทำได้ค่อนข้างมาก เวลาอันสั้นแยกกรดα-อะมิโนที่สำคัญทางชีวภาพได้เกือบทั้งหมด 17 ชนิด

วิธีการได้รับการพัฒนาเพื่อตรวจวัดกรดอะมิโนโดยใช้โครมาโทกราฟีแบบแก๊ส-ของเหลวในตัวอย่างซีรั่ม พลาสมา ปัสสาวะ และน้ำไขสันหลัง โดยอาศัยการเตรียม 2,3,4,5,6-pentafluorobenzoyl-isobutyl ethers ตามด้วยการแยก บนคอลัมน์โพลีไดเมทิลไซล็อกเซนในโหมดการตั้งโปรแกรมอุณหภูมิตั้งแต่ 140° C ถึง 250°C ด้วยเครื่องตรวจจับไอออไนเซชันเปลวไฟ เวลาการแยกโครมาโตกราฟีคือ 28 นาที จากผลการวิจัยพบว่าสามารถแยกกรดอะมิโนได้ 27 ชนิด

แม้จะมีวิธีโครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงหลากหลายวิธีสำหรับการวิเคราะห์กรดอะมิโน แต่วิธีที่รวดเร็วและเข้าถึงได้มากที่สุดคือเวอร์ชันรีเวิร์สเฟสพร้อมการตรวจจับสเปกโตรโฟโตเมตริก เพื่อการแยกและการตรวจจับที่ประสบความสำเร็จ กรดอะมิโนจะถูกแปลงเป็นอนุพันธ์ที่ไม่ชอบน้ำและดูดซับแสง ซึ่งก็คือ การดำเนินการแปลงสภาพก่อนคอลัมน์ อัลดีไฮด์ออร์โธฟทาลิก, แนฟทาลีน-2,3-ไดคาร์บอกซีอัลดีไฮด์ และ 9-ฟลูออเรนิลเมทิลคลอโรฟอร์เมตถูกใช้เป็นรีเอเจนต์การเกิดอนุพันธ์

วิธีการได้รับการพัฒนาสำหรับการตรวจวัดเชิงปริมาณของ L-cystine, L-glutamic acid และ glycine ในยา "Eltacin" ซึ่งมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระร่วมกับฤทธิ์ต้านมะเร็ง กรดกลูตามิกและไกลซีนถูกกำหนดหาโดยโครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงแบบรีเวิร์สเฟสหลังการแปลงอนุพันธ์ก่อนคอลัมน์ด้วยรีเอเจนต์ออร์โธฟทาลิกดีไฮด์/N-อะซิติล-แอล-ซิสเทอีน ผู้เขียนระบุว่าการเกิดอนุพันธ์ของซิสเทอีนเป็นเรื่องยากเนื่องจากความไม่แน่นอนของกรดอะมิโนและอนุพันธ์ที่เกิดขึ้น ดังนั้นการวิเคราะห์ซิสเทอีนจึงดำเนินการโดยการไตเตรทแบบโบรมาโตเมตริก พบว่าการมีอยู่ของซิสเทอีนในปริมาณที่มีนัยสำคัญในตัวอย่างไม่รบกวนการกำหนดผลิตภัณฑ์อนุพันธ์ของไกลซีนและกรดกลูตามิกด้วยรีเอเจนต์ออร์โธฟทาลิกอัลดีไฮด์/N-acetyl-L-cysteine ​​​​ วิธีการนี้โดดเด่นด้วยความสามารถในการทำซ้ำสูงและความแม่นยำในการพิจารณา

ความเป็นไปได้ของการใช้ 4,7-ฟีแนนโทรลีน-5,6-ไดโอน (ฟานควิโนน) เป็นรีเอเจนต์การติดฉลากฟลูออโรเจนิกสำหรับการสร้างอนุพันธ์ของสารก่อนคอลัมน์เพื่อจุดประสงค์ในการแยกและการวิเคราะห์เชิงปริมาณของกรดอะมิโนโดยโครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงคือ สอบสวน เมื่อไม่มีการเรืองแสงจากภายใน แฟนควิโนนจะทำปฏิกิริยากับกลุ่มอะมิโนของกรดอะมิโน (ที่ 68 °C เป็นเวลา 160 นาที) ทำให้เกิดอิมิโนควิโนล ซึ่งวัดการเรืองแสงที่ความยาวคลื่น 460 นาโนเมตร อนุพันธ์ที่แยกได้ถูกระบุโดยสเปกตรัม Tm, IR, มวล และ PMR โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงดำเนินการบนโครมาโตกราฟีด้วยเครื่องตรวจจับฟลูออเรสเซนต์และคอลัมน์ที่มีการชะล้างแบบไล่ระดับที่มีส่วนผสมของ: สารละลายไตรเอทิลลามีน - บัฟเฟอร์ฟอสเฟต (pH 3) - เมทานอล ควินิดีนถูกใช้เป็นมาตรฐานภายใน วิธีการนี้มีแนวโน้มค่อนข้างดีในห้องปฏิบัติการขนาดใหญ่ และสามารถเสนอเพื่อการวิเคราะห์กรดอะมิโนในรูปแบบยาสำเร็จรูปได้

เทคนิคโครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงพร้อมไบโอเซนเซอร์โพเทนชิโอเมตริกสำหรับการวัดปริมาณไลซีนได้รับการพัฒนา ไบโอเซนเซอร์ถูกสร้างขึ้นโดยการติดเมมเบรนที่มีไลซีนออกซิเดสเข้ากับอิเล็กโทรด NH4+ แบบคัดเลือกไอออน แอมโมเนียมไอออนที่เกิดขึ้นระหว่างการย่อยสลายไลซีนของเอนไซม์จะถูกตรวจพบด้วยวิธีโพเทนชิโอเมตริก วิธีโครมาโตเดนซิโตเมตริกเอ็กซ์เพรสสำหรับการวิเคราะห์ทริปโตเฟนในของเหลวเพาะเลี้ยงได้รับการพัฒนาขึ้น โครมาโทกราฟีแบบชั้นบางถูกดำเนินการบนเพลตซอร์บฟิล โครมาโตกราฟีถูกดำเนินการในระบบโพรพานอล-2 - สารละลายแอมโมเนียมไฮดรอกไซด์ 25% (7:3) เป็นเวลา 25 นาที โครมาโตกราฟีถูกทำให้แห้งที่อุณหภูมิห้องและเก็บไว้ที่ 120°C เป็นเวลา 15 นาที ในการตรวจจับจุดบนโครมาโตแกรม มีการใช้รีเอเจนต์เฉพาะ - 4-ไดเมทิลอะมิโนเบนซาลดีไฮด์ ซึ่งคัดเลือกสำหรับวงแหวนอินโดลของทริปโตเฟน ในรูปของสารละลายเอธานอล 0.5% พร้อมเติมกรดซัลฟิวริกเข้มข้น 5% หลังจากพัฒนาโครมาโตกราฟีโดยการแช่ในเทฟลอนคิวเวตด้วยสารละลาย 4-ไดเมทิลอะมิโนเบนซาลดีไฮด์ที่เตรียมไว้ใหม่ พวกเขาจะถูกเก็บไว้เป็นเวลา 5-7 นาทีที่อุณหภูมิ 110 องศาเซลเซียส การสแกนจุดทริปโตเฟนดำเนินการที่ความยาวคลื่น 625 นาโนเมตรบนเครื่องวัดความหนาแน่นของวิดีโอคอมพิวเตอร์ วิธีการที่พัฒนาขึ้น แม้จะมีความแม่นยำสูงในการกำหนดและความสามารถในการผลิต แต่ก็ใช้เฉพาะกับทริปโตเฟน

สำหรับการวิเคราะห์กรด β-อะมิโนในของเหลวชีวภาพ ยา และผลิตภัณฑ์อาหาร วิธีการอิเล็กโตรโฟเรซิสแบบคาปิลลารีถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลาย โดยอาศัยการแยกส่วนประกอบของส่วนผสมที่ซับซ้อนในเส้นเลือดฝอยควอทซ์ภายใต้อิทธิพลของสนามไฟฟ้าที่ใช้ เนื่องจากกรดอะมิโนมีลักษณะเป็นสวิตเตอร์ไอออน จึงสามารถแยกพวกมันออกได้โดยใช้สารละลายบัฟเฟอร์อิเล็กโทรไลต์ที่มีค่า pH ที่เหมาะสม โดยส่วนใหญ่มักใช้บัฟเฟอร์การแยกแบบพื้นฐานและเป็นกลาง

เพื่อเพิ่มความจำเพาะและความไวของวิธีอิเล็กโตรโฟรีซิสของคาปิลลารีสำหรับการวิเคราะห์กรด β-อะมิโนแต่ละตัว จึงมีการใช้อนุพันธ์เบื้องต้นของพวกมัน ตามด้วยการแยกในคาปิลลารีของควอตซ์และการกำหนดสเปกโตรโฟโตเมตริกของผลิตภัณฑ์ที่ทำปฏิกิริยา ดังนั้น 9-ฟลูออเรนิล เมทิล ฟอร์เมต, 9-(2-คาร์บาโซล)-เอทิล คลอโรฟอร์เมต และสีย้อมไซยานีนจึงถูกใช้เป็นสารอนุพันธ์ แนวโน้มของวิธีการนี้เนื่องมาจากข้อดี เช่น การวิเคราะห์ที่รวดเร็ว ความง่ายในการเตรียมตัวอย่าง การใช้รีเอเจนต์ต่ำ และความเรียบง่ายในการใช้เครื่องมือ

และโปรตีน

เป็นที่ทราบกันดีว่ากรด Canonical α-amino ทั้ง 20 สายพันธุ์มีโครงสร้างเหมือนกัน โดยมีกลุ่มฟังก์ชันสามกลุ่ม (รูปที่ 3.3) น่าเสียดายที่ปฏิกิริยาต่อกลุ่มอะมิโนและคาร์บอกซีนั้นไม่เฉพาะเจาะจงมากนัก ตามลำดับ เป็นคุณลักษณะของเอมีนทั้งหมด เอไมด์จำนวนหนึ่งและ กรดคาร์บอกซิลิก- เช่นเดียวกับกับอนุมูลส่วนใหญ่ = R โดย 10 ในจำนวนนั้นไม่มีขั้ว กล่าวคือ แสดงโดยกลุ่มอะลิฟาติก = ไฮโดรคาร์บอน ซึ่งส่วนใหญ่เป็นสารเฉื่อยทางเคมี ความจำเพาะของกรดอะมิโนโพลาร์ R ส่วนใหญ่ซึ่งประกอบด้วยแอลกอฮอล์ (Ser, Tre, Tyr), เอไมด์ (Asn, Gln) และกลุ่มคาร์บอกซี (Asp, Glu) ก็ค่อนข้างต่ำเช่นกัน กลุ่มอะมิโน (Lys), imidazole His และกลุ่ม guanidino Arg มีความกระตือรือร้นมากกว่า และกิจกรรมของกลุ่ม thio Cys นั้นสูงสุด จึงยิ่งใหญ่ที่สุด ความสำคัญในทางปฏิบัติในด้านคุณภาพและ การวิเคราะห์เชิงปริมาณกรด α-อะมิโน รวมถึงในเครื่องวิเคราะห์กรดอะมิโน ได้รับปฏิกิริยานินไฮดรินสากล ซึ่งมีความจำเพาะสำหรับการมีอยู่พร้อมกันของทั้งหมู่อะมิโนและหมู่คาร์บอกซีที่อะตอม α-C

ข้าว. 3.3. สูตรทั่วไปสำหรับโครงสร้างของกรด α-amino และผลิตภัณฑ์ของการเกิดพอลิเมอไรเซชัน คำอธิบายในข้อความ

การเกิดพอลิเมอไรเซชันของกรดα-อะมิโนในโครงสร้างของเปปไทด์และโปรตีน (รูปที่ 3.3) ยังคงรักษาประเภท R ทั้งหมดไว้ แต่:

1. ปฏิกิริยานินไฮดรินกลายเป็นลบเพราะว่า ยกเว้นกลุ่ม N- และ C-terminal กลุ่มα-amino และα-carboxy ถูกใช้ไปกับการก่อตัวของพันธะเปปไทด์ ปฏิกิริยานินไฮดรินเชิงบวกกับโปรตีนมีแนวโน้มมากที่สุดบ่งชี้ว่ามีสิ่งเจือปนของกรดอะมิโนในสารเตรียมหรือภาชนะ

2. สำหรับเปปไทด์และโปรตีนทั้งหมด ปฏิกิริยาไบยูเรตจะจำเพาะต่อกลุ่มเปปไทด์ที่ไม่มีกรดอะมิโนโมโนเมอร์

3. จากปฏิกิริยาที่เฉพาะเจาะจงมากขึ้นต่อกรดอะมิโน R สิ่งต่อไปนี้มีประโยชน์: ปฏิกิริยาแซนโทโปรตีนกับกรดไนตริกเข้มข้นต่ออะโรมาติก R Fen, Tyr, Tri; ปฏิกิริยากับอิซาตินบนวงแหวน Pro ที่มีสมาชิกห้าส่วน เช่นเดียวกับปฏิกิริยากับอิมิดาโซล R His, กลุ่มไทโอ Cys และกลุ่มกัวนิดิโน Arg สิ่งสำคัญคือต้องคำนึงว่า R บางส่วนซ่อนอยู่ในโกลบูลโปรตีนดังนั้นปฏิกิริยาเชิงคุณภาพต่อพวกมันจึงอ่อนแอลง ดังนั้นก่อนที่จะดำเนินการโปรตีนมักจะถูกทำให้เสียสภาพไม่ทางใดก็ทางหนึ่ง

4. แตกต่างจากสารละลายที่แท้จริงของกรดอะมิโนตรงที่สารละลายคอลลอยด์ของโปรตีนมีลักษณะเฉพาะ ปฏิกิริยาตะกอนเกี่ยวข้องกับการทำลายเปลือกไฮเดรชั่นและเป็นผลให้ความสามารถในการละลายลดลงภายใต้อิทธิพลของสารกำจัดน้ำ: เกลือที่เป็นกลาง = การเติมเกลือ, เมทานอล = MeOH, เอทานอล = EtOH, อะซิโตน, ยูเรีย และสารอื่น ๆ

เมื่อทำปฏิกิริยาเชิงคุณภาพ คุณควร:

1. ปฏิบัติตามกฎความปลอดภัยจากอัคคีภัยอย่างระมัดระวังและทำงานกับกรดและด่างเข้มข้น = EZh

2. ทำเครื่องหมายหลอดทดลอง 2 แถวด้วยกราฟแก้วหรือปากกาสักหลาด แล้ววางสารละลายกรดอะมิโน 1% ไม่เกิน 0.5 มล. (2-5 หยด) ลงในหลอดใดหลอดหนึ่ง และให้มีปริมาตรเท่ากันเท่ากับ 1 สารละลายโปรตีน % ในอีกทางหนึ่ง

3. ในหลอดทดลองคู่ที่มีสารละลายกรดอะมิโนและโปรตีน ให้เติมรีเอเจนต์ที่เกี่ยวข้อง 3-5 หยดพร้อมกัน และดำเนินการตามขั้นตอนที่เหลือซึ่งระบุไว้สำหรับปฏิกิริยาที่เกี่ยวข้อง

4. หากจำเป็นต้องให้ความร้อนแก่หลอดทดลอง ให้ถอดฝาเบ้าหลอมออกแล้วจุดไฟเชื้อเพลิงแห้งด้วยไม้ขีด จากนั้น ยึดหลอดทดลองเข้ากับที่ยึด ซึ่งมีการออกแบบแบบดั้งเดิมที่ไม่น่าเชื่อถืออย่างยิ่ง ดังนั้นจึงเป็นการดีกว่าที่จะห่อหลอดทดลองสองสามหลอดด้วยกระดาษแผ่นหนึ่งพับเป็นแถบแล้วจับไว้ นิ้วหัวแม่มือให้ผ่านครึ่งล่างของหลอดทดลองผ่านเปลวไฟเท่าๆ กัน เลี่ยงการชี้คอเพื่อนบ้านจนทำให้น้ำยาเดือดอย่างรุนแรง- หลังจากเสร็จสิ้นการทำงาน ให้ดับเปลวไฟทันทีโดยใช้ฝาถ้วยใส่ตัวอย่าง

5. ผลลัพธ์ของการทดลองจะถูกร่างขึ้นตามเทมเพลต เรื่องการแพร่กระจายของสมุดบันทึกห้องปฏิบัติการในรูปแบบตาราง:

6. เมื่อพิจารณาผลที่ได้รับแล้วและเมื่อทำแบบแผนเสร็จสิ้นพร้อมชั้นวางหลอดทดลองแล้วนำเสนอต่อครูเพื่อป้องกัน

1. ปฏิกิริยานินไฮดรินจากการดีอะมิเนชันและดีคาร์บอกซิเลชันของกรด α-อะมิโนด้วยสารละลายแอลกอฮอล์ของนินไฮดริน:

แอมโมเนียที่เกิดขึ้นซึ่งทำปฏิกิริยากับนินไฮดรินสองโมเลกุลก่อให้เกิดอนุพันธ์ที่มีสีโดยมีการดูดซับสูงสุดที่ 540 นาโนเมตร (สำหรับ Pro - 440 นาโนเมตร)

ความก้าวหน้าของงาน: เติม 0.5% 3-5 หยดลงในตัวอย่างทดสอบ สารละลายแอลกอฮอล์นินไฮดริน ค่อยๆ ให้ความร้อนแก่หลอดทดลองโดยใช้ส่วนผสมบนเปลวไฟ และหลังจากผ่านไป 2-3 นาที ให้บันทึกลักษณะที่ปรากฏของสี

2. ปฏิกิริยาแซนโทโปรตีนดังที่ได้กล่าวไว้ข้างต้นมันขึ้นอยู่กับการก่อตัวของอนุพันธ์ไนโตรของกรดอะมิโนด้วยอะโรมาติก R: Fen, Tyr, Tri

ความก้าวหน้าของงาน: เมื่อเปิดร่างของตู้ดูดควัน ค่อยๆ เติมกรดไนตริกเข้มข้น (HNO 3) สองสามหยดลงในหลอดทดลองที่มีสารละลายทดสอบ ค่อยๆ ให้ความร้อนหลอดทดลองบนเปลวไฟ หลีกเลี่ยงการชี้คอไปที่เพื่อนบ้าน และบันทึกการพัฒนาของสี

3. ปฏิกิริยาไนโตรปรัสไซด์มันขึ้นอยู่กับการไฮโดรไลซิสอัลคาไลน์ของซิสเตอีนกรดอะมิโนที่มีกำมะถันโดยการปล่อยโซเดียมซัลไฟด์ (Na 2 S) ซึ่งให้สีแดงที่ซับซ้อนด้วยสารละลายโซเดียมไนโตรปรัสไซด์ที่เตรียมสดใหม่

ความคืบหน้าการทำงาน:เติมโซเดียมไฮดรอกไซด์ 20% ในปริมาตรเท่ากันลงในหลอดทดลองทั้งสองหลอดด้วยสารละลายทดสอบ 5-10 หยด และต้มเป็นเวลาอย่างน้อย 3-5 นาที เติมสารละลายโซเดียมไนโตรปรัสไซด์ 3-5 หยดลงในหลอดทดลอง และบันทึกการพัฒนาของสี

4. ปฏิกิริยาไบยูเรตขึ้นอยู่กับการก่อตัวของพันธะเปปไทด์ที่มีสีของพันธะเปปไทด์กับไอออน Cu 2+ ในสภาพแวดล้อมที่เป็นด่าง ทำหน้าที่เป็นการทดสอบสากลในการระบุเปปไทด์และโปรตีนในสารละลาย เนื่องจากจำนวนพันธะเปปไทด์เพิ่มขึ้น ความเข้มของสีของสารละลายจึงเพิ่มขึ้นเป็นเส้นตรง จึงมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการวัดความเข้มข้นของโปรตีนด้วยโฟโตเมตริก

ความก้าวหน้าของงาน- เติมสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ 10% ในปริมาณเท่ากันลงในหลอดทดลองที่มีสารละลายทดสอบ 5-10 หยด ผสมให้เข้ากันแล้วเติมสารละลายคอปเปอร์ซัลเฟต 1% 2 หยด (CuSO 4) ผสมตัวอย่างและบันทึกการพัฒนาสีหลังจากนั้นไม่กี่นาที

5. การทดสอบการเดือดขึ้นอยู่กับการสูญเสียสภาพเนื่องจากความร้อนของโปรตีน

ความก้าวหน้าของงาน- ทำให้หลอดทดลองทั้งสองเป็นกรดด้วยสารละลายทดสอบ โดยมีสารละลายกรดอะซิติก 1% (AcOH) ไม่เกิน 1 หยดและให้ความร้อนจนเดือด หลังจากต้มสารละลายไว้ประมาณ 2-3 นาที ให้บันทึกผลและอธิบายกลไกการเกิดปรากฏการณ์

6. การตกตะกอนด้วยเกลือของโลหะหนัก(เม๊ะ) . คุณสมบัติในการทำให้เสียสภาพนั้นขึ้นอยู่กับความสามารถของไอออนบวก Me หนักในการทำปฏิกิริยากับกลุ่มฟังก์ชัน R ของโมเลกุลโปรตีน: ไทโอ- อะมิโน- คาร์บอกซี- และอะโรมาติก นอกจากนี้ประจุลบที่รุนแรงยังทำให้เกิดการชาร์จประจุของกลุ่มไอออนิกในโมเลกุลโปรตีนซึ่งจะทำลายพันธะไอออนิกในพวกมัน

ความก้าวหน้าของงาน- เติมสารละลายคอปเปอร์ซัลเฟต 5% (CuSO 4) สองสามหยดลงในหลอดทดลองทั้งสองหลอดด้วยสารละลายทดสอบ บันทึกและอธิบายผลลัพธ์ที่ได้รับ

7. การตกตะกอนด้วยกรดอินทรีย์ขึ้นอยู่กับการเปลี่ยนสภาพของกรดในโปรตีนและการก่อตัวของอนุพันธ์โควาเลนต์ของกลุ่มไทโอ อะมิโน และอะโรมาติกของกรดอะมิโน R ที่มีออร์กาโนคลอรีน

ความก้าวหน้าของงาน- เติมสารละลายกรดไตรคลอโรอะซิติก (TCA) 10% สองสามหยดลงในหลอดทดลองที่มีสารละลายทดสอบ และบันทึกผลลัพธ์หลังจากนั้นไม่กี่นาที

อุปกรณ์และรีเอเจนต์: กระดาษโครมาโตกราฟี ห้องโครมาโตกราฟี โฟโตอิเล็กทริคคัลเลอริมิเตอร์ กรรไกร; จานแก้ว (3'32 ซม.) - 3 ชิ้น; ผู้ถือโครมาโตกราฟี; ตู้อบแห้ง; ไมโครปิเปต; หลอดทดลองที่มีสต็อปเปอร์กราวด์ บิวเรตต์ 25 มล. ส่วนผสมมาตรฐานของกรดอะมิโน ทดสอบส่วนผสมของกรดอะมิโน บิวทานอล, กรดอะซิติก, น้ำในอัตราส่วน 15:3:7; สารละลายนินไฮดริน 1% ในอะซิโตน 95% เอทิลแอลกอฮอล์ (75%) อิ่มตัวด้วยคอปเปอร์ซัลเฟต

การทำงานให้เสร็จ

หยิบกระดาษโครมาโตกราฟีขนาด 18 x 28 ซม. หนึ่งแผ่นแล้ววาดเส้นแนวนอนด้วยดินสอธรรมดาที่ระยะห่าง 3 ซม. จากขอบด้านสั้น จากนั้นแบ่งออกเป็นส่วนที่ไม่เท่ากันตามแผนภาพที่แนบมาและขอบเขตของการใช้สารผสมมาตรฐานและสารทดสอบจะถูกทำเครื่องหมายด้วยลูกศรและจารึกที่เกี่ยวข้องด้วยดินสอง่ายๆ

กระดาษถูกเสริมให้แข็งแรงเหนือพื้นผิวโต๊ะ และในตอนแรกส่วนผสมมาตรฐานจะถูกนำไปใช้กับเส้นเริ่มต้น ซึ่งจำกัดด้วยลูกศร โดยใช้ไมโครปิเปตพิเศษเป็นเส้นบาง ๆ จนกระทั่งสารละลายทั้งหมดจากไมโครปิเปตถูกถ่ายโอนไปยังเส้นเริ่มต้น (ไมโครปิเปตคือ เติมได้ 2-3 ซม.) มวลของสารละลายที่ใช้จะวัดโดยการชั่งน้ำหนักปิเปตที่เติมส่วนผสมมาตรฐาน (ก่อนใช้สารละลาย) และปล่อยให้ว่างเปล่า (หลังจากใช้สารละลาย) โดยปกติจะใช้สารละลายมาตรฐาน 0.02-0.03 กรัมกับกระดาษ จากนั้นเติมปิเปตที่สะอาดด้วยส่วนผสมทดสอบของกรดอะมิโน (ออกโดยครูเพื่อการศึกษา) ชั่งน้ำหนักแล้วทาส่วนผสมบนเส้นเริ่มต้นด้วยเครื่องหมายที่เหมาะสม

โครมาโตกราฟีที่เตรียมไว้จะถูกวางในห้องโครมาโทกราฟีโดยมีระบบตัวทำละลายที่เทลงไปก่อนหน้านี้เพื่อแยกส่วนผสมของกรดอะมิโน เช่น ส่วนผสมของบิวทานอล กรดอะซิติก และน้ำ ในอัตราส่วน 15:3:7 การแยกจะดำเนินการโดยจากน้อยไปมากโครมาโตกราฟีจนกระทั่งเส้นด้านหน้าถึง 2-3 ซม. ถึงขอบด้านบนของกระดาษโครมาโตกราฟี (เส้นชัย) หลังจากนั้น โครมาโตกราฟีจะถูกนำออกจากห้องเพาะเลี้ยง และปลายด้านบนของกระดาษจะถูกสอดเข้าไปในที่ยึดที่ทำจากแท่งแก้วสามแท่งที่ยึดด้วยวงแหวนยางทันที และใส่ไว้ในตู้ดูดควันเป็นเวลา 20 นาที เพื่อกำจัดตัวทำละลายออกจากกระดาษ

ข้าว. 8. รูปแบบการจัดเรียงกรดอะมิโนบนโครมาโตกราฟี:

เอ - จุดผสมของกรดอะมิโน ฉัน - ซีสตีนและซีสเตอีน;

2 - ไลซีน; 3 - ฮิสติดีน; 4 - อาร์จินีน; 5 - กรดแอสปาร์ติก

ซีรีส์และไกลซีน 6 - กรดกลูตามิกและทรีโอนีน; 7 - อะลานีน;

8 - โพรลีน; 9 - ไทโรซีน; 10 - วาลีนและเมไทโอนีน; II - ทริปโตเฟน;

12 - ฟีนิลอะลานีน; 13 – ลิวซีนและไอโซลิวซีน

โครมาโตกราฟีแบบแห้งจะถูกจุ่มลงในสารละลายนินไฮดริน 1% ในอะซิโตนเพื่อตรวจจับตำแหน่งของจุดกรดอะมิโนบนนั้น จากนั้น โครมาโตกราฟีจะถูกวางในตู้ดูดควันเป็นเวลา 10 นาทีเพื่อกำจัดอะซิโตนออกและถ่ายโอนไปยังตู้ทำให้แห้ง โดยปล่อยทิ้งไว้เป็นเวลา 15 นาทีที่ 70°C ตรวจพบกรดอะมิโนของสารมาตรฐานและสารผสมทดสอบในรูปของจุดสีน้ำเงินม่วงที่อยู่ในสายโซ่ในทิศทางการเคลื่อนที่ของระบบตัวทำละลายจากเส้นเริ่มต้นไปจนถึงขอบด้านบนของโครมาโตกราฟี

การระบุกรดอะมิโนที่มีอยู่ในส่วนผสมทดสอบนั้นดำเนินการโดยบังเอิญในโครมาโตกราฟีของตำแหน่งที่ครอบครองโดยกรดอะมิโนของสารมาตรฐานและสารผสมทดสอบ (รูปที่ 8)

เพื่อตรวจสอบปริมาณปริมาณของกรดอะมิโนในสารผสมทดสอบ โครมาโตแกรมจะถูกวาดด้วยดินสออย่างง่ายเพื่อให้โซนสีที่อยู่ในระดับเดียวกันซึ่งสอดคล้องกับกรดอะมิโนเดียวกันนั้นอยู่ภายในสี่เหลี่ยมที่เหมือนกันโดยประมาณ (รูปที่ 9) .

ฉัน II III IV

ข้าว. 9. เค้าโครงของกรดอะมิโนบนโครมาโตกราฟี:

ฉัน - ส่วนผสมหมายเลข I; II - ส่วนผสมหมายเลข 2; 1U - ส่วนผสมหมายเลข 3; Ш - มาตรฐาน

ส่วนผสมของกรดอะมิโน

พื้นที่ที่ร่างไว้ของกระดาษจะถูกตัดและวางลงในหลอดทดลอง ซึ่งจำนวนนั้นจะต้องตรงกับจำนวนจุดบนโครมาโตกราฟี เทสารละลาย 75% 10 มล. ลงในหลอดทดลองแต่ละหลอดจากบิวเรต เอทิลแอลกอฮอล์อิ่มตัวด้วยน้ำผึ้งซัลเฟต (เติมสารละลายคอปเปอร์ซัลเฟตอิ่มตัว 0.2 มล. ต่อเอทิลแอลกอฮอล์ 500 มล.) ปิดฝาหลอดทดลอง และกวนเป็นครั้งคราว สีแดงอิฐ (เกลือทองแดงสีน้ำเงินม่วงม่วงของ Ruemann) จะถูกถ่ายโอนจากกระดาษไปยังสารละลายโดยสมบูรณ์ ขั้นตอนนี้ใช้เวลาประมาณ 15-20 นาที การดูดกลืนแสง (ความหนาแน่นของแสง) ของสารละลายมาตรฐานและสารละลายทดสอบวัดด้วยโฟโตอิเล็กทริกแคลอริมิเตอร์พร้อมตัวกรองแสงสีเขียว (540 นาโนเมตร) คิวเวตต์ที่มีสารละลายเอทิลแอลกอฮอล์ 75% กับคอปเปอร์ซัลเฟตได้รับการติดตั้งในการไหลอ้างอิง

ปริมาณกรดอะมิโนในสารละลายทดสอบคำนวณจากอัตราส่วนการสูญพันธุ์ของการทดสอบและตัวอย่างมาตรฐาน

ตัวอย่างการคำนวณ- สมมติว่าส่วนผสมมาตรฐานมีไกลซีน 1.8 มก. ใน 1 มล. และสารละลายมาตรฐานนี้ 0.02 กรัมใช้กับแถบเริ่มต้น ดังนั้นโครมาโตแกรมจึงได้รับ (1.8 × 0.02) = 0.036 มก. ของไกลซีน ให้เราตกลงเพิ่มเติมว่าการดูดซับของสารละลายที่มีสีคือ 0.288 สำหรับสารละลายมาตรฐานและ 0.336 สำหรับของผสมที่ไม่ทราบ จากนั้น ปริมาณไกลซีนในส่วนผสมที่กำลังศึกษา ซึ่งพล็อตบนโครมาโตแกรมจะเท่ากับ (36´0.336): 0.288=42 ไมโครกรัม หากเราสมมุติเพิ่มเติมว่าส่วนผสมทดสอบถูกนำไปใช้กับโครมาโตแกรมในปริมาณ เช่น 0.0250 กรัม ดังนั้นปริมาณไกลซีนในสารละลายทดสอบ 1 มิลลิลิตรจะเป็น (42:0.0250) = 1680 ไมโครกรัม หรือ 1.68 มก./ มล.

นำเสนอผลการทดลองของคุณเองและสรุปผลจากการทดลองเหล่านั้น

งานห้องปฏิบัติการหมายเลข 15

การแยกไอออนเฟ 3+ , บริษัท 2+ , นิ 2+

บทความนี้จะกล่าวถึงวิธีการตรวจวัดกรดอะมิโน ซึ่งไม่เพียงแต่ใช้ในการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์เท่านั้น แต่ยังใช้ในการวิเคราะห์ทางชีวเคมีและเภสัชกรรมด้วย

ปริมาณกรดอะมิโนทั้งหมดสามารถกำหนดได้โดยวิธีโฟโตเมตริก โดยอาศัยการหาแอมโมเนียที่ได้จากกรดอะมิโนโดยใช้วิธีเจลดาห์ล

ปฏิกิริยากับ 1-แนฟทอล เพื่อตรวจสอบอาร์จินีน ฮิสทิดีน และไทโรซีน จะมีการเสนอปฏิกิริยากับ 1-แนพทอล เมื่อมีโซเดียมไฮโปคลอไรต์ (NaOCl) สารละลายจะเปลี่ยนเป็นสีแดง สารละลายตัวอย่างในเอทานอล 50% ที่มีกรดอะมิโนถูกทำให้เย็นลงด้วยน้ำแข็ง และเติมสารละลาย NaOCl 10% และสารละลายแนฟทอล ผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยาจะเป็นสีแดง (l สูงสุด = 550 นาโนเมตร) ปริมาณกรดอะมิโนถูกกำหนดโดยความเข้มของสีของสารละลายที่ได้

ปฏิกิริยาไบยูเรต. ปฏิกิริยาที่สำคัญที่สุดอย่างหนึ่งที่ใช้ในการกำหนดกรดอะมิโนคือปฏิกิริยาไบยูเรต ปฏิกิริยานี้ทำได้โดยการเติมสารละลายน้ำเจือจางของเกลือคอปเปอร์ (II) ลงในสารละลายด่างของไบยูเรต ในกรณีนี้ การแก้ปัญหาจะเปลี่ยนไปอย่างมาก สีม่วงเนื่องจากเกิดเป็นสารประกอบเชิงซ้อน

ปฏิกิริยาไบยูเรตเกี่ยวข้องกับสารประกอบที่มีหมู่เอไมด์อย่างน้อย 2 หมู่หรือหมู่อะมิโนไฮดรอกซีเอทิลีน เช่นเดียวกับเอไมด์และอิไมด์ของกรดอะมิโน ปฏิกิริยานี้ดำเนินการโดยโปรตีนและสารละลายเข้มข้นของกรดอะมิโนและเอไมด์ สารละลายเจือจางของกรดอะมิโนไม่ทำให้เกิดปฏิกิริยาไบยูเรต ดังนั้นปฏิกิริยานี้จึงสามารถใช้เพื่อกำหนดจุดสิ้นสุดของการไฮโดรไลซิสของโปรตีนได้ ปฏิกิริยานี้ยังใช้สำหรับการกำหนดปริมาณโปรตีนในเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณ ปฏิกิริยาไบยูเรตเป็นพื้นฐานสำหรับวิธีการที่ใช้ในห้องปฏิบัติการวินิจฉัยทางคลินิกเพื่อตรวจวัดโปรตีนในเลือดและของเหลวทางชีวภาพอื่นๆ

ปฏิกิริยานินไฮดริน ปฏิกิริยาที่สำคัญที่สุดอันดับสองที่ใช้ในการระบุกรดอะมิโนคือปฏิกิริยานินไฮดริน ซึ่งเป็นปฏิกิริยาสีของกรดอะมิโน ซึ่งดำเนินการโดยการให้ความร้อนอย่างหลังในสารละลายอัลคาไลน์ของนินไฮดรินส่วนเกิน

นินไฮดรินดำเนินการออกซิเดชันดีคาร์บอกซิเลชันของกรดอะมิโนด้วยการก่อตัวของแอมโมเนีย คาร์บอนไดออกไซด์ และอัลดีไฮด์ โดยมีอะตอมของคาร์บอนหนึ่งอะตอมน้อยกว่ากรดอะมิโนดั้งเดิม นินไฮดรินที่รีดิวซ์จะทำปฏิกิริยาเพิ่มเติมกับแอมโมเนียที่ปล่อยออกมาและโมเลกุลนินไฮดรินตัวที่สอง ทำให้เกิดผลิตภัณฑ์ควบแน่นที่มีสีกับแอมโมเนีย

สารประกอบที่ได้ (เม็ดสี) มีสีม่วงอมฟ้า (l สูงสุด = 570 นาโนเมตร) การก่อตัวของสารประกอบที่มีสีนี้ใช้ในการทดสอบกรดอะมิโนเชิงปริมาณ ซึ่งสามารถตรวจจับกรดอะมิโนได้แม้ในปริมาณที่น้อยเพียง 1 ไมโครกรัม

โพรลีนและไฮดรอกซีโพรลีนซึ่งไม่มีหมู่อะมิโน ทำปฏิกิริยากับนินไฮดรินเพื่อสร้างอนุพันธ์ สีเหลือง(สูงสุด = 440 นาโนเมตร) ปฏิกิริยาไม่เฉพาะเจาะจงเพราะว่า แอมโมเนียและสารประกอบที่มีหมู่อะมิโน (เอมีน โปรตีน เปปไทด์) ยังผลิตผลิตภัณฑ์ที่มีสีด้วยนินไฮดริน อย่างไรก็ตาม ไม่มีการปล่อย CO 2 ออกมาพร้อมกับสารประกอบเหล่านี้ การปล่อยก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์เป็นลักษณะเฉพาะของกรดอะมิโนเท่านั้น ปฏิกิริยานี้ใช้สำหรับการระบุเชิงปริมาณเชิงสีของกรดอะมิโน ซึ่งรวมถึงในเครื่องวิเคราะห์กรดอะมิโนอัตโนมัติ (การวัดปริมาตร CO 2)

ปฏิกิริยานินไฮดรินใช้เพื่อหาไกลซีน, ไอโซลิวซีน, ลิวซีน; ซีรีน ฟีนิลอะลานีน ซิสเทอีน ไทโรซีน ทริปโตเฟน ฯลฯ ให้สีที่เข้มข้นน้อยกว่า

ผลลัพธ์ที่ได้จะมีลักษณะเป็นสีที่ค่อนข้างเข้ม (e = 1.8–3.3·10 4) แต่ผลิตภัณฑ์ที่มีสีไม่เสถียร ความเข้มของสีลดลงอย่างรวดเร็ว มีการเพิ่ม CdCl 2 เพื่อรักษาเสถียรภาพ มันก่อให้เกิดสารเชิงซ้อนที่เสถียรพร้อมกับสารประกอบที่เกิดขึ้น แคดเมียมคลอไรด์ยังช่วยเร่งปฏิกิริยาอีกด้วย

กรดอะมิโนและสารประกอบอื่นๆ ที่มีหมู่อะมิโนควบแน่นในตัวกลางที่เป็นด่างโดยมี 1,2-แนฟโทควิโนน - 4-ซัลฟอกซีเลต เพื่อสร้างอนุพันธ์สีแดง เหลือง ส้มของโมโนอิมีน 1,2-แนฟโทควิโนน

ปฏิกิริยานี้ใช้ในการหาอะมิโนซิเลต (วาลีน, ไอโซลิวซีน, ลิวซีน ฯลฯ)

ในการกำหนดทริปโตเฟน สามารถใช้ปฏิกิริยากับ 4-ไดเมทิลอะมิโนเบนซาลดีไฮด์ได้ ผลิตภัณฑ์ที่ทำปฏิกิริยาจะมีสีม่วง และปริมาณทริปโตเฟนในสารละลายที่วิเคราะห์จะถูกกำหนดโดยความเข้มของสี

อย่างไรก็ตาม ควรสังเกตว่าปฏิกิริยานี้ไม่ค่อยถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์อาหาร

สำหรับการกำหนดปริมาณกรดอะมิโนที่มีกำมะถันจะใช้วิธีโบรมาโตเมตริกตามปฏิกิริยาต่อไปนี้:

สารละลายซิสเทอีนในสารละลาย NaOH 1% เทลงในขวดที่มีตัวกั้นกราวด์เติม 0.1 N สารละลายโพแทสเซียมโบรเมต โพแทสเซียมโบรไมด์แห้ง และทำให้เป็นกรดด้วย HCl 10%

BrO 3 – + 5Br – + 6H + → 3Br 2 + 3H 2 O

โบรมีนที่เกิดขึ้นจากปฏิกิริยาซึ่งมีปริมาณเทียบเท่ากับปริมาณโพแทสเซียมโบรเมต ทำปฏิกิริยากับกรดอะมิโน หลังจากผ่านไป 10 นาที โพแทสเซียมไอโอไดด์จะถูกเติมเข้าไป ซึ่งทำปฏิกิริยากับโบรมีนที่ไม่ทำปฏิกิริยา และไอโอดีนที่ปล่อยออกมาจะถูกไตเตรทด้วย 0.1 N สารละลายโซเดียมไธโอซัลเฟตโดยมีแป้งเป็นตัวบ่งชี้

2I – + Br 2 → Br - + ฉัน 2

ปริมาณไธโอซัลเฟตที่ใช้สำหรับการไตเตรทจะเท่ากับปริมาณโบรมีนที่ไม่ทำปฏิกิริยากับกรดอะมิโน จากความแตกต่างระหว่างปริมาณโพแทสเซียมโบรเมตที่เติมกับไธโอซัลเฟต ปริมาณโบรมีนที่ทำปฏิกิริยากับกรดอะมิโนจึงพบได้ ดังนั้น จึงพบปริมาณกรดอะมิโนด้วย

เมไทโอนีนถูกกำหนดในทำนองเดียวกัน เมไทโอนีนถูกออกซิไดซ์เป็นซัลโฟน:

ปฏิกิริยานี้ภายใต้เงื่อนไขบางประการทำให้สามารถระบุปริมาณเมไทโอนีนได้อย่างแม่นยำมาก



กรดอะมิโนสามารถตรวจพบได้โดยใช้ปฏิกิริยาสี: นินไฮดริน, แซนโทโปรตีน, โฟไล, มิโลน, การทดสอบไบยูเรต ฯลฯ ปฏิกิริยาเหล่านี้ไม่จำเพาะเจาะจงเพราะ ขึ้นอยู่กับการตรวจจับชิ้นส่วนแต่ละชิ้นในโครงสร้างของกรดอะมิโนซึ่งสามารถพบได้ในสารประกอบอื่นด้วย

ปฏิกิริยานินไฮดรินปฏิกิริยาสีที่ใช้สำหรับการกำหนดปริมาณกรดอะมิโน กรดอิมิโน และเอมีนในเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณ เมื่อถูกความร้อนในสภาพแวดล้อมที่เป็นด่าง นินไฮดริน (ไทรเซโตไฮดรินดีไฮเดรต, C 9 H b O 4) โดยมีสารที่มีหมู่อะมิโนปฐมภูมิ (-NH 2) จะเกิดผลิตภัณฑ์ขึ้นซึ่งมีสีฟ้าม่วงเข้มที่เสถียรพร้อมการดูดซึมสูงสุดประมาณ 570 นาโนเมตร- เนื่องจากการดูดซับที่ความยาวคลื่นนี้ขึ้นอยู่กับจำนวนหมู่อะมิโนอิสระเป็นเส้นตรง ปฏิกิริยานินไฮดรินจึงทำหน้าที่เป็นพื้นฐานสำหรับการกำหนดปริมาณของพวกมันโดยการวัดสีหรือสเปกโตรโฟโตเมทรี ปฏิกิริยานี้ยังใช้เพื่อกำหนดกลุ่มอะมิโนทุติยภูมิ (>NH) ในกรดอิมิโน - โพรลีนและไฮดรอกซีโพรลีน ในกรณีนี้จะเกิดผลิตภัณฑ์สีเหลืองสดใสขึ้น ความไว - สูงถึง 0.01% การวิเคราะห์กรดอะมิโนอัตโนมัติสมัยใหม่ดำเนินการโดยการรวมการแยกไอออนของกรดอะมิโนเข้ากับการวัดเชิงปริมาณโดยใช้ปฏิกิริยานินไฮดริน เมื่อแยกส่วนผสมของกรดอะมิโนโดยใช้กระดาษโครมาโตกราฟี จะทำให้สามารถระบุกรดอะมิโนแต่ละตัวในปริมาณอย่างน้อย 2-5 ไมโครกรัมได้

ความเข้มของสีสามารถใช้เพื่อตัดสินปริมาณกรดอะมิโนได้

ปฏิกิริยานี้เป็นผลบวกไม่เพียงแต่กับกรดอะมิโนอิสระเท่านั้น แต่ยังรวมถึงเปปไทด์ โปรตีน ฯลฯ ด้วย

ปฏิกิริยาแซนโทโปรตีนช่วยให้สามารถตรวจจับกรดอะมิโนอะโรมาติก (ฟีนิลอะลานีน, ไทโรซีน, ฮิสทิดีน, ทริปโตเฟน) โดยอาศัยปฏิกิริยาของการทดแทนอิเล็กโทรฟิลิกในนิวเคลียสอะโรมาติก (ไนเตรชัน)

เมื่อกรดไนตริกเข้มข้นออกฤทธิ์ เช่น กับไทโรซีน จะเกิดผลิตภัณฑ์สีเหลืองขึ้น

ปฏิกิริยาตามมานี่คือปฏิกิริยาต่อซีสเตอีนและซีสตีน ในระหว่างการไฮโดรไลซิสแบบอัลคาไลน์ "ซัลเฟอร์ที่จับอย่างอ่อนแอ" ในซีสเตอีนและซีสตีนจะถูกแยกออกค่อนข้างง่ายส่งผลให้เกิดการก่อตัวของไฮโดรเจนซัลไฟด์ซึ่งเมื่อทำปฏิกิริยากับอัลคาไลจะทำให้เกิดโซเดียมหรือโพแทสเซียมซัลไฟด์ เมื่อเติมลีด (II) อะซิเตต จะเกิดการตกตะกอนสีเทา-ดำของลีด (II) ซัลไฟด์

คำอธิบายของประสบการณ์ เทสารละลายซีสตีน 1 มิลลิลิตรลงในหลอดทดลอง เติมสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ 20% 0.5 มิลลิลิตร ส่วนผสมถูกให้ความร้อนจนเดือด จากนั้นเติมสารละลายตะกั่ว (II) อะซิเตต 0.5 มิลลิลิตร สังเกตเห็นการตกตะกอนของตะกั่ว (II) ซัลไฟด์สีเทา-ดำ:

ปฏิกิริยาของซิมเมอร์แมนนี่คือปฏิกิริยาต่อกรดอะมิโนไกลซีน

คำอธิบายของประสบการณ์ ไปยังสารละลายไกลซีน 0.1% 2 มล. ปรับโดยการเติมสารละลายอัลคาไล 10% ไปที่ pH = 8 ให้เติมสารละลายโอ-พทาลิกไดอัลดีไฮด์ 0.5 มล. ส่วนผสมของปฏิกิริยาเริ่มเปลี่ยนเป็นสีเขียวสดใสอย่างช้าๆ หลังจากนั้นไม่กี่นาที ตะกอนสีเขียวก็จะปรากฏขึ้น

ปฏิกิริยาต่อทริปโตเฟนทริปโตเฟนทำปฏิกิริยาเข้า สภาพแวดล้อมที่เป็นกรดด้วยอัลดีไฮด์ทำให้เกิดผลิตภัณฑ์ควบแน่นด้วยสี ตัวอย่างเช่น ด้วยกรดไกลออกซิลิก (ซึ่งเป็นสารผสมที่ทำให้เข้มข้น กรดอะซิติก) ปฏิกิริยาดำเนินไปตามสมการ:

ปฏิกิริยาของทริปโตเฟนกับฟอร์มาลดีไฮด์เกิดขึ้นตามรูปแบบที่คล้ายกัน

ปฏิกิริยาของซาคากุจิปฏิกิริยาต่ออาร์จินีนของกรดอะมิโนนี้ขึ้นอยู่กับปฏิกิริยาของอาร์จินีนกับα-แนพทอลเมื่อมีสารออกซิไดซ์ กลไกของมันยังไม่ได้รับการอธิบายอย่างสมบูรณ์ เห็นได้ชัดว่าปฏิกิริยาเกิดขึ้นตามสมการต่อไปนี้:

เนื่องจากอนุพันธ์ของควิโนน อิมีน (ในกรณีนี้คือแนฟโทควิโนน) ซึ่งไฮโดรเจนของกลุ่มอิมิโน –NH– ถูกแทนที่ด้วยอัลคิลหรือเอริลเรดิคัล จึงมีสีเหลือง-แดงเสมอ ดังนั้น เห็นได้ชัดว่าเป็นสีส้ม-แดงของ วิธีแก้ปัญหาระหว่างปฏิกิริยาซาคากุจิอธิบายได้จากการปรากฏตัวของอนุพันธ์ของแนฟโทควิโนนอิมีน อย่างไรก็ตาม ไม่สามารถแยกความเป็นไปได้ของการก่อตัวของสารประกอบที่ซับซ้อนยิ่งขึ้นเนื่องจากการเกิดออกซิเดชันเพิ่มเติมของกลุ่ม NH ที่เหลือของอาร์จินีนที่ตกค้างและวงแหวนเบนซีนของ α-naphthol ไม่สามารถแยกออกได้:

คำอธิบายของประสบการณ์ เทสารละลายอาร์จินีน 0.01% 2 มล. ลงในหลอดทดลอง จากนั้นเติมสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ 10% 2 มล. และสารละลายแอลกอฮอล์ 0.2% ของα-naphthol สองสามหยด เนื้อหาของหลอดทดลองผสมกันดี เติมสารละลายไฮโปโบรไมต์ 0.5 มิลลิลิตรแล้วผสมอีกครั้ง เติมสารละลายยูเรีย 40% 1 มิลลิลิตรทันทีเพื่อทำให้สีส้มแดงที่กำลังเติบโตอย่างรวดเร็วคงตัว

ปฏิกิริยาไบยูเรต– ใช้เป็นปฏิกิริยาสีต่อโปรตีน ในสภาพแวดล้อมที่เป็นด่างโดยมีเกลือของคอปเปอร์ (II) พวกมันจะให้สีม่วง สีเกิดจากการสร้างสารประกอบเชิงซ้อนคอปเปอร์ (II) เนื่องจากกลุ่มเปปไทด์ -CO-NH-ซึ่งเป็นลักษณะของโปรตีน ปฏิกิริยานี้ได้ชื่อมาจากอนุพันธ์ของยูเรีย - ไบยูเรตซึ่งเกิดขึ้นเมื่อยูเรียถูกให้ความร้อนด้วยการกำจัดแอมโมเนีย:

นอกจากโปรตีนและไบยูเรตแล้ว สารประกอบอื่นๆ ที่มีกลุ่มนี้จะได้รับสีเดียวกัน: เอไมด์, อิไมด์ของกรดคาร์บอกซิลิก เช่นเดียวกับสารประกอบที่มีหมู่ -CS-NH- หรือ =CH-NH- ในโมเลกุล โปรตีน กรดอะมิโนบางชนิด เปปไทด์ ไบยูเรต และเปปโตนมีเดียมก็ทำปฏิกิริยาเช่นกัน

สีของสารเชิงซ้อนที่ได้จากปฏิกิริยาไบยูเรตกับเปปไทด์ต่างๆ นั้นค่อนข้างแตกต่างกันและขึ้นอยู่กับความยาวของสายโซ่เปปไทด์ เปปไทด์ที่มีความยาวสายโซ่เป็นกรดอะมิโนสี่ตัวขึ้นไปก่อตัวเป็นสารเชิงซ้อนสีแดง, ไตรเปปไทด์ - สีม่วง และไดเปปไทด์ - สีน้ำเงิน

รูปแบบของคีโตนของโพลีเปปไทด์

รูปแบบอีนอลของโพลีเปปไทด์

เมื่อโพลีเปปไทด์ทำปฏิกิริยากับ Cu (OH) 2 จะเกิดคอมเพล็กซ์ขึ้นโครงสร้างที่สามารถแสดงได้ดังต่อไปนี้