Χρησιμοποιούνται μέθοδοι για τον ποσοτικό προσδιορισμό των αμινοξέων. Ποιοτικές αντιδράσεις σε αμινοξέα, πεπτίδια, πρωτεΐνες. Μέθοδοι προσδιορισμού αμινοξέων

Μέθοδοι προσδιορισμού αμινοξέων

Τα αμινοξέα είναι βιολογικά δραστικές ουσίες, παίζουν μεγάλο ρόλο στη ζωή του ανθρώπινου σώματος, χρησιμοποιούνται ευρέως ως φάρμακα. Κάποια από αυτά είναι απαραίτητα και εισέρχονται στον οργανισμό με την τροφή. Επί του παρόντος, υπάρχει ένας αριθμός μεθόδων για τον ποσοτικό προσδιορισμό των αμινοξέων σε φαρμακευτικά φυτικά υλικά, όπως φάρμακακαι βιολογικά υγρά, σε προϊόντα διατροφής.

Από την ποικιλία των μεθόδων για τον ποσοτικό προσδιορισμό των αμινοξέων σε διάφορα αντικείμενα, διακρίνονται τέσσερις κύριες ομάδες: χρωματογραφικές, φασματοφωτομετρικές, τιτρομετρικές και ηλεκτροχημικές μέθοδοι ανάλυσης.

Χρωματογραφικές μέθοδοι

Τις τελευταίες δεκαετίες, έχουν γίνει σημαντικές πρόοδοι στον τομέα της χρωματογραφίας αερίου-υγρού αμινοξέων. Έχει προταθεί μια μέθοδος που χρησιμοποιεί μικροσυσκευασμένες στήλες, η οποία επιτρέπει σχετικά σύντομο χρονικό διάστημαδιαχωρίζουν σχεδόν πλήρως 17 βιολογικά σημαντικά α-αμινοξέα.

Έχει αναπτυχθεί μια μέθοδος για τον προσδιορισμό των αμινοξέων χρησιμοποιώντας χρωματογραφία αερίου-υγρού σε δείγματα ορού, πλάσματος, ούρων και εγκεφαλονωτιαίου υγρού, βασισμένη στην παρασκευή 2,3,4,5,6-πενταφθοροβενζοϋλο-ισοβουτυλαιθέρων που ακολουθείται από διαχωρισμό σε στήλη πολυδιμεθυλσιλοξανίου σε λειτουργία προγραμματισμού θερμοκρασίας από 140°C έως 250°C με ανιχνευτή ιονισμού φλόγας. Ο χρόνος χρωματογραφικού διαχωρισμού είναι 28 λεπτά. Ως αποτέλεσμα της έρευνας, διαχωρίστηκαν 27 αμινοξέα.

Παρά την ποικιλία των μεθόδων υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης για την ανάλυση αμινοξέων, η πιο γρήγορη και προσιτή είναι η έκδοση αντίστροφης φάσης με φασματοφωτομετρική ανίχνευση. Για επιτυχή διαχωρισμό και ανίχνευση, τα αμινοξέα μετατρέπονται σε υδρόφοβα και φωτοαπορροφητικά παράγωγα, δηλαδή πραγματοποιείται παραγωγοποίηση πριν από τη στήλη. Ως αντιδραστήρια παραγωγοποίησης χρησιμοποιούνται ορθοφθαλική αλδεΰδη, ναφθαλινο-2,3-δικαρβοξυαλδεΰδη και χλωρομυρμηκικός 9-φθορενυλμεθυλεστέρας.

Έχει αναπτυχθεί μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό της L-κυστίνης, του L-γλουταμινικού οξέος και της γλυκίνης στο φάρμακο «Eltacin», το οποίο έχει αντιοξειδωτική δράση σε συνδυασμό με αντιστηθαγχική δράση. Το γλουταμινικό οξύ και η γλυκίνη προσδιορίστηκαν με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης μετά από παραγωγοποίηση πριν από τη στήλη με το αντιδραστήριο ορθοφθαλικήδεΰδη/Ν-ακετυλ-L-κυστεΐνη. Η παραγωγοποίηση της κυστεΐνης, σύμφωνα με τους συγγραφείς, είναι δύσκολη λόγω της αστάθειας του ίδιου του αμινοξέος και των παραγώγων που προκύπτουν. Ως εκ τούτου, η ανάλυση κυστεΐνης πραγματοποιήθηκε με βρωματομετρική τιτλοδότηση. Διαπιστώθηκε ότι η παρουσία σημαντικών ποσοτήτων κυστεΐνης στο δείγμα δεν παρεμποδίζει τον προσδιορισμό των προϊόντων παραγωγοποίησης της γλυκίνης και του γλουταμικού οξέος με το αντιδραστήριο ορθοφθαλικής αλδεΰδης/Ν-ακετυλ-L-κυστεΐνης. Η μέθοδος χαρακτηρίζεται από υψηλή αναπαραγωγιμότητα και ακρίβεια προσδιορισμού.

Η δυνατότητα χρήσης 4,7-φαινανθρολινο-5,6-διόνης (φανκινόνη) ως φθορογόνου αντιδραστηρίου σήμανσης για τον σχηματισμό πριν από τη στήλη των παραγώγων της με σκοπό τον διαχωρισμό και την ποσοτική ανάλυση αμινοξέων με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης ήταν ερευνηθεί. Χωρίς ενδογενή φθορισμό, η φανκινόνη αντιδρά με τις αμινο ομάδες των αμινοξέων (στους 68 °C για 160 λεπτά), σχηματίζοντας ιμινοκινόλες, ο φθορισμός των οποίων μετράται σε μήκος κύματος 460 nm. Τα απομονωμένα παράγωγα ταυτοποιήθηκαν με φάσματα Tm, IR, μάζας και PMR. Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης πραγματοποιήθηκε σε χρωματογράφο με ανιχνευτή φθορισμού και στήλη με βαθμιδωτή έκλουση με μίγματα: διάλυμα τριαιθυλαμίνης - ρυθμιστικό φωσφορικών (ρΗ 3) - μεθανόλη. Η κινιδίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο. Αυτή η μέθοδοςείναι αρκετά ελπιδοφόρα σε μεγάλα εργαστήρια και μπορεί να προταθεί για την ανάλυση αμινοξέων σε έτοιμες δοσολογικές μορφές.

Αναπτύχθηκε μια τεχνική υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με ποτενσιομετρικό βιοαισθητήρα για τον ποσοτικό προσδιορισμό της λυσίνης. Ο βιοαισθητήρας κατασκευάζεται με την προσάρτηση μιας μεμβράνης που περιέχει οξειδάση λυσίνης σε ένα ηλεκτρόδιο NH4+ επιλεκτικό ιόντων. Τα ιόντα αμμωνίου που παράγονται κατά την ενζυματική αποικοδόμηση της λυσίνης ανιχνεύονται ποτενσιομετρικά. Έχει αναπτυχθεί μια χρωματοπυκνησιμετρική μέθοδος για την ανάλυση της τρυπτοφάνης σε υγρά καλλιέργειας. Η χρωματογραφία λεπτής στιβάδας πραγματοποιήθηκε σε τρυβλία Sorbfil. Διεξήχθη χρωματογραφία στο σύστημα προπανόλη-2 - διάλυμα υδροξειδίου του αμμωνίου 25% (7:3) για 25 λεπτά. Τα χρωματογραφήματα ξηράνθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου και διατηρήθηκαν στους 120°C για 15 λεπτά. Για την ανίχνευση κηλίδων στα χρωματογραφήματα, χρησιμοποιήθηκε ένα ειδικό αντιδραστήριο - 4-διμεθυλαμινοβενζαλδεΰδη, εκλεκτική για τον δακτύλιο ινδόλης της τρυπτοφάνης, με τη μορφή διαλύματος αιθανόλης 0,5% με την προσθήκη 5% πυκνού θειικού οξέος. Μετά την ανάπτυξη των χρωματογραφημάτων με εμβάπτιση σε κυψελίδα Teflon με πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα 4-διμεθυλαμινοβενζαλδεΰδης, διατηρήθηκαν για 5-7 λεπτά σε θερμοκρασία 110 C. Πραγματοποιήθηκε σάρωση κηλίδων τρυπτοφάνης σε μήκος κύματος 625 nm σε πυκνόμετρο βίντεο υπολογιστή. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε, παρά την υψηλή ακρίβεια προσδιορισμού και την παραγωγικότητά της, είναι ειδική για την τρυπτοφάνη.

Για την ανάλυση των β-αμινοξέων σε βιολογικά υγρά, φάρμακα και προϊόντα διατροφής, χρησιμοποιούνται ευρέως μέθοδοι τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης, που βασίζονται στον διαχωρισμό των συστατικών ενός σύνθετου μείγματος σε ένα τριχοειδές χαλαζία υπό την επίδραση εφαρμοζόμενου ηλεκτρικού πεδίου. Δεδομένου ότι τα αμινοξέα είναι αμφιτεριονικά στη φύση τους, μπορούν να διαχωριστούν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικά διαλύματα ηλεκτρολυτών με κατάλληλη τιμή pH, τις περισσότερες φορές χρησιμοποιούνται ουδέτερα και βασικά ρυθμιστικά διαλύματα διαχωρισμού.

Προκειμένου να αυξηθεί η ειδικότητα και η ευαισθησία της μεθόδου τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης για την ανάλυση μεμονωμένων β-αμινοξέων, χρησιμοποιείται η προκαταρκτική παραγωγοποίηση τους, ακολουθούμενη από διαχωρισμό σε τριχοειδές χαλαζία και φασματοφωτομετρικό προσδιορισμό των προϊόντων της αντίδρασης. Έτσι, 9-φθορενυλ μεθυλμυρμηκικός, 9-(2-καρβαζόλη)-χλωρομυρμηκικός αιθυλεστέρας και βαφή κυανίνης χρησιμοποιούνται ως παράγοντες παραγωγοποίησης. Οι προοπτικές της μεθόδου οφείλονται σε πλεονεκτήματα όπως η γρήγορη ανάλυση, η ευκολία προετοιμασίας του δείγματος, η χαμηλή κατανάλωση αντιδραστηρίων και η απλότητα των οργάνων.

Και πρωτεΐνες

Είναι γνωστό ότι και οι 20 ποικιλίες κανονικών α-αμινοξέων έχουν την ίδια δομή, με τρεις παραλλαγές λειτουργικών ομάδων (Εικ. 3.3). Δυστυχώς, οι αντιδράσεις σε αμινο και καρβοξυ ομάδες δεν είναι πολύ συγκεκριμένες, γιατί αντίστοιχα, είναι χαρακτηριστικά όλων των αμινών, ένας αριθμός αμιδίων και καρβοξυλικά οξέα. Το ίδιο ισχύει για τις περισσότερες από τις ρίζες τους = R, 10 από τις οποίες είναι μη πολικές, δηλαδή αντιπροσωπεύονται από αλειφατικές = υδρογονανθρακικές ομάδες, οι περισσότερες από τις οποίες είναι χημικά αδρανείς. Η εξειδίκευση των περισσότερων R πολικών αμινοξέων, τα οποία περιέχουν αλκοόλη (Ser, Tre, Tyr), αμίδιο (Asn, Gln) και καρβοξυομάδες (Asp, Glu), είναι επίσης σχετικά χαμηλή. Η αμινομάδα (Lys), η ιμιδαζόλη His και η γουανιδινο ομάδα Arg είναι πιο ενεργές και η δραστικότητα της θειοομάδας Cys είναι μέγιστη. Επομένως το μεγαλύτερο πρακτική σημασίασε ποιότητα και ποσοτική ανάλυσηΤα α-αμινοξέα, συμπεριλαμβανομένων των αναλυτών αμινοξέων, έλαβαν μια καθολική αντίδραση νινυδρίνης, ειδική για την ταυτόχρονη παρουσία αμινο και καρβοξυ ομάδων στο άτομο α-C.

Ρύζι. 3.3. Γενικοί τύποι για τη δομή των α-αμινοξέων και το προϊόν του πολυμερισμού τους. Επεξηγήσεις στο κείμενο.

Ο πολυμερισμός των α-αμινοξέων στη δομή των πεπτιδίων και των πρωτεϊνών (Εικ. 3.3) διατηρεί όλους τους τύπους R, αλλά:

1. Η αντίδραση νινυδρίνης γίνεται αρνητική, γιατί Με εξαίρεση τις Ν- και Ο-τελικές, οι α-αμινο και α-καρβοξυ ομάδες δαπανώνται για το σχηματισμό πεπτιδικών δεσμών. Μια θετική αντίδραση νινυδρίνης με πρωτεΐνη πιθανότατα υποδεικνύει την παρουσία ακαθαρσιών αμινοξέων στο παρασκεύασμα ή στο δοχείο.

2. Για όλα τα πεπτίδια και τις πρωτεΐνες, μια αντίδραση διουρίας είναι ειδική για μια πεπτιδική ομάδα που απουσιάζει στα μονομερή αμινοξέα.

3. Από τις πιο ειδικές αντιδράσεις στα αμινοξέα R, οι ακόλουθες είναι χρήσιμες: αντίδραση ξανθοπρωτεΐνης με πυκνό νιτρικό οξύ, σε αρωματικά R Fen, Tyr, Tri; αντίδραση με ισατίνη στον πενταμελή δακτύλιο Pro, καθώς και αντιδράσεις στην ιμιδαζόλη R His, τη θειο ομάδα Cys και την γουανιδινο ομάδα Arg. Είναι σημαντικό να ληφθεί υπόψη ότι μερικά από αυτά τα R είναι κρυμμένα μέσα σε πρωτεϊνικά σφαιρίδια και επομένως οι ποιοτικές αντιδράσεις σε αυτά εξασθενούν. Επομένως, πριν πραγματοποιηθούν, οι πρωτεΐνες συνήθως μετουσιώνονται με τον ένα ή τον άλλο τρόπο.

4. Σε αντίθεση με τα αληθινά διαλύματα αμινοξέων, τα κολλοειδή διαλύματα πρωτεϊνών χαρακτηρίζονται ιζηματογενείς αντιδράσεις, που σχετίζεται με την καταστροφή των κελυφών ενυδάτωσης και, ως αποτέλεσμα, τη μείωση της διαλυτότητάς τους υπό την επίδραση παραγόντων αφαίρεσης νερού: ουδέτερα άλατα = αλάτισμα, μεθανόλη = MeOH, αιθανόλη = EtOH, ακετόνη, ουρία και άλλους παράγοντες.

Κατά την εκτέλεση ποιοτικών αντιδράσεων, θα πρέπει:

1. Ακολουθήστε προσεκτικά τους κανόνες πυρασφάλειας και εργαστείτε με συμπυκνωμένα οξέα και αλκάλια = EZh.

2. Σημειώστε 2 σειρές δοκιμαστικών σωλήνων με ένα γυάλινο γράφημα ή μαρκαδόρο και τοποθετήστε όχι περισσότερο από 0,5 ml (2-5 σταγόνες) διαλύματος αμινοξέος 1% σε έναν από αυτούς και περίπου τον ίδιο όγκο 1 % διάλυμα πρωτεΐνης στο άλλο.

3. Σε ένα ζεύγος δοκιμαστικών σωλήνων με διαλύματα αμινοξέων και πρωτεϊνών, προσθέστε 3-5 σταγόνες από τα αντίστοιχα αντιδραστήρια παράλληλα και πραγματοποιήστε τις υπόλοιπες διαδικασίες που υποδεικνύονται για την αντίστοιχη αντίδραση.

4. Εάν είναι απαραίτητο να θερμανθούν οι δοκιμαστικοί σωλήνες, αφαιρέστε το κάλυμμα του χωνευτηρίου και ανάψτε το ξηρό καύσιμο με ένα σπίρτο. Στη συνέχεια, σφίξτε τον δοκιμαστικό σωλήνα σε μια βάση, η πρωτόγονη σχεδίαση της οποίας είναι πολύ αναξιόπιστη. Επομένως, είναι καλύτερο να τυλίξετε μερικούς δοκιμαστικούς σωλήνες με ένα κομμάτι χαρτί διπλωμένο σε μια λωρίδα και κρατώντας τους αντίχειρας, περάστε τα κάτω μισά των δοκιμαστικών σωλήνων ομοιόμορφα μέσα από τη φλόγα, αποφεύγοντας να στρέφουν τους λαιμούς στους γείτονες και να προκαλούν βίαιο βρασμό του διαλύματος. Αφού ολοκληρώσετε τη λειτουργία, σβήστε αμέσως τη φλόγα με το καπάκι του χωνευτηρίου.

5. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων, σύμφωνα με το πρότυπο, συντάσσονται στο άπλωμα του εργαστηριακού τετραδίουσε μορφή πίνακα:

6. Έχοντας εξετάσει τα αποτελέσματα που προέκυψαν και, έχοντας ολοκληρώσει το πρωτόκολλο, μαζί με ένα ράφι δοκιμαστικών σωλήνων, παρουσιάστε τα στον δάσκαλο για προστασία.

1. Αντίδραση νινυδρίνης.Με βάση την απαμίνωση και αποκαρβοξυλίωση των α-αμινοξέων με αλκοολικό διάλυμα νινυδρίνης:

Η αμμωνία που προκύπτει, αντιδρώντας με δύο μόρια νινυδρίνης, σχηματίζει ένα έγχρωμο παράγωγο με μέγιστη απορρόφηση στα 540 nm (για Pro - 440 nm).

Πρόοδος εργασίας: Προσθέστε 3-5 σταγόνες 0,5% στα δείγματα δοκιμής διάλυμα αλκοόληςνινυδρίνη. Ζεσταίνουμε απαλά τους δοκιμαστικούς σωλήνες με τα μείγματα σε φλόγα και μετά από 2-3 λεπτά καταγράφουμε την εμφάνιση του χρώματος.

2. Αντίδραση ξανθοπρωτεΐνης.Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, βασίζεται στον σχηματισμό νιτροπαραγώγων αμινοξέων με αρωματικό R: Fen, Tyr, Tri.

Πρόοδος εργασίας: Ενεργοποιώντας το βύθισμα του απορροφητήρα καπνού, προσθέστε προσεκτικά μερικές σταγόνες πυκνού νιτρικού οξέος (HNO 3) σε ένα ζευγάρι δοκιμαστικούς σωλήνες με τα δοκιμαστικά διαλύματα. Ζεστάνετε απαλά τους δοκιμαστικούς σωλήνες σε φλόγα, αποφεύγοντας να στρέφετε τους λαιμούς στους γείτονες και καταγράψτε την ανάπτυξη του χρώματος.

3. Αντίδραση νιτροπρωσσίδης.Βασίζεται στην αλκαλική υδρόλυση του αμινοξέος κυστεΐνης που περιέχει θείο, με την απελευθέρωση θειούχου νατρίου (Na 2 S), που δίνει ένα κόκκινο σύμπλοκο με ένα πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα νιτροπρωσσικού νατρίου.

Πρόοδος εργασιών:Προσθέστε ίσο όγκο υδροξειδίου του νατρίου 20% και στους δύο δοκιμαστικούς σωλήνες με 5-10 σταγόνες από τα διαλύματα δοκιμής και βράστε για τουλάχιστον 3-5 λεπτά. Προσθέστε 3-5 σταγόνες διαλύματος νιτροπρωσσικού νατρίου στους δοκιμαστικούς σωλήνες και καταγράψτε την ανάπτυξη χρώματος.

4. Αντίδραση διουρίας.Βασίζεται στον σχηματισμό ενός έγχρωμου συμπλόκου πεπτιδικού δεσμού με ιόν Cu 2+ σε αλκαλικό περιβάλλον. Χρησιμεύει ως καθολική δοκιμή για την αναγνώριση πεπτιδίων και πρωτεϊνών σε διαλύματα. Εφόσον με αυξανόμενο αριθμό πεπτιδικών δεσμών, η χρωματική ένταση του διαλύματος αυξάνεται γραμμικά, χρησιμοποιείται ευρέως για φωτομετρικό προσδιορισμό των συγκεντρώσεων πρωτεΐνης.

Πρόοδος εργασίας. Προσθέστε την ίδια ποσότητα διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου 10% σε δοκιμαστικούς σωλήνες με 5-10 σταγόνες από τα διαλύματα δοκιμής. Ανακατεύουμε καλά και προσθέτουμε 2 σταγόνες διαλύματος θειικού χαλκού 1% (CuSO 4). Αναμείξτε τα δείγματα και καταγράψτε την ανάπτυξη χρώματος μετά από λίγα λεπτά.

5. Δοκιμή βρασμού.Βασίζεται στη θερμική μετουσίωση των πρωτεϊνών.

Πρόοδος εργασίας. Οξύνετε και τους δύο δοκιμαστικούς σωλήνες με τα δοκιμαστικά διαλύματα με όχι περισσότερο από μία σταγόνα διαλύματος οξικού οξέος 1% (AcOH) και θερμάνετε μέχρι βρασμού. Αφού βράσουν τα διαλύματα για 2-3 λεπτά, καταγράψτε τα αποτελέσματα και εξηγήστε τον μηχανισμό του φαινομένου.

6. Καθίζηση από άλατα βαρέων μετάλλων(Μεχ) . Οι μετουσιωτικές τους ιδιότητες βασίζονται στην ικανότητα των βαρέων κατιόντων Me να αντιδρούν με τις λειτουργικές ομάδες R του μορίου πρωτεΐνης: θειο-, αμινο-, καρβοξυ-, αρωματικά. Επίσης, τα ισχυρά ανιόντα τους προκαλούν επαναφόρτιση ιοντικών ομάδων στα μόρια πρωτεΐνης, καταστρέφοντας έτσι τους ιοντικούς δεσμούς σε αυτά.

Πρόοδος εργασίας. Προσθέστε μερικές σταγόνες από ένα διάλυμα 5% θειικού χαλκού (CuSO 4) και στους δύο δοκιμαστικούς σωλήνες με τα διαλύματα δοκιμής. Καταγράψτε και εξηγήστε τα αποτελέσματα που προέκυψαν.

7. Καθίζηση με οργανικά οξέα.Βασίζεται στην όξινη μετουσίωση των πρωτεϊνών και στο σχηματισμό ομοιοπολικών παραγώγων θειο-, αμινο- και αρωματικών ομάδων R αμινοξέων με οργανοχλωρίδια.

Πρόοδος εργασίας. Προσθέστε μερικές σταγόνες διαλύματος 10% τριχλωροξικού οξέος (TCA) στους δοκιμαστικούς σωλήνες με τα διαλύματα δοκιμής και, μετά από λίγα λεπτά, καταγράψτε τα αποτελέσματα

Εξοπλισμός και αντιδραστήριο: χαρτί χρωματογραφίας. θάλαμος χρωματογραφίας; φωτοηλεκτρικό χρωματόμετρο? ψαλίδι; γυάλινα πιάτα (3´32 cm) - 3 τεμ.; θήκη χρωματογράμματος; ντουλάπι ξήρανσης? μικροπιπέτες? δοκιμαστικοί σωλήνες με πώματα εδάφους. προχοΐδα 25 ml; πρότυπο μείγμα αμινοξέων. δοκιμαστικό μείγμα αμινοξέων. βουτανόλη, οξικό οξύ, νερό σε αναλογία 15:3:7; 1% διάλυμα νινυδρίνης σε 95% ακετόνη. αιθυλική αλκοόλη (75%), κορεσμένη με θειικό χαλκό.

Να γίνει η δουλειά

Πάρτε ένα φύλλο χρωματογραφικού χαρτιού διαστάσεων 18 x 28 cm και σχεδιάστε μια οριζόντια γραμμή με ένα απλό μολύβι σε απόσταση 3 cm από τη μικρή άκρη του. Στη συνέχεια χωρίζεται σε άνισα τμήματα σύμφωνα με το συνημμένο διάγραμμα και σημειώνονται με βέλη τα όρια εφαρμογής των προτύπων και μιγμάτων δοκιμής και με απλό μολύβι γίνονται οι αντίστοιχες επιγραφές.

Το χαρτί ενισχύεται πάνω από την επιφάνεια του τραπεζιού και το τυπικό μείγμα εφαρμόζεται πρώτα στην αρχική γραμμή, περιορίζεται από τα βέλη, χρησιμοποιώντας μια ειδική μικροσιφώνια σε λεπτή γραμμή έως ότου ολόκληρο το διάλυμα από τη μικροπιπέτα μεταφερθεί στη γραμμή εκκίνησης (η μικροπιπέτα είναι γέμισε στα 2-3 cm). Η μάζα του εφαρμοζόμενου διαλύματος μετράται ζυγίζοντας την πιπέτα που γεμίζει με το πρότυπο μείγμα (πριν την εφαρμογή του διαλύματος) και την άδεια (μετά την εφαρμογή του διαλύματος). Στο χαρτί εφαρμόζονται συνήθως 0,02-0,03 g τυπικού διαλύματος. Στη συνέχεια, γεμίστε μια καθαρή πιπέτα με το δοκιμαστικό μείγμα αμινοξέων (που εκδόθηκε από τον δάσκαλο για τη μελέτη), ζυγίστε το και εφαρμόστε το μείγμα στην αρχική γραμμή με το κατάλληλο σημάδι.

Το παρασκευασμένο χρωματογράφημα τοποθετείται σε χρωματογραφικό θάλαμο με σύστημα διαλυτών που έχει προηγουμένως χυθεί σε αυτόν για να διαχωριστεί ένα μίγμα αμινοξέων, για παράδειγμα, ένα μίγμα βουτανόλης, οξικού οξέος και νερού σε αναλογία 15:3:7. Ο διαχωρισμός πραγματοποιείται με ανιούσα χρωματογραφία έως ότου η μπροστινή γραμμή φτάσει τα 2-3 cm στην επάνω άκρη του χρωματογραφικού χαρτιού (γραμμή φινιρίσματος). Μετά από αυτό, το χρωματογράφημα αφαιρείται από το θάλαμο και το πάνω άκρο του χαρτιού εισάγεται αμέσως σε μια θήκη από τρεις γυάλινες ράβδους στερεωμένες με ελαστικό δακτύλιο και τοποθετείται σε απαγωγέα καπνού για 20 λεπτά για να αφαιρεθούν οι διαλύτες από το χαρτί.

Ρύζι. 8. Σχήμα διάταξης αμινοξέων στο χρωματογράφημα:

Α - σημείο εφαρμογής ενός μείγματος αμινοξέων. I - κυστίνη και κυστεΐνη.

2 - λυσίνη; 3 - ιστιδίνη; 4 - αργινίνη; 5 - ασπαρτικό οξύ,

σειρά και γλυκίνη? 6 - γλουταμινικό οξύ και θρεονίνη. 7 - αλανίνη;

8 - προλίνη; 9 - τυροσίνη; 10 - βαλίνη και μεθειονίνη. II - τρυπτοφάνη;

12 - φαινυλαλανίνη; 13 – λευκίνη και ισολευκίνη

Το αποξηραμένο χρωματογράφημα βυθίζεται σε διάλυμα νινυδρίνης 1% σε ακετόνη για να ανιχνευθεί η θέση των κηλίδων αμινοξέων πάνω του. Το χρωματογράφημα στη συνέχεια τοποθετείται σε απαγωγέα καπνού για 10 λεπτά για να απομακρυνθεί η ακετόνη και μεταφέρεται σε θάλαμο ξήρανσης, όπου αφήνεται για 15 λεπτά στους 70°C. Τα αμινοξέα των προτύπων και των μιγμάτων δοκιμής ανιχνεύονται με τη μορφή κυανοϊωδών κηλίδων που βρίσκονται σε μια αλυσίδα προς την κατεύθυνση της κίνησης του συστήματος διαλυτών από τη γραμμή εκκίνησης προς το άνω άκρο του χρωματογράμματος.

Η ταυτοποίηση των αμινοξέων που περιέχονται στο μείγμα δοκιμής πραγματοποιείται με τη σύμπτωση στο χρωματογράφημα των θέσεων που καταλαμβάνουν τα αμινοξέα του προτύπου και των μιγμάτων δοκιμής (Εικ. 8).

Για τον προσδιορισμό της ποσοτικής περιεκτικότητας σε αμινοξέα στα μείγματα δοκιμής, το χρωματογράφημα σχεδιάζεται με ένα απλό μολύβι έτσι ώστε οι έγχρωμες ζώνες που βρίσκονται στο ίδιο επίπεδο, που αντιστοιχούν στο ίδιο αμινοξύ, να περιέχονται σε περίπου πανομοιότυπα ορθογώνια (Εικ. 9). .

I II III IV

Ρύζι. 9. Διάταξη αμινοξέων στο χρωματογράφημα:

I - μείγμα Αρ. I; II - μίγμα Νο. 2; 1U - μίγμα Νο. 3; Ш - στάνταρ

μίγμα αμινοξέων

Οι περιγραφόμενες περιοχές του χαρτιού κόβονται και τοποθετούνται σε δοκιμαστικούς σωλήνες, οι αριθμοί των οποίων πρέπει να αντιστοιχούν στον αριθμό των κηλίδων στα χρωματογραφήματα. 10 ml διαλύματος 75% χύνονται σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα από προχοΐδα. αιθυλικό οινόπνευμακορεσμένο με θειικό μέλι (προσθέστε 0,2 ml κορεσμένου διαλύματος θειικού χαλκού σε 500 ml αιθυλικής αλκοόλης). Ο δοκιμαστικός σωλήνας καλύπτεται και, ανακατεύοντας περιστασιακά, το τούβλο-κόκκινο χρώμα (αλάτι Ruheman μπλε-ιώδες χαλκό) μεταφέρεται πλήρως από το χαρτί στο διάλυμα. Αυτό διαρκεί 15-20 λεπτά. Η απορρόφηση (οπτική πυκνότητα) του προτύπου και των διαλυμάτων δοκιμής μετράται σε φωτοηλεκτρικό θερμιδόμετρο με φίλτρο πράσινου φωτός (540 nm). Στη ροή αναφοράς τοποθετείται κυψελίδα με διάλυμα αιθυλικής αλκοόλης 75% με θειικό χαλκό.

Η ποσοτική περιεκτικότητα σε αμινοξέα στο διάλυμα δοκιμής υπολογίζεται από την αναλογία των εξαφανίσεων των δοκιμαστικών και των τυπικών δειγμάτων.

Παράδειγμα υπολογισμού. Ας υποθέσουμε ότι το πρότυπο μείγμα περιέχει 1,8 mg γλυκίνης σε 1 ml και 0,02 g αυτού του τυπικού διαλύματος εφαρμόζονται στην αρχική λωρίδα. Επομένως, το χρωματογράφημα έλαβε (1,8 × 0,02) = 0,036 mg γλυκίνης. Ας συμφωνήσουμε περαιτέρω ότι η απορρόφηση των έγχρωμων διαλυμάτων ήταν 0,288 για το πρότυπο και 0,336 για το άγνωστο μείγμα. Τότε η περιεκτικότητα σε γλυκίνη στο υπό μελέτη μείγμα, που απεικονίζεται στο χρωματογράφημα, θα είναι (36´0,336): 0,288=42 μg. Εάν υποθέσουμε περαιτέρω ότι το μείγμα δοκιμής εφαρμόζεται στο χρωματογράφημα σε ποσότητα, για παράδειγμα, 0,0250 g, τότε η περιεκτικότητα σε γλυκίνη σε 1 ml του διαλύματος δοκιμής θα είναι (42:0,0250) = 1680 μg, ή 1,68 mg/ ml.

Παρουσιάστε τα αποτελέσματα του δικού σας πειράματος και βγάλτε συμπεράσματα από αυτά.

Εργαστηριακή εργασία Νο 15

Διαχωρισμός ιόντωνFe 3+ , Co 2+ , Ni 2+

Αυτό το άρθρο θα συζητήσει μεθόδους για τον προσδιορισμό των αμινοξέων, που χρησιμοποιούνται όχι μόνο στην ανάλυση προϊόντων, αλλά στη βιοχημεία και τη φαρμακευτική ανάλυση.

Η συνολική ποσότητα αμινοξέων μπορεί να προσδιοριστεί με μια φωτομετρική μέθοδο που βασίζεται στον προσδιορισμό της αμμωνίας που λαμβάνεται από τα αμινοξέα χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kjeldahl.

Αντίδραση με 1-ναφθόλη. Για τον προσδιορισμό της αργινίνης, της ιστιδίνης και της τυροσίνης, προτάθηκε μια αντίδραση με 1-ναφθόλη. Παρουσία υποχλωριώδους νατρίου (NaOCl), το διάλυμα γίνεται κόκκινο. Ένα διάλυμα δείγματος σε αιθανόλη 50% που περιέχει ένα αμινοξύ ψύχεται με πάγο και προστίθεται ένα διάλυμα NaOCl 10% και ένα διάλυμα ναφθόλης. Το προϊόν της αντίδρασης χρωματίζεται κόκκινο (l max = 550 nm). Η περιεκτικότητα σε αμινοξέα προσδιορίζεται από την ένταση χρώματος του διαλύματος που προκύπτει.

Αντίδραση διουρίας. Μία από τις πιο σημαντικές αντιδράσεις που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό των αμινοξέων είναι η αντίδραση διουρίας. Η αντίδραση διεξάγεται με την προσθήκη ενός αραιού υδατικού διαλύματος άλατος χαλκού (II) σε ένα αλκαλικό διάλυμα διουρίας. Σε αυτή την περίπτωση, η λύση γυρίζει έντονα μωβλόγω του σχηματισμού μιας σύνθετης ένωσης.

Η αντίδραση διουρίας περιλαμβάνει ενώσεις που περιέχουν τουλάχιστον 2 ομάδες αμιδίου ή μια ομάδα αμινοϋδροξυαιθυλενίου, καθώς και αμίδια και ιμίδια αμινοξέων. Αυτή η αντίδραση πραγματοποιείται από πρωτεΐνες και συμπυκνωμένα διαλύματα αμινοξέων και αμιδίων. Τα αραιά διαλύματα αμινοξέων δεν δίνουν αντίδραση διουρίας και επομένως η αντίδραση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό του τέλους της υδρόλυσης πρωτεΐνης. Η αντίδραση χρησιμοποιείται επίσης για τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό της πρωτεΐνης. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στα κλινικά διαγνωστικά εργαστήρια για τον προσδιορισμό της πρωτεΐνης στο αίμα και σε άλλα βιολογικά υγρά βασίζονται στην αντίδραση διουρίας.

Αντίδραση νινυδρίνης. Η δεύτερη πιο σημαντική αντίδραση που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό των αμινοξέων είναι η αντίδραση νινυδρίνης - μια χρωματική αντίδραση σε α-αμινοξέα, η οποία πραγματοποιείται με θέρμανση των τελευταίων σε ένα αλκαλικό διάλυμα περίσσειας νινυδρίνης.

Η νινυδρίνη πραγματοποιεί οξειδωτική αποκαρβοξυλίωση α-αμινοξέων με το σχηματισμό αμμωνίας, διοξειδίου του άνθρακα και αλδεΰδης, που περιέχουν ένα άτομο άνθρακα λιγότερο από το αρχικό αμινοξύ. Η ανηγμένη νινυδρίνη στη συνέχεια αντιδρά με την απελευθερωμένη αμμωνία και ένα δεύτερο μόριο νινυδρίνης, σχηματίζοντας ένα έγχρωμο προϊόν συμπύκνωσης με αμμωνία.

Η προκύπτουσα ένωση (χρωστική ουσία) έχει ένα ιώδες-μπλε χρώμα (l max = 570 nm). Ο σχηματισμός αυτής της έγχρωμης ένωσης χρησιμοποιείται στην ποσοτική δοκιμή α-αμινοξέων, η οποία μπορεί να ανιχνεύσει αμινοξέα ακόμη και σε ποσότητες τόσο μικρές όσο 1 μg.

Η προλίνη και η υδροξυπρολίνη, που δεν έχουν α-αμινο ομάδα, αντιδρούν με τη νινυδρίνη για να σχηματίσουν παράγωγα κίτρινος(l max = 440 nm). Η αντίδραση δεν είναι συγκεκριμένη, γιατί Η αμμωνία και οι ενώσεις που περιέχουν μια αμινομάδα (αμίνες, πρωτεΐνες, πεπτίδια) παράγουν επίσης ένα έγχρωμο προϊόν με νινυδρίνη. Ωστόσο, δεν απελευθερώνεται CO 2 με αυτές τις ενώσεις. Η απελευθέρωση διοξειδίου του άνθρακα είναι χαρακτηριστική μόνο των α-αμινοξέων. Η αντίδραση χρησιμοποιείται για χρωματομετρικό ποσοτικό προσδιορισμό των α-αμινοξέων, συμπεριλαμβανομένων των αυτόματων αναλυτών αμινοξέων (μέτρηση όγκου CO 2).

Η αντίδραση νινυδρίνης χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της γλυκίνης, ισολευκίνης, λευκίνης. λιγότερο έντονο χρωματισμό δίνουν σερίνη, φαινυλαλανίνη, κυστεΐνη, τυροσίνη, τρυπτοφάνη κλπ.

Τα προϊόντα που προκύπτουν χαρακτηρίζονται από ένα αρκετά έντονο χρώμα (e = 1,8–3,3·10 4), αλλά τα έγχρωμα προϊόντα είναι ασταθή. Η ένταση του χρώματος μειώνεται γρήγορα. Προστίθεται CdCl 2 για σταθεροποίηση. Σχηματίζει σταθερά σύμπλοκα με τις ενώσεις που προκύπτουν. Το χλωριούχο κάδμιο επιταχύνει επίσης την αντίδραση.

Τα αμινοξέα και ορισμένες άλλες ενώσεις που περιέχουν μια αμινομάδα συμπυκνώνονται σε ένα αλκαλικό μέσο με 1,2-ναφθοκινόνη - 4-σουλφοξυλική για να σχηματίσουν κόκκινα, κίτρινα, πορτοκαλί παράγωγα της μονοιμίνης 1,2-ναφθοκινόνης.

Η αντίδραση χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό των α-αμινοξυλικών (βαλίνη, ισολευκίνη, λευκίνη κ.λπ.).

Για τον προσδιορισμό της τρυπτοφάνης, μπορεί να χρησιμοποιηθεί η αντίδραση με 4-διμεθυλαμινοβενζαλδεΰδη. Το προϊόν της αντίδρασης χρωματίζεται μωβ και η περιεκτικότητα σε τρυπτοφάνη στο αναλυόμενο διάλυμα προσδιορίζεται από την ένταση του χρώματος.

Θα πρέπει να σημειωθεί, ωστόσο, ότι αυτή η αντίδραση σπάνια χρησιμοποιείται στην ανάλυση τροφίμων.

Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των αμινοξέων που περιέχουν θείο, χρησιμοποιείται μια βρωματομετρική μέθοδος που βασίζεται στην ακόλουθη αντίδραση:

Ένα διάλυμα κυστεΐνης σε διάλυμα NaOH 1% χύνεται σε μια φιάλη με αλεσμένο πώμα, προστίθεται 0,1 N. διάλυμα βρωμικού καλίου, ξηρό βρωμιούχο κάλιο και οξινίστηκε με 10% HCl.

BrO 3 – + 5Br – + 6H + → 3Br 2 + 3H 2 O

Το βρώμιο που σχηματίζεται ως αποτέλεσμα της αντίδρασης, η ποσότητα του οποίου είναι ισοδύναμη με την ποσότητα του βρωμικού καλίου, αντιδρά με το αμινοξύ. Μετά από 10 λεπτά, προστίθεται ιωδιούχο κάλιο, το οποίο αντιδρά με βρώμιο που δεν αντέδρασε και το απελευθερωμένο ιώδιο τιτλοδοτείται με 0,1 N. διάλυμα θειοθειικού νατρίου με άμυλο ως δείκτη.

2I – + Br 2 → Br - + I 2

Η ποσότητα του θειοθειικού που χρησιμοποιείται για την τιτλοδότηση είναι ισοδύναμη με την ποσότητα βρωμίου που δεν αντέδρασε με το αμινοξύ. Με βάση τη διαφορά μεταξύ της ποσότητας του προστιθέμενου βρωμικού καλίου και του θειοθειικού, βρίσκεται η ποσότητα βρωμίου που εισήχθη στην αντίδραση με το αμινοξύ και επομένως η ποσότητα του αμινοξέος.

Η μεθειονίνη προσδιορίζεται με παρόμοιο τρόπο. Η μεθειονίνη οξειδώνεται σε σουλφόνη:

Αυτή η αντίδραση, υπό ορισμένες συνθήκες, καθιστά δυνατό τον ακριβή προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε μεθειονίνη.



Τα αμινοξέα μπορούν να ανιχνευθούν χρησιμοποιώντας χρωματικές αντιδράσεις: νινυδρίνη, ξανθοπρωτεΐνη, Foly, Milone, δοκιμή διουρίας κ.λπ. Αυτές οι αντιδράσεις είναι μη ειδικές, επειδή βασίζονται στην ανίχνευση μεμονωμένων θραυσμάτων στη δομή των αμινοξέων, τα οποία μπορούν επίσης να βρεθούν σε άλλες ενώσεις.

Αντίδραση νινυδρίνης, μια χρωματική αντίδραση που χρησιμοποιείται για τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό αμινοξέων, ιμινοξέων και αμινών. Όταν θερμαίνεται σε αλκαλικό περιβάλλον, η νινυδρίνη (αφυδατωμένη τρικετοϋδρίνη, C 9 H b O 4) με ουσίες που έχουν πρωτεύουσες αμινομάδες (-NH 2), σχηματίζεται ένα προϊόν που έχει σταθερό έντονο μπλε-ιώδες χρώμα με μέγιστη απορρόφηση περίπου 570 nm. Εφόσον η απορρόφηση σε αυτό το μήκος κύματος εξαρτάται γραμμικά από τον αριθμό των ελεύθερων αμινομάδων, η αντίδραση νινυδρίνης χρησίμευσε ως βάση για τον ποσοτικό προσδιορισμό τους με χρωματομετρία ή φασματοφωτομετρία. Αυτή η αντίδραση χρησιμοποιείται επίσης για τον προσδιορισμό δευτεροταγών αμινομάδων (>ΝΗ) σε ιμινοξέα - προλίνη και υδροξυπρολίνη. σε αυτή την περίπτωση, σχηματίζεται ένα λαμπερό κίτρινο προϊόν. Ευαισθησία - έως 0,01%. Η σύγχρονη αυτόματη ανάλυση αμινοξέων πραγματοποιείται με συνδυασμό ιοντοανταλλαγής διαχωρισμού αμινοξέων και ποσοτικού προσδιορισμού τους χρησιμοποιώντας την αντίδραση νινυδρίνης. Κατά τον διαχωρισμό μειγμάτων αμινοξέων, η χρωματογραφία χαρτιού σάς επιτρέπει να προσδιορίσετε κάθε αμινοξύ σε ποσότητα τουλάχιστον 2-5 μg.

Η ένταση του χρώματος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να κριθεί η ποσότητα των αμινοξέων.

Αυτή η αντίδραση είναι θετική όχι μόνο με ελεύθερα αμινοξέα, αλλά και με πεπτίδια, πρωτεΐνες κ.λπ.

Αντίδραση ξανθοπρωτεΐνηςεπιτρέπει την ανίχνευση αρωματικών αμινοξέων (φαινυλαλανίνη, τυροσίνη, ιστιδίνη, τρυπτοφάνη), με βάση την αντίδραση ηλεκτρόφιλης υποκατάστασης στον αρωματικό πυρήνα (νιτροποίηση).

Όταν το πυκνό νιτρικό οξύ δρα, για παράδειγμα, στην τυροσίνη, σχηματίζεται ένα κίτρινο προϊόν.

Φολ αντίδραση.Αυτή είναι μια αντίδραση στην κυστεΐνη και την κυστίνη. Κατά την αλκαλική υδρόλυση, το «ασθενώς δεσμευμένο θείο» στην κυστεΐνη και την κυστίνη διασπάται αρκετά εύκολα, με αποτέλεσμα το σχηματισμό υδρόθειου, το οποίο, αντιδρώντας με αλκάλια, παράγει θειούχα νάτριο ή κάλιο. Όταν προστίθεται οξικός μόλυβδος (II), σχηματίζεται ένα γκριζόμαυρο ίζημα θειούχου μολύβδου (II).

Περιγραφή της εμπειρίας. 1 ml διαλύματος κυστίνης χύνεται σε δοκιμαστικό σωλήνα, προστίθενται 0,5 ml διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου 20%. Το μίγμα θερμαίνεται μέχρι βρασμού και στη συνέχεια προστίθενται 0,5 ml διαλύματος οξικού μολύβδου(II). Παρατηρείται ένα γκριζόμαυρο ίζημα θειούχου μολύβδου(II):

Αντίδραση Zimmerman.Αυτή είναι μια αντίδραση στο αμινοξύ γλυκίνη.

Περιγραφή της εμπειρίας. Σε 2 ml διαλύματος γλυκίνης 0,1%, ρυθμισμένο με προσθήκη αλκαλικού διαλύματος 10% σε pH = 8, προσθέστε 0,5 ml υδατικού διαλύματος ο-φθαλικής διαλδεΰδης. Το μίγμα της αντίδρασης αρχίζει σιγά-σιγά να γίνεται φωτεινό πράσινο. Μετά από λίγα λεπτά, εμφανίζεται ένα πράσινο ίζημα.

Αντίδραση στην τρυπτοφάνη.Τρυπτοφάνη που αντιδρά μέσα όξινο περιβάλλονμε αλδεΰδες, σχηματίζει έγχρωμα προϊόντα συμπύκνωσης. Για παράδειγμα, με γλυοξυλικό οξύ (το οποίο είναι πρόσμιξη σε συμπυκνωμένο οξικό οξύ) η αντίδραση προχωρά σύμφωνα με την εξίσωση:

Η αντίδραση της τρυπτοφάνης με τη φορμαλδεΰδη προχωρά σύμφωνα με ένα παρόμοιο σχήμα.

Η αντίδραση του Σακαγκούτσι.Αυτή η αντίδραση στο αμινοξύ αργινίνη βασίζεται στην αλληλεπίδραση της αργινίνης με την α-ναφθόλη παρουσία ενός οξειδωτικού παράγοντα. Ο μηχανισμός του δεν έχει ακόμη αποσαφηνιστεί πλήρως. Προφανώς, η αντίδραση πραγματοποιείται σύμφωνα με την ακόλουθη εξίσωση:

Εφόσον τα παράγωγα των κινονεϊμινών (στην περίπτωση αυτή, η ναφθοκινόνη), στα οποία το υδρογόνο της ιμινοομάδας –NH– αντικαθίσταται από μια ρίζα αλκυλίου ή αρυλίου, έχουν πάντα κίτρινο-κόκκινο χρώμα, τότε, προφανώς, το πορτοκαλοκόκκινο χρώμα του διάλυμα κατά την αντίδραση Sakaguchi εξηγείται από την εμφάνιση του παραγώγου ναφθοκινονεϊμίνης. Ωστόσο, δεν μπορεί να αποκλειστεί η πιθανότητα σχηματισμού μιας ακόμη πιο πολύπλοκης ένωσης λόγω περαιτέρω οξείδωσης των υπόλοιπων ομάδων NH του υπολείμματος αργινίνης και του βενζολικού δακτυλίου της α-ναφθόλης:

Περιγραφή της εμπειρίας. 2 ml διαλύματος αργινίνης 0,01% χύνονται σε δοκιμαστικό σωλήνα, στη συνέχεια προστίθενται 2 ml διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου 10% και μερικές σταγόνες διαλύματος αλκοόλης 0,2% α-ναφθόλης. Τα περιεχόμενα του δοκιμαστικού σωλήνα αναμειγνύονται καλά, προστίθενται 0,5 ml διαλύματος υποβρωμίτη και αναμειγνύονται ξανά. Προσθέστε αμέσως 1 ml διαλύματος ουρίας 40% για να σταθεροποιήσετε το ταχέως αναπτυσσόμενο πορτοκαλοκόκκινο χρώμα.

Αντίδραση διουρίας– χρησιμοποιείται ως χρωματική αντίδραση σε πρωτεΐνες. Σε αλκαλικό περιβάλλον παρουσία αλάτων χαλκού(ΙΙ) δίνουν ιώδες χρώμα. Το χρώμα οφείλεται στο σχηματισμό μιας ένωσης συμπλόκου χαλκού(II) λόγω της πεπτιδικής ομάδας -CO-NH-, που είναι χαρακτηριστικό των πρωτεϊνών. Αυτή η αντίδραση πήρε το όνομά της από ένα παράγωγο ουρίας - διουρία, το οποίο σχηματίζεται όταν η ουρία θερμαίνεται με την αποβολή της αμμωνίας:

Εκτός από τις πρωτεΐνες και τη διουρία, τον ίδιο χρωματισμό δίνουν και άλλες ενώσεις που περιέχουν αυτήν την ομάδα: αμίδια, ιμίδια καρβοξυλικών οξέων, καθώς και ενώσεις που περιέχουν τις ομάδες -CS-NH- ή =CH-NH- στο μόριο. Πρωτεΐνες, ορισμένα αμινοξέα, πεπτίδια, διουρία και μεσαίες πεπτόνες αντιδρούν επίσης.

Το χρώμα του συμπλόκου που λαμβάνεται από την αντίδραση διουρίας με διάφορα πεπτίδια είναι κάπως διαφορετικό και εξαρτάται από το μήκος της πεπτιδικής αλυσίδας. Τα πεπτίδια με μήκος αλυσίδας τεσσάρων υπολειμμάτων αμινοξέων και άνω σχηματίζουν ένα κόκκινο σύμπλοκο, τα τριπεπτίδια - μωβ και τα διπεπτίδια - μπλε.

μορφή κετόνης του πολυπεπτιδίου

μορφή ενόλης του πολυπεπτιδίου

Όταν ένα πολυπεπτίδιο αλληλεπιδρά με το Cu (OH) 2, σχηματίζεται ένα σύμπλοκο, η δομή του οποίου μπορεί να παρουσιαστεί ως εξής.