Regulator kolektivnog ponašanja ("quorum sensing") kod bakterija. Bakterije, šuti! Kako i zašto ometati međustaničnu komunikaciju Quorum sensing ili socijalno ponašanje bakterija

Stvaranje, rast i migracija planktonskih staničnih oblika za naseljavanje u biofilmovima regulirani su na populacijskoj razini kroz mehanizme međustanične komunikacije. "Quorum sensing" (QS) je proces kolektivne koordinacije ekspresije gena u bakterijskoj populaciji koji posreduje u specifičnom ponašanju stanica. Mehanizam rada QS-a temelji se na složenoj hijerarhijskoj regulaciji ciljnih lokusa genoma bakterijske stanice. U ovom slučaju, regulacija se provodi na različitim razinama utjecaja: transkripcijska, translacijska, posttranslacijska.

Stanice u populaciji reagiraju na određeni stanični signal specifičnim odgovorom. Do danas je utvrđeno da međustanični odnosi utječu na intrapopulacijsku diferencijaciju stanica, ekspresiju gena virulencije, reguliraju procese rasta, prirodu i smjer pokretljivosti (taksije), kao i bakterijsku apoptozu i stvaranje toksina.

Rad QS-a može se usporediti s hormonskom regulacijom funkcionalne aktivnosti različitih organa i tkiva u višestaničnom organizmu.

Gram-pozitivni i gram-negativni mikroorganizmi koriste različite signalne sustave i različite kemijske prijenosnike signala. Prvi sintetiziraju 7-8-člane peptide (Enterococcus spp.), ciklopeptide (Staphylococcus spp.); drugo: različiti acil-homoserin laktoni (AHL).

Razmotrite rad QS-a na primjeru Pseudomonas aeruginosa. Ovaj mikroorganizam ima najmanje tri regulatorna sustava. Najproučavaniji od njih je LasI - LasR sustav (AHL s dugim acilnim lancem djeluje kao kemijski signal); RhlI - RhlR sustav (glasnik - AHL s kratkim acilnim lancem, C4-HSL); i kinolonski PQS sustav. Interakcija ova tri sustava omogućuje reguliranje ekspresije oko 6-10% genoma. U sustavu LasI - LasR za biosintezu signalnih molekula odgovorna je AHL sintaza, produkt lasI gena. Njegova ekspresija je na bazalnoj razini, tako da akumulacija signalnih molekula traje dugo, a biološki učinak počinje se manifestirati tek u stacionarnoj fazi rasta populacije. U stanicama AHL stupa u interakciju s LasR proteinom (produkt lasR gena, čija je ekspresija također na bazalnoj razini), tvoreći homodimer, regulator transkripcije. Ovaj regulator aktivira mnoge gene koji sudjeluju u stvaranju virulencije, au procesima stvaranja biofilma također aktivira las Box kromosomski regulon koji je odgovoran za ekspresiju razni faktori patogenost (proteaza, elastaza itd.). LasR + AHL kompleks aktivira drugi signalni sustav. To se događa nakon interakcije s promotorom gena Rhl. Ekspresija RhlI uzrokuje stvaranje proteina za sintezu AHL s kratkim acilnim ostacima (C4-HSL). Gen rhlR kodira protein (RhlR) koji stupa u interakciju s C4-HSL signalnim molekulama. Rezultirajući proteinski tandem RhlR + C4-HSL regulira transkripciju gena koji kodiraju različite strukturne spojeve matrice biofilma (alginat, ramnolipid itd.), kao i lipazu i piocijanin. Također, ovaj transkripcijski regulator aktivira ekspresiju drugog regulatora - RpoS (sigma faktor stacionarne faze rasta P. aeruginosa), koji inicira stvaranje stresnih proteina u stanici i sudjeluje u adaptivnim reakcijama. Među kliničkim izolatima P. aeruginosa utvrđeno je da uz funkcioniranje AHL signalnih sustava paralelno ulazi i kinolonski sustav (lokus gena - pqsABCDE), glasnici su hidroksialkilkinoloni i hidroksiheptilkinoloni. Ovaj sustav funkcionira na isti način kao gore opisani regulatorni mehanizmi i posreduje u povećanju ekspresije čimbenika virulencije, posebice sinteze elastaze i lektina. Interakcija triju signalnih sustava utječe veliki broj gena, u vezi s kojima postoji globalna regulacija transkripcije, što dovodi do vrlo fleksibilne labilnosti fizioloških procesa stanice, a posljedica je ogromnog adaptivnog potencijala bakterija u populaciji.

Signalni sustavi rade na principu autoindukcije, sintetizirane signalne molekule djeluju na vlastitu stanicu, a nakupljanjem u izvanstaničnom okolišu aktivira se sve više ovisnih promotora, regulona staničnog genoma. QS temeljen na AHL-u pronađen je u mnogim Gram-negativnim bakterijama: Acinetobacter, Aeromonas, Brucella, Burkholderia, Erwinia, Enterobacter, Chromobacterium, Hafnia, Serratia, Vibrio, Yersinia itd. strukture same signalne molekule.

Međutim, među kliničkim izolatima gram-negativnih bakterija često se uočava unakrsna komunikacija, koja osigurava interakciju populacija različitih vrsta u žarištu infekcije. Cross-QS može aktivirati i inhibirati ovisne ciljne gene u bakterijskim udruženjima. Na primjer, P. aeruginosa, Serratia liquefaciens, Aeromonas hydrophila sintetiziraju jednu vrstu signalnih molekula. QS C.violaceum i A.hydrophila je inhibiran AHL molekulama s dugim acilnim ostacima, koje sintetiziraju različiti gram-negativni mikroorganizmi. Pseudomonas aeruginosa stvara signalne molekule s dugim i kratkim acilnim ostacima i one nisu međusobno inhibirane, no E. coli glasnici iste molekularne strukture s dugim acilnim ostacima mogu inhibirati signalni sustav P. aeruginosa rhl. U mješovitim biofilmovima P.aeruginosa i Burkholderia cepacia, Burkholderia reagira na signale iz Pseudomonas aeruginosa (koja je pak neosjetljiva na signale B.cepacia), dakle, populacija P.aeruginosa regulira mnoge fiziološke procese svog suradnika. Postoje dokazi da neki sojevi P. aeruginosa izolirani iz bolesnika s iscidozom nisu sposobni sami sintetizirati autoinduktore RHL-signalnog sustava, što rezultira smanjenjem virulencije i nepotpunim stvaranjem biofilmova u in vitro eksperimentima. No, međutim, in vivo, isti sojevi Pseudomonas aeruginosa formiraju potpune biofilmove. Utvrđeno je da mikroflora izolirana iz sluzi istih pacijenata sintetizira rhl-autoinduktore, regulirajući tako virulentnost i stvaranje biofilmova P. aeruginosa te inicirajući infektivni proces. Same AHL molekule različito utječu na druge skupine bakterija; Signalne molekule prokariota također mogu utjecati na ponašanje gljivičnih, biljnih, pa čak i životinjskih stanica. Dakle, P. aeruginosa AHL potiskuje proces filamentacije Candide albicans.

Kod ljudi molekule AHL inhibiraju proliferaciju leukocita i stvaranje faktora tumorske nekroze b. Pri visokim koncentracijama, AHL započinje apoptozu različiti tipovi imunokompetentne stanice. Općenito, bakterijski autoinduktori imaju imunosupresivni učinak. Upravo zahvaljujući QS reakcijama ostvaruju se “društveni” odnosi unutar populacije, formira se “kemijska komunikacijska mreža” biofilma koja može pokriti viševodnu zajednicu.

Ništa manje zanimljiv nije ni rad signalnih sustava među gram-pozitivnim mikroorganizmima. Na primjer, Enterococcus spp. QS regulira prijenos plazmida (od stanica donora do stanica primatelja) putem mehanizma konjugacije. Stanica primateljica sintetizira specifičan peptidni signal (“spolni” bakterijski feromon), koji se nakuplja u mediju i specifično veže na receptore stanica donora koje nose plazmid koji odgovara tom feromonu. Regulacijski sustav pokrenut u ovom slučaju osigurava ekspresiju čimbenika koji posreduju međustaničnu interakciju i prijenos plazmida (komponente konjugacije). Kao što je gore navedeno, određeni feromon odgovara određenom plazmidu. Zbog tako strogog mehanizma interakcije provodi se bakterijska selekcija stanica unutar biofilma. Putem takve komunikacije translociraju se plazmidi koji nose gene otpornosti na antibiotike, gene za hemolizine i bakteriocine. Tipično, biološki aktivni signalni peptidi kodirani su u kromosomu, a receptorski proteini koji osiguravaju afinitet za feromone kodirani su u samim plazmidima. Nakon translokacije plazmida u stanicu primatelja, počinje sinteza feromonskih inhibitora, svaka vrsta feromona ima svoj inhibitor. Ovo svojstvo vam omogućuje da isključite signal za postojeći plazmid i pojačate nakupljanje feromonskih molekula za drugu vrstu plazmida. biofilm stanica mikroorganizma

Zbog djelovanja takvog sustava u populaciji biofilma neprestano se odvija pozitivna selekcija sojeva s korisnim svojstvima i negativna selekcija - eliminacija sojeva s "nepotrebnim" fenotipovima. Na zarazne lezije takvi komunikacijski mehanizmi za prijenos mobilnih genetskih elemenata omogućuju distribuciju gena otpornosti na antibiotike, virulencije i dodatnih fizioloških sposobnosti maksimalnom brzinom.

Od najvećeg je interesa QS koji sudjeluje u regulaciji ekspresije čimbenika virulencije kod stafilokoka. Genetska osnova ovog sustava je agrABCD – kromosomski lokus. Kao prijenosnici signala djeluju ciklopeptidi – autoinduktori (AIP, auto-inducing peptide), koji se prema strukturi i biološkom učinku svrstavaju u skupine i podskupine, npr. podskupine 1 i 4 kod S. aureusa pojačavaju ekspresiju faktora virulencije. Ove molekule su izrazito specifične, zamjena čak i jedne aminokiseline u strukturi spoja dovodi do gubitka biološke funkcije. Kao i kod primjera signalno-inhibitorskog sustava kod enterokoka, stafilokokni sustav reagira samo na jednu vrstu autoinduktora, čim stanica primi određeni signal, aktiviraju se inhibitorni geni i stanica više nije u stanju percipirati druge signale . Ovaj mehanizam osigurava strogu selekciju populacije. Sintetizirane signalne molekule stupaju u interakciju s membranskim sustavom histidin kinaze (agrC), koji aktivira regulator transkripcije (agrA) kroz kaskadu reakcija. Ovaj protein bifunkcionalno regulira dva promotora P2 i P3. Sukladno tome, transkripti ovih zavisnih gena su RNA II i RNA III, prva sadrži glavne agr gene, čime se manifestira autoinduktivni odgovor sustava. Zauzvrat, RNA III osigurava regulaciju sinteze faktora virulencije (DNaza, fibrinolizin, enterotoksin, b-, c-, d-toksini, itd.). Zanimljiva značajka u ovoj fazi regulacije je da 500 bp RNA III transkript ne nosi nikakve kodirane informacije, osim jednog otvorenog okvira za čitanje za d-toksin. Velika većina same transkriptne molekule djeluje kao ribosomski inhibitor. RNA III blokira proces translacije faktora potiskivanja virulencije Rot (represora toksina), koji regulira sintezu stafilokoknih toksina, što rezultira nekontroliranim stvaranjem egzotoksina. Dakle, agr sustav osigurava populacijsku regulaciju ekspresije čimbenika virulencije stafilokoka. Koristeći različite varijante PCR studija, utvrđeno je da se ekspresija agr-lokusa u stanicama opaža u mnogim stafilokoknim lezijama: kožne infekcije, endokarditis, artritis, sepsa. Populacija biofilma akumulira signalne molekule koje sintetizira velika većina stanica, koje su metabolička i genetska "jezgra, kvorum" populacije, određuju metaboličko ponašanje, fenotipske promjene za sve stanice. To je zbog akumulacije signala putem svojstva autoindukcije i inhibicije drugih signala sintetiziranih od strane manjine, ili općenito od strane drugih sojeva u biofilmu, zbog paralelnog mehanizma inhibicije. 1.5. Klinički značaj biofilmova.

Ideje o biofilmovima, potvrđene korištenjem modernim metodama vizualizacije, promijenili način na koji gledamo zarazne bolesti. Svi novi podaci ukazuju da se kronične infekcije bitno razlikuju od akutnih infekcija stvaranjem biofilma, a fagociti makroorganizama nisu u stanju apsorbirati biofilmove, za razliku od pojedinačnih. bakterijske stanice.

Postojanje biofilma kod kroničnih infekcija zahtijeva potpuno nove pristupe njihovoj dijagnostici i liječenju. Osim toga, tradicionalne bakteriološke metode ne otkrivaju većinu bakterija uključenih u infektivni proces. Najnovijim molekularnim, genomskim, transkripcijskim i proteomskim metodama utvrđeno je da se pri izdvajanju čiste kulture utvrđuje samo oko 1% stanica patogenih mikrobiocenoza. Kao rezultat toga, tretman cilja samo 1-2 bakterijske vrste od mnogih sojeva prisutnih u biofilmu (možda uključujući gljivice).

Do danas je pouzdano dokazana uloga mikrobnih biofilmova u nastanku i razvoju tako čestih bolesti kao što su infekcije povezane s vaskularnom kateterizacijom uzrokovane Staphylococcus aureusom i drugim gram-pozitivnim mikroorganizmima; infekcije srčanih zalistaka i zglobnih proteza uzrokovane stafilokokom; parodontitis uzrokovan nizom oralnih mikroorganizama; infekcije mokraćnog sustava određene E. coli i drugim patogenima; infekcije srednjeg uha - uzročnici npr. Haemophilus influenzae, cistična fibroza uzrokovana P. aeruginosa itd.

Sve ove bolesti je teško liječiti, imaju visoku stopu recidiva, a neke od njih mogu izazvati smrtni slučajevi. Mehanizmi kojima mikroorganizmi koji stvaraju biofilm uzrokuju patoloških procesa u makroorganizmu.

Osim u tkivima domaćina, mikrobni biofilmovi koloniziraju razne nebiološke medicinske naprave unesene u ljudsko tijelo (kateteri, pacemakeri, srčani zalisci, ortopedski uređaji). Studije implantiranih medicinskih uređaja pomoću elektronske mikroskopije pokazale su prisutnost bakterijskih biofilmova.

Sve veća otpornost na antibiotike i razvoj bakterijskih biofilmova glavni su izazovi u liječenju infekcija mokraćnog sustava.

Utvrđeno je da svojstva stanica i izvanstaničnog matriksa stoje u osnovi povećane otpornosti. Matrica biofilma može ali ne mora vezati i/ili inaktivirati antibiotike. Otpornost zbog svojstava stanica biofilma objašnjava se smanjenjem njihove slobodne površine zbog međusobnog kontakta i stvaranja posebnih bakterija, zvanih perzisteri.

Perzisteri su altruistične stanice koje nastaju u stacionarnoj fazi rasta, metabolički su neaktivne i osiguravaju preživljavanje majčine populacije u prisutnosti čimbenika koji su smrtonosni za sve stanice. U biofilmovima ta subpopulacija iznosi 1-5% ukupne stanične mase. Nastanak takvih stanica ovisi o stupnju rasta populacije, u log fazi kultura ne stvara ili stvara vrlo mali udio perzistera, njihov broj raste prema stacionarnoj fazi. Formiranje subpopulacije obrnuto je ovisno o razini metaboličke aktivnosti svih stanica biofilma, kao i o djelovanju egzogenih nepovoljnih čimbenika. Fenotip perzistera karakterizira zanimljiva biologija, usporavaju sve fiziološke procese i postaju tolerantni na djelovanje različitih čimbenika, uključujući i učinke antimikrobnih lijekova.

Svojstvo tolerancije na antibiotike razlikuje se od mehanizama rezistencije. Djelovanje svih mehanizama bakterijske rezistencije, u biti, može se svesti na jedan fenomen - to je sprječavanje interakcije antibiotika s njegovom metom (zbog promjena u samim metama ili kroz sintezu enzima koji neutraliziraju antibiotike). ). Tolerancija je posredovana sposobnošću mikrobne stanice da preživi u prisutnosti antibiotika usporavanjem metabolizma i "isključivanjem" glavnih bioloških procesa stanice.

Glavni mehanizmi povećanja otpornosti bakterija na antibiotike u biofilmovima su:

1. ograničavanje prodiranja antibiotika kroz biofilmove;

2. restrikcija hrane i promijenjeno mikrookruženje u biofilmu dovode do smanjenja stope diobe bakterija, zbog čega je manje meta za djelovanje antibiotika;

3. adaptacijske reakcije;

4. varijabilnost gena kod bakterija koje perzistiraju u biofilmu.

Na temelju prikupljenih podataka proizlazi da se antibiotici dijele u dvije vrste prema djelovanju na bakterije u biofilmu. Prvi uključuje antibiotike koji prodiru u biofilm i inhibiraju ili ubijaju mikroorganizme koji ga tvore. Druga vrsta su antibiotici, koji praktički ne prodiru u biofilmove, ali učinkovito sprječavaju njihovo naseljavanje zbog migrirajućih bakterija. Dakle, neki antibiotici ne prodiru u biofilmove i ne uništavaju postojeće zajednice, već samo sprječavaju njihovo povećanje broja i distribuciju u ljudskom tijelu. S tim u vezi, posljednjih su godina započela istraživanja o sposobnosti antibiotika da prodru kroz biofilmove raznih mikroba.

Utvrđeno je da ampicilin slabo prodire u biofilm Klebsiella pneumoniae, a ampicilin, ko-trimaksosol i vankomicin slabo prodiru u zajednice Enterococcus faecalis. Široko korišteni amoksicilin slabo prodire kroz biofilmove niza mikroba.

Fluorokinoloni su među antibioticima koji dobro prodiru u stanične lipide. Ova skupina antimikrobnih lijekova može djelovati na glavne patogene. urološke bolesti, u dovoljnoj koncentraciji prodire u žarište infekcije. Postojeća iskustva s primjenom antibiotika pokazuju da s infektivnim procesom, prvenstveno s njegovim kliničke manifestacije, može se liječiti antibioticima, i penetrirajućim i nepenetrirajućim biofilmovima. Međutim, postoji razlika između njih, i to prilično značajna. Pokazalo se da se razlike između biofilmova koji prodiru i ne prodiru antibioticima mogu manifestirati u dugoročnim rezultatima liječenja. Primjena antibiotika koji ne prodiru dobro u biofilm vrlo brzo dovodi do stvaranja i selekcije rezistentnih sojeva. Osim toga, češće se javljaju recidivi i formiraju se žarišta kroničnih procesa.

Terapeutski učinak na biofilmove može biti usmjeren na mehanizme početnog prianjanja bakterija na površinu, blokiranje sinteze ili razaranja polimerne matrice, poremećaj međustanične razmjene informacija, a može se kombinirati i sa samim baktericidnim agensima. Takav tretman, koji utječe na strukturu ili funkciju biofilma, može biti učinkovitiji od standardne antibiotske terapije.

Ovaj grafikon ilustrira rad "molekularnog prekidača" koji regulira ponašanje svjetleće bakterije. Vibrio harveyi ovisno o koncentraciji dviju signalnih tvari (AI-1 i AI-2) koje bakterije koriste za međusobnu komunikaciju. Po vodoravnim osima je koncentracija dviju tvari, okomita os je recipročna vrijednost snage reakcije bakterije na dati kemijski signal. Vidi se da “molekularni prekidač” ima tri stabilna stanja: “plavo” (koncentracije obje tvari su visoke, reakcija je maksimalna), “zeleno” (koncentracija jedne od tvari, bilo koje od dvije, je visoka, a druga je niska, reakcija je srednja) i "crvena" (koncentracije obje tvari su niske, reakcija je minimalna). Riža. iz predmetnog članka PLoS biologija

Mnogi živi organizmi donose kolektivne odluke demokratski kroz takozvani "osjećaj kvoruma". Često se to očituje u činjenici da se povećanjem napučenosti cjelina pojedinaca pretvara u organizirani tim (zajednica, jato, gomila). Osnovni principi takve transformacije slični su u različitim organizmima – od bakterija do životinja. O tome svjedoče rezultati dviju novih studija, od kojih je jedna provedena na svjetlećim bakterijama, a druga na atlantskoj haringi. Bakterije počinju zajedno svijetliti kada se dosegne granična koncentracija tvari koje luče, a kod riba doba dana i prag gustoće naseljenosti služe kao signal za formiranje višemilijunskih organiziranih jata.

"Osjećaj kvoruma" ( Osjećaj kvoruma) je mehanizam raširen u prirodi koji omogućuje skupinama organizama da izvode usklađene, koordinirane radnje - baš kao što to stanice višestaničnog organizma stalno čine. Međutim, u višestaničnom organizmu koherentnost ponašanja stanica osiguravaju posebni centralizirani sustavi upravljanja (na primjer, živčani sustav). U skupini zasebnih neovisnih organizama obično nema takvih centraliziranih kontrolnih sustava, pa se koordinacija akcija osigurava na druge načine, uključujući korištenje "osjećaja kvoruma".

Taj se fenomen najbolje proučava u jednostaničnim organizmima, kod kojih se koherentno grupno ponašanje obično temelji na nekoj vrsti kemijskog "glasovanja". Na primjer, sve bakterije u populaciji izlučuju signalnu tvar, a kada koncentracija te tvari u okolišu dosegne određenu vrijednost praga, sve stanice mijenjaju svoje ponašanje usklađeno (na primjer, počinju osjećati "privlačenje" jedna prema drugoj i skupljaju se u velike grozdove). Na molekularnoj razini, promjena u ponašanju mikroba osigurava se oštrom (ponekad grčevitom) promjenom razine aktivnosti određenih gena kao odgovor na graničnu razinu ekscitacije receptora koji reagiraju na signalnu tvar. Jedan od prvih objekata koji je proučavao osjećaj kvoruma bila je svjetleća bakterija. Vibrio fischeri, koji se spominje u bilješci Simbioza lignje sa svjetlećim bakterijama ovisi o jednom genu, "Elementi", 06.02.2009.

Gužva je obično ključni signal koji pokreće transformaciju mnogih različitih pojedinaca u jedinstvenu kohezivnu zajednicu. Na primjer, Vibrio fischeri ne svijetli sve dok je gustoća mikrobne populacije niska. No, po dostizanju određenog praga gustoće (što se događa, primjerice, u svjetlećem organu lignje, gdje bakterije imaju idealne uvjete za život), svi mikrobi počinju svijetliti odjednom, a lignja dobiva svjetiljku za lov po mraku.

U višestaničnim organizmima, "osjećaj kvoruma" i brze koordinirane promjene ponašanja također su široko rasprostranjeni, iako su manje poznati nego u jednostaničnim organizmima. Ponekad prijelaz iz individualnog života u koherentno grupno ponašanje može biti uistinu dramatičan, kao u slučaju skakavca (vidi: Serotonin pretvara skromne pustinjske skakavce u grabežljive pljačkaše u dva sata, "Elementi", 10.02.2009.). Karakteristično je da je kod skakavaca prijelaz na ponašanje krda reguliran gustoćom populacije (napučenošću), na isti način kao i svjetlinom. Vibrio fischeri.

Prošli tjedan objavljena su dva zanimljiva članka o proučavanju osjećaja kvoruma kod dva vrlo različita organizma – svjetlećih bakterija. Vibrio harveyi(bliska rodbina V. fischeri) i u atlantskoj haringi. Oba rada temelje se na primjeni novih metoda, au oba slučaja riječ je o radikalnoj promjeni opsega razmatranja predmeta istraživanja. U slučaju mikroba, ljestvica je smanjena do detalja: obično se proučava kombinirani odgovor velikih populacija mikroba (na primjer, ukupna snaga sjaja), ali u ovom slučaju istraživači su zabilježili promjene u ponašanja pojedinih mikroba. Pri proučavanju vrlo velikih objekata, kao što su višemilijunska jata haringi, obično se treba ograničiti na male uzorke, iz kojih je teško prosuditi jato kao cjelinu. Međutim, ovaj put istraživači su koristili metodu visokoosjetljivog eholokacijskog skeniranja velikih vodenih površina izumljenu prije tri godine ( Makris i sur., 2006. (enciklopedijska natuknica).), što je omogućilo promatranje formiranja jata dugih nekoliko desetaka kilometara u stvarnom vremenu.

Ponašanje haringe promatrano je u području njenog mrijesta zaljev Maine jesen 2006. Pokazalo se da se tijekom mrijesta haringe svake večeri samoorganiziraju u goleme skupine do četvrt milijarde jedinki, koje udruženo i prijateljski plivaju u plitkoj vodi u kojoj se haringe mrijeste.

Tijekom dana ribe plivaju odvojeno blizu dna na dubokim mjestima, gdje ima mnogo manje grabežljivaca nego u plitkoj vodi. Nedugo prije zalaska sunca, haringa se počinje postupno nakupljati na dubini od 160 do 190 m. U početku se gustoća ribe polako povećava. Međutim, u trenutku kad gustoća dosegne graničnu vrijednost od 0,2 ribe po četvornom metru, ponašanje ribe radikalno se mijenja. Ribe iznenada jure jedna prema drugoj i formiraju gustu skupinu (do 2-5 riba po kvadratnom metru), koja postaje neka vrsta "centra kristalizacije" za divovsko jato. Od ovog početnog okupljanja brzo se širi "val" promijenjenog ponašanja: ribe vide da su njihovi rođaci već požurili skupljati, a same počinju plivati ​​jedna prema drugoj.

Kao rezultat toga, nakupljanje ribe raste brzinom koja je za red veličine veća od brzine kojom pojedinačna riba može plivati. Na kraju se formira gusto jato dugo do 20-30 km i široko oko 3-4 km, koje se proteže od zapada prema istoku na dubini od 160-190 m duž sjeverne padine plićaka za mrijest. Tada sva ta ogromna masa ribe počinje koordinirano kretanje prema jugu i do mjesta mrijesta. Sada se kretanje događa upravo onom brzinom kojom haringa obično pliva. Prednji rub jata u kretanju je ravan i jasan, stražnji rub je neravan i zamagljen zbog “zaostataka” koji se i dalje izvlače iz dubine. Haringa se mrijesti noću na dubini od oko 50 m, a do zore se jato razilazi do sljedeće večeri.

Koji je smisao takvog ponašanja? Prvo, mrijest je kod haringe kolektivna stvar, ženke se moraju mrijestiti zajedno, a mužjaci je moraju zajednički oplođivati, tako da je sinkronizacija ponašanja ovih riba vrlo važna. Drugo, većina grabežljivaca preferira loviti haringe u plitkoj vodi, tako da je korisno da riba stigne na mjesto mrijesta u velikim skupinama (vidi: Javni stil života povećava stabilnost sustava predator-plijen, "Elementi", 29.10.2007.), što brže obave svoj posao i vrate se na relativno sigurnu dubinu.

Studija je pokazala da se kod haringe, kao i kod drugih organizama s "osjećajem za kvorum", iznenadna promjena u ponašanju i transformacija neorganiziranog skupa jedinki u uređenu cjelinu događa kao odgovor na postizanje granične koncentracije jedinki (u ovom slučaju , prag gustoće je 0,2 jedinke po kvadratnom metru). Kojim se signalima - vizualnim ili, recimo, mirisnim - haringa vodi pri procjeni gustoće populacije još uvijek nije poznato, a vrlo je teško saznati.

Mnogo je lakše razumjeti fiziološke mehanizme "osjećaja kvoruma" kod bakterija koje nemaju ni vid, ni sluh, ni živčani sustav i kojima je, dakle, dostupan samo jedan način komunikacije - kemijski, analogan komunikaciji mirisa kod životinja.

Međutim, molekularni genetski sustavi koji omogućuju "osjećanje kvoruma" kod bakterija mogu biti vrlo složeni, što se jasno vidi na primjeru svjetlećeg mikroba. Vibrio harveyi. Ove bakterije izlučuju u okolinu tri signalne tvari - "autoinduktore" (autoinducers, AI). Svaka tvar odgovara receptoru koji reagira na prisutnost "svoje" tvari u okolini. Sva tri receptora prenose primljeni signal u stanicu aktiviranjem regulatornog proteina LuxU. On, pak, aktivira drugi protein (LuxO), koji aktivira nekoliko gena koji kodiraju male regulacijske RNA. Te regulatorne RNA blokiraju rad gena koji kodira protein LuxR. Potonji je ključni sudionik regulacijske kaskade: o njemu ovisi aktivnost mnogih gena, uključujući i one zbog kojih bakterija svijetli.

Naravno, ovaj složeni sustav je potreban ne samo za regulaciju luminiscencije. O njemu ovise mnogi drugi aspekti ponašanja bakterije, no sjaj je najlakše registrirati i mjeriti. U ovom regulatornom sustavu mnogi detalji su već poznati, ali nešto ostaje misteriozno. Na primjer, nije jasno zašto su nam potrebne čak tri različite signalne tvari i tri receptora za njih, ako se sve u konačnici svodi na isti rezultat: ili gen LuxR upali se, pa mikrobi svijetle, ili se ugasi, pa se bakterije ugase. A stvar se bitno ne mijenja činjenicom da LuxR regulira mnogo različitih gena, a ne samo “sjajne gene”. Svejedno, rad svih kontroliranih sustava ovisi samo o jednoj varijabli: stupnju aktivnosti gena LuxR. Čini se da se bakterije lako snalaze s jednom signalnom tvari i jednim receptorom, odnosno jednom “ulaznom” varijablom, kako bi regulirale jednu “izlaznu” varijablu. Međutim, iz nekog razloga bakterije drugačije razmišljaju i međusobno komuniciraju pomoću tri različite signalne tvari.

Kako bi razumjeli ovaj težak problem, istraživači su dizajnirali nekoliko genetski modificiranih sojeva. vibrio harveyi, u kojem je sustav kemijske komunikacije bio znatno pojednostavljen. Prvo je gen koji kodira jedan od tri receptora uklonjen iz svih bakterija. Sada su mikrobi mogli reagirati samo na dvije od tri signalne tvari (AI-1 i AI-2). Drugo, onesposobljeni su geni potrebni za proizvodnju signalnih tvari. To je učinjeno kako bi istraživači mogli držati koncentraciju AI-1 i AI-2 pod svojom punom kontrolom. Treće, pričvrstili su gen za zeleni fluorescentni protein na regulatorno mjesto (promotor) jedne od malih regulatornih RNA uključenih u regulatornu kaskadu. To im je omogućilo da procijene stupanj aktivacije regulacijske kaskade "osjećaja kvoruma" prema snazi ​​fluorescencije pojedinačnih bakterijskih stanica s puno većom točnošću i detaljima nego što bi se to moglo učiniti prema snazi ​​prirodne luminescencije bakterija .

Pokazalo se da obje signalne tvari (AI-1 i AI-2) djeluju na sustav gotovo na isti način, a sustav može biti u jednom od tri stabilna stanja:

1) Ako je koncentracija obje tvari niska, bakterije aktivno proizvode zeleni fluorescentni protein. To znači da je sinteza LuxR proteina obustavljena, pa su stoga aktivni svi geni koje blokira LuxR protein, a svi geni koje ovaj protein aktivira su isključeni (uključujući gene odgovorne za prirodno svijetljenje ).

2) Ako koncentracija bilo koji dviju tvari - AI-1 ili AI-2 - raste do granične vrijednosti (koja odgovara približno jednoj molekuli tvari po volumenu koji zauzima jedna bakterija), tada zelena fluorescencija osjetno slabi, ali ne prestaje u potpunosti. Ovo "srednje" stanje je prilično stabilno. Razina fluorescencije ostaje gotovo nepromijenjena u širokom rasponu koncentracija signalnih tvari - samo ako je koncentracija jedne od tvari bila veća, a druga - manja od razine praga.

3) Konačno, ako koncentracija oba signalne tvari prijeđe graničnu razinu, zeleni fluorescentni protein praktički se prestaje sintetizirati. To znači da je regulatorna kaskada u potpunosti aktivirana. Samo u ovom slučaju uključuje se prirodni sjaj.

Drugim riječima, pokazalo se da je korištenje dviju signalnih tvari omogućilo bakterijama da stvore molekularni "prekidač" sposoban zauzeti ne dva, već tri stabilna stanja. Svako od ta tri stanja, očito, ima svoj set uključenih i isključenih gena, odnosno vlastito "ponašanje" mikroba.

Autori sugeriraju da zapravo ovaj prekidač možda čak ima ne tri, već četiri stabilna stanja - uostalom, postoji i treća signalna tvar, koja nije uzeta u obzir u eksperimentima.

Prema autorima, takav zamršeni sustav kemijske komunikacije omogućuje bakterijama da reguliraju svoje ponašanje ovisno o fazi razvoja mikrobne zajednice (biofilmovi; vidi dolje). Biofilm). Teoretski, koncentracije signalnih tvari - kao i ponašanje bakterija - mogu se prirodno mijenjati tijekom razvoja kolonija. Vibrio harveyi, a autori trenutno traže dokaze za ovu pretpostavku.

"osjećaj kvoruma" kod haringe i svjetlećih bakterija uzrokuje sinkronizaciju ponašanja, uzrokujući da se sve jedinke ponašaju na isti način. No, poznati su i slučajevi "bimodalnog" odgovora populacije na kolektivne signale. To znači da isti signal uzrokuje jednu od dvije alternativne reakcije kod različitih pojedinaca, a izbor jedne ili druge varijante ne može se odrediti čak ni genotipom pojedinca, već jednostavnom slučajnošću. Time se postiže raznolikost fenotipova (ponašanja) neovisno o raznolikosti genotipova. Obično je u bimodalnoj reakciji stabilnost svakog od dva alternativna stanja organizma osigurana pozitivnim povratnim vezama. Primjer takvog ponašanja razmatran je u bilješci Altruistične bakterije pomažu svojim rođacima kanibalima da pojedu sami sebe("Elementi", 27.02.2006.).

Postoji li "osjećaj kvoruma" kod ljudi? Očigledno, odgovor na ovo pitanje treba tražiti u znanstvenoj literaturi o takozvanoj "psihologiji gomile" (vidi, na primjer: A.P. Nazaretyan. Gomila i obrasci njezina ponašanja).

Sustav međustanične komunikacije kod mikroorganizama naziva se sustav kvorum senzor (QS ). Danas se QS sustav definira kao sustav koordinirane ekspresije gena u populaciji, ovisno o njezinom indeksu gustoće, pomoću malih signalnih molekula. Kao što je gore navedeno, ovaj je mehanizam prvi put opisao Nilson 1970. u morskoj bakteriji Vibrio fisheri kao sustav regulacije bioluminiscencije. U početku se pretpostavljalo da je ovaj regulatorni mehanizam karakterističan samo za mali broj blisko povezanih vrsta roda Vibrio Međutim, daljnja su istraživanja pokazala široku rasprostranjenost ovog regulatornog mehanizma u svijetu mikroorganizama. Utvrđeno je da uz pomoć QS sustava mikroorganizmi mogu regulirati mnoge životne procese, posebice patogenost, sekundarni metabolizam, stvaranje biofilma i još mnogo toga. Pokazalo se da se QS sustav nalazi ne samo kod bakterija, već i kod nekih nižih eukariota, kao što su gljive slične kvascima iz roda Candida i Cryptococcus. Štoviše, pokazalo se da uz pomoć ovog sustava mikroorganizmi mogu komunicirati ne samo sa svojom vrstom, već i za međuregionalnu komunikaciju, uključujući i s višim eukariotima.

Općenito, funkcioniranje QS sustava temelji se na nizu ključnih načela (slika 11):

1. Korištenje malih signalnih molekula - u QS sustavu prijenos signala od jedne do druge stanice provodi se pomoću signalnih molekula različite kemijske prirode.

2. Prisutnost specifičnih receptora – signalne molekule ne utječu izravno na ekspresiju ciljnih gena. Aktivacija ciljnih gena događa se tek nakon vezanja signalnih molekula na odgovarajuće receptore.

3. Utjecaj gustoće stanične populacije - QS sustav se pokreće tek nakon postizanja određene vrijednosti gustoće stanične populacije, koja korelira s koncentracijom signalnih molekula u okolišu.

4. Samoodržavanje funkcioniranja - kontrola sinteze novih signalnih molekula i receptora provodi se na isti način kao i kod ciljnih gena u odsutnosti aktivacije sustava potiskivanja.

5. Prisutnost mehanizama selektivne negativne regulacije - u stanicama mikroorganizama postoje i ovisni i neovisni o QS geni negativne regulacije, čiji proizvodi mogu selektivno isključiti čitave veze QS sustava ili cijeli sustav kao cijelo.

Riža. jedanaest. Opća shema funkcioniranje sustava za otkrivanje kvoruma.

Ova su načela zajednička gotovo svim vrstama QS sustava, bez obzira na njihovu specifičnost strukturna organizacija. Početak rada QS sustava obično se poklapa s vremenom ranoj fazi eksponencijalni rast, koji je karakteriziran brzim povećanjem gustoće stanične populacije. Ekspresija ciljnih gena, naprotiv, obično počinje izlaskom stanične populacije u stacionarnu fazu i obično je složena, odnosno podrazumijeva početak biosinteze gotovo svih QS-reguliranih produkata u kratkom razdoblju od vrijeme. Dakle, rane faze rada QS sustava sastoje se u osiguravanju biosinteze signalnih molekula i njihovih receptora, do određene točke, koja koincidira s akumulacijom maksimalne koncentracije signalnih molekula u međustaničnom prostoru, nakon čega QS sustav ide u samoodrživo stanje.

Mehanizmi na kojima se temelji rana aktivacija QS sustava još nisu u potpunosti razjašnjeni. Unatoč činjenici da je otkriven velik broj različitih regulatora kojima se pripisuje određena uloga u ranom aktiviranju sustava, mnoga pitanja ostaju neriješena. Prije svega, nije jasno kako je regulirano primarno nakupljanje signalnih molekula i njihovih receptora. Postoji hipoteza da je određeni broj signalnih molekula i njihovih receptora stalno prisutan u stanicama, a njihovo primarno nakupljanje odvija se prema istom samoodrživom mehanizmu, dok se dio unutarstaničnog fonda tih spojeva troši na sintezu signalnih molekula. molekule i receptore. Ostatak se izlučuje iz stanica i nakon dostizanja granične koncentracije ponovno se apsorbira i pokreće ekspresiju ciljnih gena. Međutim, na temelju značajki funkcioniranja nekih vrsta QS sustava, to se čini malo vjerojatnim. James P. Pearson, naprotiv, vjeruje da se početno lansiranje QS-a provodi uz pomoć nespecifičnih regulatora transkripcije kao što su MvaT i Vfr (V bezobzirnost f glumci r regulator) Pseudomonas aeruginosa, a sustav mnogo kasnije prelazi u stanje samoodrživosti.