REBES GYORSDIAGNÓZIS

Módszerek az antigének kimutatására. Veszettség esetén expressz diagnosztikára fluoreszcens antitestek (MFA), precipitációs reakciók (RP) agar gélben, enzim immunoassay (ELISA), polimeráz láncreakció (PCR) módszerei alkalmazhatók. Számos vizsgálatra van szükség az emberek veszettségének in vivo diagnosztizálásához.

A veszettség vírus antigénjei elleni antitestek meghatározása. Az antitestek kimutatása a vérszérumban vagy a cerebrospinális folyadékban fontos diagnosztikai módszer. A veszettség-specifikus antitestek szerológiai vizsgálatát vérszérumban végzik, hogy meghatározzák az expozíció előtti és utáni vakcinázást, valamint meghatározzák az emlékeztető immunizálás időpontját az immunválasz fokozása érdekében.

Vírusizoláció. A vírus izolálására és azonosítására fehér egereken végzett biológiai vizsgálati módszert alkalmaznak. A vizsgálati anyagot antibiotikumokat és magzati szarvasmarha-szérumot tartalmazó fiziológiás oldatban szuszpendáljuk. A szuszpenziót intracerebrálisan adjuk be 5-6 g-os fehér egereknek A fertőzés kialakulásának bizonyítására az egereket naponta megfigyeljük az oltást követő 30. napig. Azokat az egereket, amelyeknél ebben az időszakban alakul ki a betegség, azonnal elaltatják, és az agyszöveteket közvetlen MFA-val megvizsgálják.

Ennek a megközelítésnek az az előnye, hogy képes kimutatni kis mennyiségű veszettségvírust az anyagban. A módszer hátránya, hogy több napig (7-18 napig) kell várni az oltás és a betegség első jeleinek megjelenése között. Az inkubációs idő csökkentése érdekében szopós egereket használunk. A 3 napnál fiatalabb egerek expressz diagnosztikára használhatók: a 3 nap után levágott egerekben már az agyban kimutatható a vírus antigénje, ami MFA-val kimutatható.

A vírus izolálásának ezt a módszerét a negatív eredmények megerősítő diagnosztikai tesztjeként alkalmazzák az antigén és a Babes-Negri testek kimutatására, valamint veszettségre gyanús állat harapása esetén. Megfelelő szenzitivitást és specificitást biztosít, azaz a direkt immunfluoreszcens módszer diagnosztikai jelentőségének szintjén tekintendő. Ezenkívül ez a módszer a fő módszer a vírusváltozatok azonosítására, és ígéretes a diagnosztikai reagensek fejlesztése szempontjából.

Vírus izolálása és azonosítása sejtkultúrában. A vírusizoláció fő hátránya a laboratóriumi állatok fertőzése során a módszer időtartama. Ez sejtkultúrák használatával elkerülhető. Általában egér neuroblasztóma sejtkultúrát használnak erre a célra, ha szükséges az agyszövetek vizsgálata. Az agyat tenyésztő tápközegben szuszpendáljuk, a szuszpenziót egy sejttenyészet egyrétegű rétegére visszük fel, és egy-több napig inkubáljuk.

Egy adott tenyészet vírusérzékenysége növelhető DEAE-dextránnal történő kezeléssel. A sejt monoréteget ezután mossuk, hidegen acetonnal vagy formalin és metanol keverékével rögzítjük, és immunfluoreszcenciával vizsgáljuk. Ha az állat veszettség vírussal volt fertőzött, akkor a veszettség vírus antigén citoplazma zárványait mutatják ki a sejttenyészet egyrétegében.

Kimutatták, hogy a veszettség vírus antigénje kimutatható Na C1 300 egér neuroblasztóma sejteken MFA-val kombinálva 2 nap után. A módszer érzékenysége hasonló az egerekben végzett vírusizoláláséhoz.

Bár a veszettségvírus kötelező neuropatogenitású in vivo, képes a gazdasejtek széles skálájának megfertőzésére in vitro, ami felhasználható más szövetek és szervek veszettségvírus jelenlétének vizsgálatára. Megállapítást nyert, hogy a veszettségvírus BHK-21 és Vero sejtekben, csirkeembriók primer sejtjeiben vagy hörcsögvesében szaporodik. Kimutatták, hogy a vírus adszorpciója és bejutása a sejtbe 7 órán belül megtörténik. 24-48 óra elteltével a sejt belsejében új vírusrészecskék képződnek, 72 óra múlva a sejtmembránból a sejtközi térbe rügyeznek.

Kutatási módszerek

Mert a veszettség expressz diagnosztikája használható:

egy metódus HA EGY- a veszettség vírus antigénjének kimutatására szőrtüszőt tartalmazó beteg szaruhártyájának vagy tarkójának lenyomataiban;
b) módszer PCR- vírus RNS kimutatására szövetbiopsziás mintákban, nyálban, agy-gerincvelői vagy könnyfolyadékban;
c) módszer ELISA- specifikus antitestek (antigén) kimutatására tipikus vagy atipikus lefolyású betegeknél.
d) módszer biológiai vizsgálatok- a vírus izolálására a betegség korai szakaszában, vagy antitestek kimutatására a vérben vagy a cerebrospinális folyadékban a betegség későbbi szakaszában. Expressz diagnosztikához összetett módszer(bioassay + MFA), amely abból áll, hogy 2 napos újszülött egereket fertőznek meg a vizsgálati anyaggal, és megvizsgálják agyukat a 3–4. napon MFA-ban.

Az in vivo diagnosztikai módszerek megválasztása nagymértékben függ a betegség stádiumától: az antigének kimutatásán alapuló módszer általában nagyon érzékeny az inkubációs időszak végén, a betegség első néhány napja alatt, míg a vírussemlegesítő antitestek általában a betegség kezdetétől számított 7-10 nap elteltével jelennek meg az agy-gerincvelői folyadékban és a szérumvérben.

Immunfluoreszcens reakció. Az eljárás színezékhez, például fluoreszcein-izotiocianáthoz kötött antitestek alkalmazásán alapul. A RIF-et széles körben használják a vírusantigének kimutatására a betegek anyagában és a gyors diagnózis érdekében.

A módszer a legmagasabb fokú érzékenységgel rendelkezik, az expressz diagnosztika alapja, és lehetővé teszi a vírusantigének néhány órán belüli kimutatását.

Az MFA fő előnyei: a végrehajtás gyorsasága, nagy specifitás (100%). A betegség diagnosztizálására fordított idő kevesebb, mint egy nap. Az MFA közvetlen és közvetett változatait használják.

Közvetlen immunfluoreszcencia továbbra is a veszettség diagnosztizálásának előnyben részesített módszere. Az agyszövetek keneteit-lenyomatait tartalmazó tárgylemezeket vagy egyrétegű szövettenyészetet tartalmazó poharakat acetonban rögzítünk 1-4 órán keresztül. A készítményeket ezután szárítjuk, és fluoreszcens poliklonális anti-nukleokapszid antitestekkel (immunfluoreszcens reagenssel) kezeljük.

Ez a reagens a vírus nukleokapszid antigénje és a fluoreszcein-izocianát (FITC) elleni specifikus IgG osztályú poliklonális antitestekből előállított konjugátum. A specifikus antitesteket állatok (nyulak, hörcsögök vagy lovak) vírusnukleokapszid epitópok keverékével történő hiperimmunizálásával állítják elő.

Jelenleg a veszettségvírus nukleokapszidja elleni egér monoklonális antitesteket egyre gyakrabban használják erre a célra. 30 perces, 37°C-on végzett inkubálás után a diagnosztikai készítményeket ismételten mossuk sóoldattal és desztillált vízzel.

A FITC-vel jelölt antitestek csak a virális nukleoprotein antigének lokalizációjának helyén rögzülnek. A készítményeket ezután levegőn szárítják, és fénymikroszkóppal vizsgálják xenonlámpát és megfelelő szűrőt fényforrásként használva.

Nál nél indirekt változata az antigént először festetlen specifikus immunszérummal kombinálják. Ezután a képződött nem fluoreszcens antigén-antitest komplexeket fluorokrómmal jelölt immunszérum hatásának teszik ki, amely specifikus szérumfehérjék elleni antitesteket tartalmaz. Az MFA indirekt változata az antigén kimutatásával együtt lehetővé teszi a tesztszérumban lévő antitestek mennyiségi meghatározását annak megfelelő hígításával.

A FITC-vel jelölt képződmények a különböző szövetek sejtjeiben sárgászöld fluoreszcens festődésként detektálhatók sötét háttéren (kerek vagy ovális alakú intracitoplazmatikus zárványok formájában).

Kapcsolt immunszorbens vizsgálat. A módszer a fehérje szorpció elvén alapul a szilárd fázison, majd a szubsztrát-indikátor oldattal kimutatható antigén-antitest komplexek képződésén alapul. A lyukakba adott antigén specifikusan kötődik az antitestekhez. A vizsgálandó szérumokat a szükséges hígításokban alkalmazzuk az antigénrétegre. A bennük lévő specifikus antitestek jelenlétében az utóbbiak kötődnek az antigénhez. A kötődés kimutatására torma-peroxidázzal konjugált humán szérumglobulinok elleni immunglobulint visznek fel az antitestrétegre. A szorbeáló konjugátum mennyisége arányos az antigénhez kötött humán szérum mennyiségével. Ezt indikátoroldattal (ortofenilén-diamin + hidrogén-peroxid) lehet meghatározni, melynek komponensei a konjugált peroxidáz hatására a folyadékot barnássárgára színezik. A tisztázatlan esetek vizsgálatakor az ELISA alkalmazása az RP vagy az RSK módszerei mellett lehetővé teszi a veszettség laboratóriumi diagnózisának megbízhatóságának növelését a módszer nagy érzékenysége miatt. A módszer lehetővé teszi a fertőző és hibás részecskék kimutatását.

A veszettség elleni antitestek oltás közbeni meghatározására indirekt ELISA módszer használható, antigénként tisztított vírust használva, valamint humán szérumban az IgG osztályú antitestek, a torma-peroxidázzal asszociált Staphylococcus A-protein meghatározása. Az ELISA eredményei összehasonlíthatók az egereken végzett vírussemlegesítési tesztek eredményeivel. A módszer lehetővé teszi az IgM jelenlétének kimutatását az immunizálási folyamat elején.

Az immunenzim módszerek nagyon ígéretesek a vírus nukleokapszid antigénjének kimutatására az agyszövetekben végzett poszt mortem diagnózis során. Ezek közé tartozik például a veszettség diagnosztizálására szolgáló gyors ELISA módszer, amely IgG izotípusú antitestekkel szenzitizált, karbonát pufferben hígított, első szerotípusú nukleokapszid elleni tálcák előkészítésén alapul.

A vizsgálati anyagot pufferben vagy tápközegben homogenizáljuk, centrifugálással derítjük, lyukakba adjuk, és lemezeken inkubáljuk. A specifikus antitestekkel fixált nukleokapszid antigén azonosítása egy peroxidáz konjugátum hozzáadásával történik különböző fajspecifikus antinukleokapszid veszettség elleni antitestekkel és egy kromogén szubsztráttal. A módszer érzékenysége 0,8-1,0 ng/ml.

Ezzel a módszerrel különböző szerotípusú vírusok antigénjeit lehet kimutatni. A biotinnal jelölt nukleokapszid-specifikus antitestek konjugátumainak alkalmazása 0,1-0,2 ng/ml-re növeli a módszer érzékenységét.

A nukleokapszid antigén ELISA-val sikeresen kimutatható, de az anyagot még lebontva sem szabad formalinnal rögzíteni.

polimeráz láncreakciós módszer. A veszettség vírusának gyors diagnosztizálására és a lyssavírusok azonosítására a legkényelmesebb módszer a polimeráz láncreakció (PCR). A PCR módszer a legmegbízhatóbb és leggyorsabb módszer a virion RNS izolálására minden olyan mintából, amely alacsony koncentrációban tartalmazza a vírust. Ezzel az RNS-vírusból számos másolatot készíthet. Ezt a módszert az MFA eredmények megerősítésére, valamint a nyálban, a nyak és a fej szőrtüszőiben lévő vírus kimutatására használják.

A PCR a természetes DNS-replikáció elvén alapul. A módszer lényege az ismételt ismétlés egy vírusspecifikus DNS-szekvencia szintézisének (amplifikációjának) ciklusa hőstabil Taq DNS-polimeráz és két specifikus primer, az úgynevezett primerek felhasználásával.

Minden ciklus három szakaszból áll, különböző hőmérsékleti feltételekkel. Minden ciklusban megduplázódik a szintetizált régió másolatainak száma. Az újonnan szintetizált DNS-fragmensek templátként szolgálnak az új szálak szintéziséhez a következő amplifikációs ciklusban, amely lehetővé teszi a kiválasztott DNS-régió megfelelő számú másolatának felhalmozását 25-35 ciklus alatt annak meghatározásához, általában agaróz géllel. elektroforézis.

A PCR különösen nagy érzékenysége az N-génnel komplementer primerek használatakor, amikor lehetséges a vírus RNS kimutatása a vírust 10 MLD50 titerben tartalmazó mintákban. A PCR módszerrel a vírus RNS kimutatható még lebomlott kóros anyagban is.

Jelenleg a megerősítő (megerősítő) teszteket, például a reverz transzkriptáz PCR-t (RT-PCR) fejlesztették ki, és széles körben alkalmazzák a gyakorlatban. Az RT-PCR módszer rendkívül érzékeny és leghatékonyabb. Az RNS-t a vírussal fertőzött szerv szöveteiből extrahálják, cDNS-vé írják át, majd PCR-rel amplifikálják. Az RT-PCR-hez a veszettségvírus genomjának konzervatív régióihoz nyert primerekre van szükség. Jellemzően nukleoproteint vagy N-proteint kódoló géneket használnak.

A PCR módszer nagyon specifikus és nagyon érzékeny. Az egyik legtöbb pontos tesztek A veszettség antigén kimutatása lehetővé teszi a veszettség diagnosztizálását akkor is, ha legalább egy virion van az anyagban. A teszt az RNS-templát komplementer kiegészítésén alapul, amelyet in vitro az RNS-polimeráz enzim segítségével hajtanak végre. Az elmúlt években a PCR-t egyre gyakrabban alkalmazzák a vírusfertőzések diagnosztizálására és monitorozására. A technika azonban bonyolult, költséges és még nem kellően egységes a rutinhasználathoz.

A citológiai módszerek jelenleg korlátozottak diagnosztikai érték, de továbbra is számos fertőzés esetén kell használni. A boncolási anyagokat, biopsziákat, keneteket megvizsgálják, melyeket megfelelő feldolgozás után megfestenek és mikroszkóp alatt elemeznek. Veszettségben a sejtek citoplazmájában lévő zárványok kimutatása (Babes-Negri testek).

Vírusizoláció. A vírusizoláció szükséges lehet az antigéntesztek eredményeinek megerősítéséhez és az izolátumok további jellemzéséhez. És bár ez a módszer az egyik legrégebbi és legidőigényesebb diagnosztikai módszer, ma már a vírusizolálás az utólagos azonosítással az egyik modern módszerrel (ELISA monoklonális antitestekkel vagy PCR) a legmegbízhatóbb diagnosztikai módszer, az ún. "aranystandard".

A veszettség diagnosztikai módszereinek hatékonysága számos tényezőtől függően változhat (a betegség stádiuma, az anyagmintavétel időpontja, a beszerzett minták minősége, tárolási feltételek, a személyzet tapasztalata, a reagensek minősége stb.). Ha a pozitív eredmény megerősíti a veszettséget, akkor a negatív eredmény nem mindig jelzi a betegség hiányát. Ezért veszettség esetén a WHO szakértői több teszt alkalmazását javasolják, különösen az MFA-t újszülött (2-3 napos) fehér egereken végzett biológiai teszttel kombinálva.

Személyes megelőzési intézkedések

A veszettség vírusát tartalmazó anyagokkal, valamint a veszettségre gyanús állatokkal végzett minden munkát a személyes biztonsági intézkedések betartásával kell végezni. Egészségügyi dolgozókés az állatorvosoknak köpenyben, kesztyűben, maszkban kell dolgozniuk.

A munka végén a dobozokat 3% -os hidrogén-peroxid oldattal kezelik.

A fiolákat, ampullákat és szerszámokat, valamint a veszettség vírust tartalmazó megmaradt anyagokat, valamint az összes edényt munka után 1 órás autoklávozással fertőtlenítik 1,5 atm-en (kill mód).

Alapok személyi védelem forralással vagy autoklávozással fertőtlenítjük. Az asztal és a kezek munkafelületét fertőtlenítő oldattal (0,5%-os klóramin oldat) fertőtlenítjük.

A veszettség (R) a melegvérű állatok akut betegsége, amelyet a központi idegrendszer károsodása jellemez. Mindenféle házi- és vadon élő állat, valamint az ember fogékony.

A betegséget a világ különböző részein regisztrálják. Ausztráliában, Nagy-Britanniában és Japánban nem fordult elő a betegség terjedése. A betegség szinte mindig halállal végződik. Valójában vannak dokumentált esetek a veszettségből való felépülésről embereknél és kutyáknál kísérleti fertőzés után.

A veszettségvírus (rabies virus) a Rhabdoviridae családba, a Lyssavirus nemzetségbe tartozik. Mostanra megállapították, hogy a VB-nek 4 szerotípusa van, ami nyilvánvalóan a membránfehérjék összetételének különbségéből adódik. A VB minden változata immunbiológiailag rokon, de virulenciában különböznek. A WB GA és GAD tulajdonságokkal rendelkezik. Lineáris kapcsolat van a fertőző és a GA aktivitás között. A veszettség ellen immunizált állatok VNA, KSA, antiHA és litikus (komplement jelenlétében elpusztítják a vírussal fertőzött sejteket) antitesteket termelnek.

A diagnózis felállítása epidemiológiai adatok, a betegség tünetei, kóros elváltozások (ezek kisebb jelentőségűek) és főként az eredmények alapján történik. laboratóriumi kutatás.

Laboratóriumi diagnosztika állatok agyának tanulmányozásából áll a vírus AG kimutatása érdekében IF-ben, RDP-ben, Babes-Negri testek kimutatásában és fehér egereken végzett biológiai vizsgálatban.

NÁL NÉL Orosz Föderáció jelenleg a VNITIBP-nél és a KazNIVI-nél szervezték meg a B diagnosztizálására szolgáló készletek gyártását IF-ben és RDP-ben.

A vírus izolálása. A kis állatok friss tetemeit kutatás céljából a laboratóriumba küldik, nagy állatokból - a fejből vagy az agyból. Egyes esetekben az agy 50%-os glicerinben való befőzése megengedett. A holttestet vagy a fejet gondosan műanyag zacskóba kell csomagolni, az agyat - egy csiszolt üveg- vagy gumidugóval ellátott, paraffinnal megtöltött tégelybe. Az anyag nedvességálló tartályba van csomagolva. Csak a nem tartósított agy alkalmas virológiai vizsgálatokra. Emlékeztetni kell arra, hogy a boncolást, az agy kivonását és a kóros anyaggal végzett egyéb műveleteket sterilitás mellett és a személyes megelőzési intézkedések szigorú betartása mellett kell elvégezni: szilárdan rögzítse az állat fejét, védje a kezét 2 pár kesztyűvel ( sebészeti és anatómiai), tegyen fel szemüveget, hogy megvédje a szemet, az orrra és a szájra pedig egy 6 rétegű gézkötést.

Anyaglaboratóriumi kutatás a veszettséget soron kívül végzik; az eredményeket azonnal jelenteni kell a járási (városi) tanyaorvosnak és főorvosnak.

Vírusjelzés és azonosítás. A kutatás sorrendje: az agy bal és jobb oldali részeiről (Ammon-szarv, kisagy, agykéreg és oblongata) 4 db kenetlenyomatot készítünk IF és Babesh-Negri testek kimutatására; agyszövettel tegye RDP-t; negatív eredménnyel biológiai tesztet helyezünk el.

Konkrét zárványtestek észlelése. A lenyomat keneteket a Sellers, Muromtsev vagy más módszerek szerint festik. A festés után a preparátumokat fénymikroszkóp alatt, merülőrendszerrel nézzük meg. A specifikus Babesh-Negri testek jelenléte pozitív eredménynek tekinthető (az eladók szerint festve - világosan meghatározott ovális vagy hosszúkás szemcsés képződmények rózsaszín-piros színű a protoplazmában, ha Muromcev szerint festik - világos lila, sötétkék Babesh zárványokkal -Negri testek, gyakrabban az idegsejteken kívül helyezkednek el.

A Babesh - Negri testének legjellemzőbb tulajdonsága a belső felépítésük, amely lehetővé teszi számukra, hogy teljesen pontosan megkülönböztessék őket. Belül kis szemcsék láthatók - sötétkék, egyenletes fekete színű, 0,2-0,5 mikron méretű bazofil szemcsék.

A fehérvérsejtek fertőzésének bizonyítékaként szolgáló zárványtestek kimutatásának diagnosztikus értéke általánosan elismert. Egészséges állatokban, különösen macskákban és fehér egerekben azonban vannak olyan képződmények, amelyek jelenléte diagnosztikai nehézségeket okozhat. Egyes esetekben a macska agyában az ilyen zárványokat magabiztosan meg lehet különböztetni a Babes-Negri testektől, és itt ajánlott azonosítási módszerek alkalmazása, különösen az IF. Hasonlóképpen azoknál a kutyáknál, amelyek kígyóméreggel vagy sérüléssel okozott mérgezés következtében pusztultak el Áramütés, a Babes-Negri testekhez hasonló zárványtesteket találhatunk. Babesh-Negri testeket csak a veszettség eseteinek 65-85%-ában mutatnak ki, így ezek hiánya nem negatív válasz, és az anyagot más tesztekkel (IF, RDP, bioassay) is megvizsgálják.

HA. A B diagnosztikájának egyik fő tesztje. Magasan minősített teljesítménnyel 99-100%-os egyezést érünk el a bioassay módszerrel. A diagnosztikai gyakorlatban általában az IF közvetlen módszerét alkalmazzák, amelyet veszettség elleni fluoreszcens Ig alkalmazásával hajtanak végre. A preparátumok hűtött (8-10°C) acetonban történő rögzítését legalább 4 órán keresztül végezzük, negatív kontrollként egészséges fehér egerek agyáról lenyomatokat használunk. Az eredményeket vizuálisan, egy fluoreszcens mikroszkópban veszik figyelembe az AG-AT komplex fényének intenzitásának értékelése alapján. Az AH VB fényes sárga-zöld vagy zöld szemcsékként érzékelhető különféle formákés értékek a sejtekben (gyakrabban a cellákon kívül). A diagnózis akkor tekinthető megalapozottnak, ha több látómezőben elegendő számú (legalább 10) tipikus, élénkzöld fényű granulátum vagy sok apró pötty található, a kontrollban ilyen izzásnak nem szabad lennie.

Az AG-AT komplex fluoreszcenciájának specifitásának bizonyítására az IF-szuppressziós módszert alkalmazzák, amely abból áll, hogy a nem fluoreszcens AT-ekhez kapcsolódó veszettség AG nem képes rekombinálni fluoreszcens specifikus AT-kkel. Ehhez 5%-os veszettség elleni nem fluoreszcens Ig-t viszünk fel a vizsgált agyból előállított fix preparátumokra, 30 percig inkubáljuk 37°C-on nedves kamrában, mossuk sóoldattal, majd fluoreszcens veszettség elleni festéssel festjük. Ig hagyományos direkt módszerrel. Az így kezelt készítményekben nem lehet fluoreszcencia.

Az IF módszer lehetővé teszi a WB kimutatását a szem szaruhártya sejtjeiben és előzetes diagnózis felállítását in vivo: az állatok betegsége során, valamint 1-2 nappal a klinikai megnyilvánulása előtt. A módszerrel B-betegségre gyanús állatok, valamint embereket és állatokat megharapott, klinikailag egészséges kutyák és macskák is vizsgálhatók. Ehhez lenyomatokat készítenek a szaruhártyából, a személyes biztonság minden szabályát betartva, az állat szemrepedését nagy és mutatóujjaités kissé kidudorodó szemgolyó nyomja meg az üveglemez felületét, 0,5 cm-rel hátralépve a végétől. Gondoskodni kell arról, hogy az állat ne pislogjon a harmadik szemhéjjal, mivel a hámsejteket eltávolítják az üvegből, és rossz minőségű kenetet kapnak. Minden szemből legalább 2 2 lenyomatot tartalmazó készítmény készül. Ellenőrzés céljából egészséges állatok szaruhártya-lenyomatait hasonló módon készítjük el. A farmon főzhetők. A lenyomatokat levegőn szárítjuk, acetonban 4 órán át 4°C-on rögzítjük, becsomagoljuk és a laboratóriumba küldjük. Foltkészítmények, mint az IF-ben, az általánosan elfogadott módszer szerint.

Beteg vagy a betegség lappangási periódusának végén lévő állatokból származó készítményekben számos hámsejt citoplazmájában, különböző formák Különböző méretű, erősen világító szemcsék - a porszerű pontoktól a 2 mikronos vagy nagyobb méretig. Megszerzése céljából megbízható eredményeket minden készítményben 50-100 sejtet, összesen pedig legalább 200-400 sejtet vizsgálunk az állatból. A mikroszkópos vizsgálat eredménye akkor tekinthető pozitívnak, ha az állat szaruhártyájának lenyomataiban 11% vagy több, jellegzetes lumineszcenciagócokkal rendelkező sejt található. Nem szabad megfeledkezni arról, hogy az egészséges állatokból származó készítményekben (kontroll) az autofluoreszcencia miatt előfordulhatnak olyan sejtek, amelyekben hasonló alakú és lumineszcenciás gócok találhatók.

Fontos megjegyezni, hogy az IF lehetővé teszi a végső diagnózisra adott válasz gyorsítását bioassay segítségével, mivel a B diagnózisát csak az egerek vizsgálati anyaggal való fertőzését követő 4-8. napon lehet felállítani, ill. lappangási időszak Az egerek betegségei elérhetik a 20 napot. Az IF képes kimutatni a fehérvérsejtet a submandibularis nyálmirigy szöveteiben. A szubmandibuláris nyálmirigyekből kenetet készítenek, a mirigy legalább 6 különböző részéből vesznek anyagot, mivel a vírus eloszlása ​​nem egyenletes. A lenyomat készítéséhez gyakran erős nyomást kell kifejteni, mert a rengeteg mucin miatt kevés anyag marad az üvegen.

Bemutattuk a bőrben a VB IF módszerrel történő azonosításának lehetőségét, ehhez mintát veszünk a fejbőrből, valamint a pofa szenzoros és tapintható szőrtüszőiből vagy laterális szenzoros papillákból (a kutya arcán). A mintákat -20 vagy -70 °C-on tároljuk. Kriometszeteket készítenek belőlük, amelyeket fluoreszcens globulinnal kezelnek. A VB bőrben történő azonosításából kapott IF-analízis eredményei nagymértékben korrelálnak ugyanazon állat agyának vizsgálatából származó adatokkal. Szoros korrelációt mutattak ki az AH vírus agymintákban és ajakszövetekben történő kimutatása között az IF módszerrel.

RDP. Az AH VB kimutatására használják utcai veszettségben elpusztult állatok vagy biológiai vizsgálatban használt egerek nem konzervált agyában. Az RDP-t mikromódszerrel üveglemezekre helyezzük 1-1,5%-os agargéllel az általánosan elfogadott módszer szerint. A pozitív eredmények legnagyobb százaléka a következő stencil használatakor észlelhető: A - ammon kürt ( Jobb oldal); B - agykéreg (jobb oldal); C - kisagy (jobb oldal);
D - medulla oblongata (jobb oldal); + (plusz) - pozitív kontroll; - (mínusz) - negatív kontroll; 1, 2, 3, 4 - lyukak specifikus immunglobulin 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 arányú hígításával

Az agy minden részéből csipesz segítségével homogén pasztaszerű masszát készítenek, amelyet a megfelelő lyukakba helyeznek. Az egereknél az egész agyat megvizsgálják. A bal oldali agyi régiókból hasonló módon készítjük el az AG-t (minden vizsgálathoz összesen 4 db agargéllel ellátott üveglemez szükséges). A reakciót 6, 24, 48 óra elteltével vesszük figyelembe, ha 1 vagy 2-3 kicsapó vonal van az AG-t és immunglobulint tartalmazó lyukak között, a reakciót pozitívnak tekintjük.

Az RDP végrehajtása egyszerű és specifikus, de a vírus AG kimutatásának százalékos aránya a vizsgálati anyagban 45-70. A pozitív biológiai teszttel kapott egerek agyának vizsgálata során az RDP az esetek 100%-át felfedi. A Babesh-Negri testek hiánya, a specifikus fluoreszcencia és a negatív RDP nem ad okot a vírus jelenlétének kizárására. Ebben az esetben a végső diagnózis fehér egereken végzett biológiai vizsgálat eredményein alapul, amelyet a vírus azonosítása követ.

Bioassay.Általánosan elfogadott, hogy a biológiai vizsgálat több hatékony módszer mint a Babesh testek kimutatása - Negri, IF, stb. Azonban néhány esetben negatívnak bizonyult, annak ellenére, hogy a B diagnózisát zárványtestek és IF kimutatásával igazolták. A negatív biológiai vizsgálati eredmények százalékos aránya 1,3 és 12 között változott.

A bioassay eltérő hatékonyságára vonatkozó információk számos tényezővel magyarázhatók: a kísérleti állat kiválasztása, azok száma a kísérletben, a fertőzés módja, az anyag tárolásának módja és időtartama a laboratóriumba kerülés előtt. A fertőző részecskék inaktív részecskékkel való interferenciájának jelensége is szerepet játszhat, ha nem megfelelően hígított anyagot használnak az oltáshoz.

az agyban és nyálmirigyek A veszettségben elpusztult rókáknál és hunyóknál olyan anyagot találtak, amely gátolja a vírus fertőzőképességét, ami nem teszi lehetővé a betegség diagnosztizálását ezeknél az állatoknál egerek intracerebrális fertőzésével. Egy gátló anyag jelenléte a vizsgálati anyagban nem akadályozza meg a vírusos AG kimutatását az IF-módszerrel; cukik és rókák esetében ez a legérzékenyebb diagnosztikai módszer.

A biológiai vizsgálathoz használt összes faj (nyulak, tengerimalacok, felnőtt fehér egerek és hörcsögök) közül sokan a szopós egereket részesítik előnyben, mert érzékenyebbek a VB különböző törzseire, és kevésbé veszélyes velük dolgozni. A szír hörcsögök érzékenységükben nem alacsonyabbak az egereknél, de kevésbé hozzáférhetők.

RSK. A specifikus AH kimutatását RSK-ban a veszettség diagnosztikájában ritkábban alkalmazzák, mint más módszereket. Az AG-t a kutatásra küldött agyból készítik elő. Ehhez az agyszövetet (különösen AG-ban gazdag, komplementkötő, thalamus és agytörzsi darabok) veronal pufferben 1:10 arányban eldörzsöljük, és szobahőmérsékleten 1 órán át hagyjuk, majd a szuszpenziót. 56°C-on 5 órán át inaktiválva.Az ilyen kezelés elpusztítja a vírust és eltávolítja az agyszövet antikomplementaritását anélkül, hogy a specifikus antigént károsítaná. A szuszpenziót 15 percig centrifugálják 3500 perc-1 sebességgel a felülúszóból, amely az AG jelenlétének vizsgálatára szolgáló anyag, 1:2-ről 1:64-re kétszeresére növekvő hígításokat készítenek és felhasználják a CSC-ben végzett kutatásokhoz. .

ELISA. Az ELISA-ban a veszettségben elpusztult állatok agysejtjeiben AG specifikus festődést mutatnak ki mind a frissen vett, glicerinben tárolt, mind a glicerin nélkül 20 °C-on 8-18 órán át tárolt mintákban. a veszettség rutin diagnózisa állatokon, az AG WB kimutatása szöveti paraffin metszetekben a preparátumok 10%-os, 5,3 pH-jú formalinoldattal történő rögzítése során, majd a paraffinba ágyazott készítmények pepszinnel történő kezelése során.

Az egerekben és a sejttenyészetekben alkalmazott ROP-tól eltérően az ELISA néhány órán belül képes kimutatni az AT-t állatokban, az ELISA a legígéretesebb laboratóriumi módszer az AT kimutatására és magának a vírusnak a kimutatására. A veszettség diagnosztizálásának kifejezett módszere a befogási technika és az IF módszer az AH BB kimutatására. Bebizonyosodott, hogy az AH VB kimutatására szolgáló módszer paraffinizált metszetekben a peroxidáz-antiperoxidáz módszerrel lényegesen jobb, mint az ELISA módszer. 1987-ben létrehoztak egy Rapid Enzyme Immunodiagnosis of Rabies (RREI) készletet, amely alkalmas epidemiológiai és laboratóriumi vizsgálatokra.

Változat azonosítás a mAT segítségével. A WB-glikoproteinekhez adott mAb-ek segítségével AG-változatokat szelektáltunk, amelyek közül fenotípusosan termolabilis (virulens) variánsokat azonosítottunk. A mAb 2 csoportjának alkalmazásakor kimutatták, hogy a hígítási törzsek különböznek a db-tól. Fixe (Pasteur), CVS, Flury HEP, ERA és "kacsa" törzsek az AH-determinánsokhoz. A B-betegekből izolált, mAb-t használó 7 törzs vizsgálata lehetővé tette bizonyos különbségek azonosítását köztük és a vakcinatörzs között az AH-determinánsokkal kapcsolatban.

Általánosan elfogadott, hogy a vad törzsek közötti AT különbségek kimutathatók az AT N nukleokapszid elleni mAb-jaival, amelyek reagálnak a vírussal fertőzött sejtek citoplazmatikus zárványaival; az anti-glikoprotein (G AG), amely reakcióba lép a fertőzött sejtek membránjával, komplement jelenlétében lizálja ezeket a sejteket, és semlegesíti a vírust. A különböző földrajzi területekről származó felszíni glikoprotein WB lehetséges AH variabilitása kapcsán az AG szerkezetének konzervativizmusával jellemezhető ribonukleoproteint alkalmaztunk védő AG-ként. Így nemcsak a G-fehérje, hanem az RNP VB is rendelkezik protektív aktivitással.

Serodiagnosis és retrospektív diagnózis. Ezek a módszerek nem jellemzőek a veszettségre, mivel csak az oltás utáni immunitás vizsgálatára használják őket. Az oltás utáni antitestek kimutatására és titrálására pH-t használnak, amelyet az általánosan elfogadott módszerrel állítanak be. Rögzített WB-t használunk AG-ként. A BHK-21 sejtek RN-je érzékenyebb volt, mint az indirekt IF az AT kimutatásában a vakcinázott rókák szérumában. Ezenkívül javasolták az RTGA-t és az ELISA-t.

RTGA. A diagnosztikai gyakorlatban még nem talált széles körű alkalmazást a vérszérumban található nem specifikus inhibitorok miatt, amelyekre a WB nagyon érzékeny, és ami a legfontosabb, hogy a GA AG, amelyet nem vetettek alá kellő tisztításnak, alacsony érzékenységű volt. A HA AG WB elkészítéséhez javasolt db. VNK-21 sejttenyészetben szaponinnal történő kezelés után, majd tisztítás és koncentrálás Moszkva szaporított. A HA-t ultracentrifugálással választják el a virion többi komponensétől. A kapott készítmény tisztasági foka 99,92%, magas GA-aktivitást mutatott (1:128), jól megőrződött 1 hónapig 5-9 pH-értéken.

Az RTGA beállítása előtt a lúd vörösvértesteinek mérsékelt, kétszeres tripszinezését kell végezni a szenzibilizáció érdekében. Tripszinezett eritrociták 0,25%-os szuszpenziójának alkalmazásakor (lehetőleg 107 sejt/1 ml) az RTGA érzékenysége 4-szeresére nő. Az AG és a szérum hígításához borát-só oldatot (pH 9) használunk 0,4% szarvasmarha szérumalbumin hozzáadásával. Vörösvértest-szuszpenziót készítünk savas pH-jú sóoldatban, hogy a vírus és szérum 9-es pH-jú keverékével való keverés után a végső pH-t 6,2-en belülre állítsuk be. Miután az eritrocita-szuszpenziót a lyukakba adtuk, a panelt összerázzuk, átlátszó fóliával lezárjuk és jégre helyezzük. Az RTHA eredményeit 40-50 perc elteltével, 2 napos csirkék vagy rhesusmajmok eritrocitáival pedig 1-1,5 óra elteltével veszik figyelembe.

Kifejlesztettek egy radioimmunoassay-t, amely az AT jelzett 125 1-AG WB-hez való kötődési képességén alapul. A veszettség elleni hiperimmun szérumból izolált jelölt IgG felhasználható a WB AG kimutatására szilárd fázisú RIA-val. A legjobb eredményeket 0,01 M ionerősségű foszfát-só oldat (pH 6,0) és 200-250 ezer impulzus/perc aktivitású jelölt IgG alkalmazásával értük el.

A szilárd fázisú kompetitív RIA alkalmazható veszettség ellenanyagok kimutatására szérum- és hibridóma felülúszókban.

Megkülönböztető diagnózis. Ki kell zárni az Aujeszky-féle betegséget, amelyben a beteg állatok nem agresszívak, nincs étvágytalanság. Kutyáknál a pestis ideges formája kizárt. A veszettség gyanúja a lovak fertőző encephalomyelitisében. A laboratóriumi vizsgálatok komplexuma lehetővé teszi a veszettség pontos diagnózisát. Javasolt új módszer A VB különböző törzseinek differenciálódása az N génszegmens PCR-ben az amplifikációs termékek restrikciós hasításán alapul.

ÁLLAMKÖZÖTI SZABVÁNYOSÍTÁSI TANÁCS. METROLÓGIA ÉS TANÚSÍTÁS

ÁLLAMKÖZÖTI SZABVÁNYOSÍTÁSI TANÁCS. METROLÓGIA ÉS TANÚSÍTÁS

ÁLLAMKÖZI

ALAPÉRTELMEZETT

ÁLLATOK

Hivatalos kiadás

Alapforma

Előszó

Az államközi szabványosítási munkák céljait, alapelveit és alapvető eljárásait a GOST 1.0 - 92 „Államközi szabványosítási rendszer” határozza meg. A rendelkezések alapjai” és a GOST 1.2-2009 „Államközi szabványosítási rendszer. Államközi szabványok. az államközi szabványosítás szabályai és ajánlásai. Fejlesztési szabályok. elfogadás, jelentkezés, megújítás és lemondás"

A szabványról

1 A szövetségi állam FEJLESZTÉSE költségvetési intézmény"Össz-orosz Állami Központ minőség és szabványosítás gyógyszerekállatoknak és takarmánynak" (FGBU "VGNKI")

2 BEVEZETETT az Orosz Föderáció Szövetségi Műszaki Szabályozási és Metrológiai Ügynöksége

3 ELFOGADTA az Államközi Szabványügyi, Mérésügyi és Tanúsítási Tanács (2013. június 27-i jegyzőkönyv, 57-P.)

Az ország rövid neve az MK (ISO 3166) 004-97 szerint	Országkód: MK (ISO 3166) 004-97	A nemzeti szabványügyi testület rövidített neve
		Az Örmény Köztársaság Gazdasági Minisztériuma
Fehéroroszország		A Fehérorosz Köztársaság állami szabványa
Kirgizisztán		Kirgizstandart
		Moldova-szabvány
		Gosstandart
Üzbegisztán		Uzsgandart

4 A Szövetségi Műszaki Szabályozási és Mérésügyi Ügynökség 2013. szeptember 30-i, 1127-st számú rendeletével a GOST 26075-2013 államközi szabványt az Orosz Föderáció nemzeti szabványaként 2015. január 1-jétől hatályba léptették.

5 GOST 26075-54 HELYETT

A szabvány változásaira vonatkozó információkat a „Nemzeti Szabványok” évente közzétett információs indexében, a változtatások és módosítások szövegét pedig a „Nemzeti szabványok” havi információs indexben teszik közzé. A szabvány felülvizsgálata (lecserélése) vagy törlése esetén a megfelelő értesítést a „Nemzeti Szabványok” havonta megjelenő információs indexben teszik közzé. A vonatkozó információkat, értesítéseket és szövegeket is elhelyezik tájékoztatási rendszeráltalános felhasználás - a Szövetségi Műszaki Szabályozási és Metrológiai Ügynökség hivatalos honlapján az interneten

© Standartinform, 2014

Az Orosz Föderációban ezt a szabványt nem lehet teljesen vagy részben reprodukálni. sokszorosítani és hivatalos kiadványként terjeszteni a Szövetségi Műszaki Szabályozási és Metrológiai Ügynökség engedélye nélkül

ÁLLAMKÖZI SZABVÁNY

ÁLLATOK

A veszettség laboratóriumi diagnosztikájának módszerei

A veszettség laboratóriumi diagnosztikájának módszerei

Bevezetés dátuma - 2015 - 01 - 01

1 felhasználási terület

Ez a szabvány minden emlősfajra vonatkozik, és a veszettség laboratóriumi diagnosztizálására a következő módszereket állapítja meg:

Fluoreszcens antitestek (MFA) módszere;

Módszer a veszettségvírus izolálására egér neuroblasztóma CCL-131 sejttenyészetében (vagy a patkány neurinoma Gasser csomópontja - NGUK-1);

Bioassay fehér egereken:

Az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat (ELISA) módszere;

Diffúziós precipitációs reakció (RDP).

Megjegyzések

1 Ezek a módszerek a Lyssavwus nemzetség összes tagjára alkalmazhatók.

2 Az utcai veszettség vírusa a 2. patogenitási osztályba tartozó mikroorganizmusok közé tartozik (halálos veszélyt jelent emberre és állatra).

3 Szükség esetén veszettség vírus genotipizálása készen tesztrendszerek a reverz transzkriptáz polimeráz láncreakció (RT-PCR) módszert alkalmazzák.

2 Normatív hivatkozások

Ez a szabvány a következő szabványokra vonatkozó normatív hivatkozásokat használ:

GOST ISO/IEC 17025 - 2009 Általános követelmények vizsgáló és kalibráló laboratóriumok kompetenciájába

GOST 12.0.004 - 90 Munkavédelmi szabványok rendszere. Munkavédelmi oktatás szervezése. Általános rendelkezések

GOST 12.1.005-68 Munkavédelmi szabványok rendszere. A munkaterület levegőjére vonatkozó általános egészségügyi és higiéniai követelmények

GOST 12.1.008 - 76 Munkavédelmi szabványok rendszere. biológiai biztonság. Általános követelmények

GOST 12.4.011 - 89 Munkavédelmi szabványok rendszere. Védelmi eszközök a munkavállalók számára. Általános követelmények és besorolás

GOST 17.0.0.01 - 76 Szabványrendszer a természetvédelem és a természeti erőforrások felhasználásának javítása területén. Alapvető rendelkezések

GOST 177-88 Hidrogén-peroxid. Műszaki adatok GOST 2603 - 79 Reagensek. Aceton. Műszaki adatok GOST 2768 - 84 Műszaki aceton. Műszaki adatok GOST 4204 - 77 Reagensek. Kénsav. Műszaki adatok GOST 6709 - 72 Desztillált víz. Műszaki adatok.

GOST ISO 7218 - 2011 Mikrobiológia élelmiszer termékekés állati takarmány. Mikrobiológiai vizsgálatok általános követelményei és ajánlásai

GOST 8074 - 82 Műszeres mikroszkópok. Típusok, alapvető paraméterek és méretek. Technikai követelmények.

GOST 9147 - 80 Laboratóriumi porcelán üvegáru és felszerelés. Műszaki adatok GOST 9284-75 Mikroszkóp tárgylemezek. Műszaki adatok GOST 12026 - 76 Laboratóriumi szűrőpapír. Műszaki adatok GOST 13739-78 Merítési olaj mikroszkópiához. Technikai követelmények. Vizsgálati módszerek

GOST 16317-87 Háztartási elektromos hűtőkészülékek. Általános Specifikációk

GOST 21241-69 Orvosi csipesz. Általános Specifikációk.

GOST 22967 - 90 Orvosi injekciós fecskendők újrafelhasználható. Általános műszaki követelmények és vizsgálati módszerek

GOST 24661-91 (ISO 7866 84) Egyszer használatos injekciós fecskendők

GOST 25046 - 81 (ISO 7864-81) Egyszer használatos injekciós tűk. Fő méretek. Technikai követelmények. Vizsgálati módszerek

GOST 25336 - 82 Laboratóriumi üvegáru és felszerelés. Típusok, alapvető paraméterek és méretek

GOST 29230 - 91 (ISO 835-4-81) Laboratóriumi üvegáru. Pipettes végzett. 4. rész. Pipetták fújása

Megjegyzés - Ennek a szabványnak a használatakor tanácsos ellenőrizni a referenciaszabványok érvényességét a nyilvános információs rendszerben - a Szövetségi Műszaki Szabályozási és Mérésügyi Ügynökség hivatalos honlapján az interneten vagy a "Nemzeti szabványok" éves információs indexe szerint. , amely a tárgyév január 1-jétől jelent meg, valamint a „Nemzeti Szabványok” havi információs index tárgyévre vonatkozó számai. Ha a referenciaszabványt lecserélik (módosítják), akkor ennek a szabványnak a használatakor a helyettesítő (módosított) szabványt kell követnie. Ha a hivatkozott szabványt csere nélkül törlik, akkor a hivatkozást nem érintõ mértékben az a rendelkezés alkalmazandó, amelyben a hivatkozás szerepel.

3 Kifejezések, meghatározások és rövidítések

3.1 A következő kifejezéseket használja ez a szabvány a megfelelő definícióikkal együtt:

3.1.1. Emberek és állatok veszettség fertőző betegsége, amelyet a Lyssavirus (rhabdovírus) nemzetség Rhabdoviridae családjának tagjai okoznak. halálos kimenetelű az esetek 100%-ában.

3.1.2 Veszettség vírus: Kórokozó fertőző betegség ember és állat.

3.1.3. A veszettség vírus antigén felületi fehérje szerkezetei a veszettség vírusában, amelyek ellen antitestek termelődnek.

3.1.2 Fluoreszcens antitest módszer (MFA): A veszettség vírus antigénjének kimutatására szolgáló módszer fluoreszcein eotiocianáttal jelölt veszettség elleni antitestekkel, jellegzetes világító zárványkomplexek kialakításával, amelyeket fluoreszcens mikroszkóp látóterében detektálnak. .

3.1.3. módszer veszettségvírus izolálására egér neuroblasztóma CCL-131 sejttenyészetében (vagy patkány Gasser ganglion neurinómájában - NGUK-1): Módszer veszettségvírus antigén izolálására. a vírus sejttenyészetben történő szaporodásán és fluoreszcens antitestek módszerével történő azonosításán alapul.

3.1.3. Bioassay: Eljárás a veszettség vírus fehér egerekben történő izolálására patológiás anyag szuszpenziójának befecskendezésével, majd a vírus azonosításával fluoreszcens antitestek módszerével.

3.1.4. enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati (ELISA) módszer veszettségvírus-antigén kimutatására szilárd hordozóra rögzített veszettség elleni antitesttel való specifikus kölcsönhatása alapján, majd a megkötött antigén kimutatása egy második enzimmel jelölt antitest felhasználásával, a reakciótermék kromogénnel való megfestésével.

3.1.5 diffúziós precipitációs teszt (RDP): A veszettség vírus kimutatására szolgáló módszer, amely azon alapul, hogy az antitestek és a veszettség vírus antigénje diffundál egy agar gélen, és specifikus kölcsönhatás hatására meztelenül látható antigén-antitest komplexet képez. szem csapadékvonal formájában.

3.1.6. reverz transzkriptáz polimeráz láncreakció (RT-PCR) módszer a veszettség vírus genomjának kimutatására a vírus specifikus RNS-szekvenciájának DNS-vé történő transzlációjával, majd a kapott DNS ismételt másolásával és a reakciótermékek kimutatásával, in vitro .

3.2 Ez a szabvány a következő rövidítéseket használja:

FAG - fluoreszcens veszettség elleni immunglobulin;

ANG - veszettség elleni globulin;

CFG - kontroll fluoreszcens globulin;

PBS - foszfát pufferoldat;

NGUK-1-neurinoma patkány Gasser-csomója;

FITC – fluoreszcein-izotiocinát:

RNS - ribonukleinsav:

DNS - dezoxiribonukleinsav:

CCN31 - egér neuroblasztóma sejtkultúra:

OFD - ortofenil-diamin;

TMB – tetrametilbenzidin.

4 Kutatási feltételek és biztonsági követelmények

4.1 Kutatási feltételek

4.1.1 A mikrobiológiai elemzésre és az I-II patogenitási csoportba tartozó mikroorganizmusokkal végzett munka általános követelményei - a GOST ISO 7218 szerint.

4.1.2 A helyiségekre vonatkozó általános követelmények - a GOST ISO 7218 szerint.

4.1.3 A személyzetre vonatkozó követelmények - a GOST ISO 7218, GOST ISO / IEC 17025 szerint. (1).

Kutatást végezhetnek az I-II patogenitási csoportba tartozó mikroorganizmusokkal való munkavégzésben jártas szakképzett alkalmazottak, akik tanulmányozták a mikrobiológiai munka módszereit. veszettség ellen beoltva.

4.2 Biztonsági követelmények

4.2.1 A munkavégzés általános biztonsági követelményei a GOST 12.1.008 szerint.

4.2.2 A munkavállalók védőfelszereléseinek meg kell felelniük a GOST 12.4.011 követelményeinek.

4.2.3 A munkaterület levegőjének meg kell felelnie a GOST 12.1.005 követelményeinek.

4.2.4 Munkavédelmi személyzet képzése a GOST 12.0.004 szerint.

4.2.5 A vizsgálathoz beszerzett anyag, valamint az elhasznált egyéni védőeszközök, szerszámok, stb. 30 perces forralással vagy 15 perces autoklávozással (0,11 ± 0,20) MPa nyomáson végezzük.

5 Mérőműszerek, berendezések, anyagok, reagensek és állatok

5.1 Kutatási célra:

Pásztázó spektrofotométer 190 és 1100 nm közötti hullámhossz-tartományban, legfeljebb ± 0,5 nm hibával és 0,1 és 3,0 közötti optikai sűrűség (OD) mérési tartománnyal;

Lemezek immunológiai reakciókhoz 96-lyukú:

Termosztát, amely a hőmérsékletet 20 "-C és 50 ° C között tartja:

Hűtőszekrény háztartás, amely biztosítja a hőmérséklet fenntartását 0 ° C és 10 ° C között a GOST 16317 szerint:

laboratóriumi centrifuga;

vízfürdő;

Fordított lumineszcens mikroszkóp a GOST 8074 szerint:

Porcelánmozsár mozsártörővel a GOST 9147 szerint vagy homogenizátor a GOST ISO/IEC 17025 szerint;

Csúszdák a GOST 9284 szerint:

Üveg kémcsövek a GOST 25336 szerint;

Petri-csészék a GOST 25336 szerint;

Küvetta a GOST 25336 szerint;

1,0 kapacitású pipetták; 2,0 és 10,0 cm 3 a GOST 29230 szerint;

Automata pipetták 0,05-0,20 cm 3 kapacitással hegyekkel:

Orvosi csipesz a GOST 21241 szerint:

1,0 cm 3 űrtartalmú inzulinfecskendők a GOST 22967 vagy GOST 24861 szerint;

Injekciós tűk a GOST 25046 szerint:

Kultúra poharak nyolc lyukhoz;

Ketrecek egerek tartására;

Aceton a GOST 2603 vagy GOST 2768 szerint;

Fluoreszcens veszettség elleni immunglobulin (FAG);

veszettség elleni globulin (AnG);

Kontroll fluoreszcens globulin (CFG);

Nem fluoreszcens immerziós olaj a GOST 13739 szerint;

desztillált víz a GOST 6709 szerint;

0,01 mol/dm 3 moláris koncentrációjú foszfát pufferoldat (PBS). pH 7,2-7,4;

- steril, 0,9%-os izotóniás nátrium-klorid oldat:

CC31 egér neuroblasztóma vagy patkány nonerynoma Gasser csomójának sejttenyészete -

Penicillin;

Sztreptomicin;

Medium Needle MEM kettős aminosav- és vitaminkészlettel (DMEM), pH 7,2;

Tripszin oldat 0,25%;

Szarvasmarha embrionális vér széruma sejttenyészetekhez 10%;

glutamin 3%;

3% hidrogén-peroxid a GOST 177 szerint;

Készítménykészlet az állati veszettség ELISA módszerrel történő laboratóriumi diagnosztizálására;

2 mol / dm 3 moláris koncentrációjú kénsav oldat a GOST 4204 szerint;

Szűrőpapír a GOST 12026 szerint;

Bélyegző kutak készítéséhez;

merthiolát;

"Difko" agar vagy hasonló;

1%-os metilnarancs 50%-os etanolos oldata:

Pozitív és negatív antigének;

Veszettség elleni szérum vagy immunglobulin;

Klinikailag egészséges, 6-8 g súlyú fehér egerek.

5.2 Más metrológiai jellemzőkkel rendelkező mérőeszközök és nem rosszabb műszaki jellemzőkkel rendelkező berendezések, valamint a fent jelzettnél nem alacsonyabb minőségű reagensek és anyagok használata megengedett. Az eldobható edények megengedettek.

6 Mintavétel

6.1 A veszettség vírus jelenlétének vizsgálatához kóros anyagot küldenek a laboratóriumba - kis állatok friss tetemét vagy fejét, nagy állatok fejét vagy agyát.

6.2 A kutatásra kiválasztott kóros anyagot nedvességálló tárolóedénybe csomagoljuk és fém tartályokban szállítjuk a laboratóriumba. A fagyasztott anyagot kriotartályba helyezzük.

6.3 A kóros anyaghoz mellékelni kell a következő adatokat tartalmazó dokumentumot; a feladó neve és címe, az állat típusa, anamnesztikus és klinikai és elieootológiai adatok.

6.4 A laboratóriumi vizsgálatokat a kóros anyag átvétele után azonnal elvégzik.

6.5 A kutatáshoz az agy egyes részeiről (Ammon szarv, kisagy, agykéreg, medulla oblongata) 0,5 - 1,0 cm méretű szövetdarabokat vesznek ki a nagy állatokból.A kis állatok, például az egerek agyát megvizsgálják pl. egy egész.

Csak friss vagy frissen fagyasztott agyszövetminták alkalmasak az MFA vizsgálatára és a veszettségvírus izolálási módszerére egér neuroblasztóma CCL-131 (vagy NGUK-1) sejttenyészetben. A bomló (bomlás stádiumában lévő), glicerinnel tartósított, metil-alkohollal, formalinnal vagy más, a nem specifikus fluoreszcencia kialakulását elősegítő módszerrel rögzített állati agyminták nem használhatók kutatásra.

A bioassay felállításához megengedett a 30% -50% * glicerin oldatban tartósított agyminták használata. Más tartósítószerek használata nem megengedett. Tartósítás céljából a kóros anyag mínusz 10 C-ot meg nem haladó hőmérsékleten lefagyasztható.

7 Fluoreszcens antitest módszer (MFA)

7.1 A módszer lényege

A fluoreszcens antitestek módszerének lényege a fluoreszcens veszettség elleni antitestek specifikus kölcsönhatása a veszettségvírus homológ antigénjével. A kapott antigén-antitest komplex FITC-vel jelölt. fluoreszcens mikroszkóp alatt szemlélve a látómező jellegzetes fénye vizuálisan érzékeli.

7.2 A vizsgálat előkészítése

7.2.1 Minta előkészítés

7.2.1.1. Az agy minden részéből legalább három készítményt (lenyomatot vagy kenetet) készítenek a 6.5. pont szerint kiválasztott szövetdarabokból gondosan zsírtalanított üveglemezeken. Ha a kóros anyag állapota megengedi, akkor lenyomatokat készítenek, más esetekben keneteket készítenek.

7.2.1.2 Nyomatok előkészítése

A 6.5. szerint kiválasztott szövetdarabok. négy-hat rétegben hajtogatott szűrőpapírra tesszük. A kis állatok agyát átvágják, minden részlegét rögzítik, és vágott oldalával felfelé négy-hat rétegben hajtogatott szűrőpapírra helyezik. A vágási felületet üveglappal érintjük, enyhén megnyomjuk, amíg vékony lenyomatot nem kapunk az üvegen.

7.2.1.3 Kenetek készítése

Egy darab szövet az agy minden részéből (kis állatoknál a teljes agy), amelyet a 6.5. pont szerint kell kiválasztani. porcelánmozsárban mozsártörővel addig dörzsöljük, amíg homogén massza nem keletkezik, amelyből üveglemezekre keneteket készítünk.

7.2.1.4 Kontrollként tamponokat vagy lenyomatokat vesznek egészséges, veszettségtől mentes és nem vakcinázott fehér egerek agyából a 7.3.1.2. és 7.3.1.3. pontban leírtak szerint.

7.2.1.5 Az előkészítés után a keneteket vagy lenyomatokat levegőn szárítjuk 20-30 percig. hűtött acetonban 4°C-on 4-12 órán keresztül vagy mínusz 20°C hőmérsékleten 1 órán keresztül rögzítjük, majd eltávolítjuk az acetonból és levegőn 10-15 mJ-ig szárítjuk.

7.2.2 Reagensek előkészítése

BUZI. Az Ang-t és a KFG-t desztillált vízzel az ampulla címkéjén feltüntetett kezdeti térfogatig feloldjuk. Az oldott FA-k eltarthatósága. AnH és CFG (5 ± 2) C hőmérsékleten - legfeljebb két hét.

Közvetlenül a vizsgálathoz a szükséges mennyiségű oldott FAG. Az AnG-t és a KFG-t FBI-val hígítjuk az ampulla címkéjén feltüntetett munkahígításra. Oldott FAG-ok munkahígításai. Az Ang és a CFG az előkészítés napján használatos.

7.3 A vizsgálat lefolytatása

A 7.2.1. pont szerinti készítményeket (keneteket vagy nyomatokat) tartalmazó tárgylemezeket nedves kamrába (Petri-csészébe vagy nedves aljú küvettába) helyezzük. Ezután a három elkészített készítmény egyikét egy pipettával vonjuk be FAG-val munkahígításban, egyenletesen a kenet vagy lenyomat teljes felületén. A KFG munkahígítását alkalmazzuk a második készítményre. Zárja be a kamrát gyógyszerekkel. termosztátba helyezzük (37 ± 1) * C hőmérsékleten és 30 percig tartjuk

min. A kontrollkészítményeket párhuzamosan festjük. A festés végén a készítményeket háromszor mossuk, minden alkalommal 10 percre PBS-es edénybe merítve. öblítse le desztillált vízzel és szárítsa levegőn 20-30 percig.

Az Ang munkahígítását alkalmazzuk a harmadik készítményre. termosztátba helyezzük (37 ± 1) * C hőmérsékleten, és 30 percig inkubáljuk. Ezután a készítményt háromszor mossuk, minden alkalommal 10 percre PBS-t tartalmazó edénybe merítve. desztillált vízzel leöblítettük, 20-30 percig levegőn szárítottuk és FAG munkahígítással megfestettük. a fent leírtak szerint.

7.4 Az eredmények kezelése

A festett készítményekben a veszettségvírus által nem érintett agyszövet halványan világít. szürkéssárga.

A veszettségvírus antigénje az idegsejtekben és a külső sejtekben különböző formájú és méretű élénkzöld szemcsék formájában mutatható ki – az alig észrevehetőtől a 15-20 mikron átmérőjűig. Néha nagyszámú, kerek és ovális alakú kis fényes zöld részecske (legfeljebb 1 mikron nagyságú).

A veszettség diagnózisa akkor tekinthető megalapozottnak, ha a vizsgált készítményben a mikroszkóp több látóterében jellegzetes sárgás-zöld szemcsék találhatók. Ugyanakkor a kontroll készítményekben (FAG-val festett, veszettségben nem szenvedő egészséges fehér egerek agyából származó kenetekben vagy lenyomatokban), valamint a vizsgált, CFG-vel festett és AnG-vel előkezelt és FAG-val festett készítményekben. ilyen formációk nem létezhetnek.

A vizsgálat eredményeit a szabványt elfogadó állam területén hatályos eljárásnak megfelelően jelentik az illetékes hatóságoknak.

8 negatív eredmény esetén 8-án vagy 9-én végeznek vizsgálatokat.

8 Módszer veszettségvírus izolálására egér neuroblasztóma CCL-131 sejttenyészetében

8.1 A módszer lényege

A módszer lényege a veszettség vírusának egérsejttenyészetben történő izolálása.

neuroblasztóma CCL-131 vagy NGUK-1, majd azonosítása fluoreszcens antitestek módszerével.

A módszer a 9. pont szerinti fehér egereken végzett biológiai vizsgálat alternatívája.

8.2 A vizsgálat előkészítése

8.2.1 Minta előkészítés

Egy kis állat agyának minden részéből sterilen vett egyenlő szövetrészek (Ammon-szarv, kisagy, agykéreg, medulla oblongata), vagy szövetdarabok egy nagy állat agyának minden részéből, a 6.5. pont szerint. ollóval összetörjük és mozsárban vagy homogenizátorban őröljük, fokozatosan hozzáadva steril 0,9%-os izotóniás nátrium-klorid-oldatot, amíg 10%-os szuszpenziót nem kapunk. Az agyszuszpenzióhoz penicillint és sztreptomicint adunk US egység/cm 3, illetve 1 mg/cm 3 mennyiségben.

A kapott szuszpenziót alaposan összekeverjük és 5-10 percig 2000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A fenti üledékes folyadékot steril kémcsőbe helyezzük, és felhasználásig 4 °C-ot meg nem haladó hőmérsékleten tároljuk.

8.2.2 Kultúralemezek elkészítése

A CCL-131 (vagy NGUK-1) egér neuroblasztóma sejtek napi tenyészetét 0,25%-os tripszinoldattal eltávolítjuk a tenyészlombikból, és DMEM táptalajjal hígítjuk 10% borjúmagzatszérumot és 3% glutamint 2*10 másodperces sejtkoncentrációig. /cm 3 . A kapott sejtszuszpenzióból 0,1 cm 3 -t adunk a tenyészüveg üregeibe, lefedjük fedéllel, és 5% CO-tartalmú nedves CO g-inkubátorba helyezzük (37 ± 1) °C hőmérsékleten 18 °C-on. 20 óra

8.3 A vizsgálat lefolytatása

Az agy minden részéből 0,05 cm 3 szuszpenziót adunk a tenyésztőüveg két üregébe a 8.2.2. pont szerint. Mindegyik tárgylemezen két mérőhelyet hagyunk pozitív és negatív kontrollhoz. Pozitív kontrollként veszettségvírus-CVS törzzsel fertőzött egér agyának szuszpenzióját használjuk. Negatív kontrollként egy klinikailag egészséges egér agyának szuszpenzióját vezetjük be. A tenyészüveget 5% CO2 tartalmú nedves CO2 inkubátorba helyezzük (37 ± 1) *C hőmérsékleten 42-48 órára.

Az inkubálás végén a táptalajt automata pipettával eltávolítjuk a tenyészüveg üregeiből, a sejteket egyszer mossuk PBS-sel (automata pipettával minden lyukba 0,2 cm 3 oldatot adunk) és szárítógépben szárítjuk. lamináris légáramlás 20-30 percig. Ezután minden lyukba 0,1 cm 3 mínusz 20 °C hőmérsékletre hűtött acetont adunk, és 30 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk.

A sejtrögzítés után a tenyészüveget megfordítjuk, és az aceton eltávolítására rázatjuk, majd lamináris légáramban 20-30 percig szárítjuk. Szike és csipesz segítségével távolítsa el a műanyag fúvókát, és szárítsa meg az üveget további 5-10 percig. 0,05-0,10 cm 3 FAG-t adunk minden lyukhoz egy (empirikusan kiválasztott) munkahígításban, amelyet az FBI-ban készítettek. nedves Petri-csészébe helyezzük és (37 ± 1) C-on 30 percig inkubáljuk.

A festés végén a tárgylemezeket háromszor mossuk, minden alkalommal 10 percre PBS-es edénybe merítve. Ezután a készítményeket desztillált vízzel leöblítjük és 20-30 percig levegőn szárítjuk.

Nem fluoreszcens immerziós olajat visznek fel a festett készítményekre, és fluoreszcens mikroszkóp alatt nézik meg.

8.4 Az eredmények kezelése

A festett készítményekben a veszettségvírus által nem érintett sejttenyészet halványan világít. szürkéssárga szín (negatív kontroll). A veszettségvírus antigénjét a sejttenyészet citoplazmájában, világos zöld szemcsék formájában mutatják ki, különböző formájú és méretű, világosan meghatározott élekkel (pozitív kontroll).

A veszettség diagnózisa akkor tekinthető megalapozottnak, ha a vizsgálati készítményben a mikroszkóp több látómezőjében jellegzetes sárga-zöld szemcsék találhatók.

Ha a veszettség vírusát nem mutatják ki a sejttenyészetben, akkor negatív diagnózist állítanak fel.

A veszettségvírus sejttenyészetben történő izolálásának eredményei véglegesek, további vizsgálatokat nem végeznek.

9 Bistlerob fehér egereken

9.1 A módszer lényege

A módszer lényege a veszettség vírus izolálása kóros anyag intracerebrális injekciójával fehér egerekbe, majd a vírus azonosítása a 7. pont szerinti fluoreszcens antitestek módszerével.

9.2 A minták előkészítése vizsgálatra - a 6.2.1.

9.3 A vizsgálat lefolytatása

Öt-hat fehér egeret fertőzünk 10%-os im-tracerebrális patológiás anyag szuszpenziójával, 0,02-0,03 cm3 térfogatban. A fertőzött egereket külön ketrecbe helyezzük, amelyre a fertőzés időpontját, az egerek számát, a fertőzés módját és a kóros anyag vizsgálati számát feltüntető címkét rögzítünk. Az állatokat legalább 30 napig megfigyeljük. Az egészséges, beteg és elhullott egerek számát a naplóban rögzítjük.

9.4 Eredmények kezelése

Az eredmények értékelésekor figyelembe vesszük a fertőzött egerek klinikai tüneteit (fodros szőrzet, táplálékfelvétel, mozgáskoordináció károsodása, bénulás, remegés, levertség). Az egerek elhullását a fertőzés utáni első két napban nem vesszük figyelembe. A beteg és elhullott állatok agymintáit a harmadik naptól kezdődően az MFA 7-ig megvizsgálja.

A bioassay akkor tekinthető pozitívnak, ha a fertőzést követő harmadik naptól kezdve legalább egy egér megbetegedett és elpusztult, és az agymintában MFA-val kimutatták a veszettségvírus specifikus zárványait.

Negatív diagnózis csak 30 napos megfigyelés után adható, feltéve, hogy minden fertőzött állat életben és egészséges marad.

A bioassay eredményeit véglegesnek tekintik, további kutatásokat nem végeznek.

10 Enzim immunoassay módszer (ELISA)

10.1 A módszer lényege

8 Az ELISA a veszettségvírus antigénjének az antihéliummal való specifikus kölcsönhatásán alapul. szilárd hordozóra rögzítve. A megkötött antigént egy második, peroxidázzal jelölt veszettség antitesttel mutatjuk ki. amelynek reakcióterméke kromogén hozzáadásával elszíneződik. A reakciótermék festődésének intenzitása egyenesen arányos az antigén mennyiségével.

10.2 A vizsgálat előkészítése

10.2.1. Vizsgálati anyagként (antigénként) elhullott, erőszakkal leölt, veszettségre gyanús vagy kísérletileg veszettségvírussal fertőzött állatok agyszövetmintáit használjuk.

10.2.2 A tesztantigén előkészítése

A 6.5. pont szerint kapott agyszövetmintákat összetörjük, mozsárban megőröljük és 10%-os * szuszpenziót készítünk C,9%-os izotóniás nátrium-klorid-oldatban, vízfürdőben 60 °C-on 15 percig melegítjük, majd centrifugáljuk. 5-10 perc 2000 ford./percnél. A felülúszót használjuk tesztantigénként.

10.2.3 Reagensek előkészítése

az összes oldatot és reagenst a reakció felállítása előtt legalább 30 percig (22 ± 1) * C hőmérsékleten kell tartani.

A készlet összetevőinek előkészítése a használati utasítás szerint történik.

10.3 A vizsgálat lefolytatása

10.3.1 Az ELISA-t szendvics változatban hajtják végre a készletben található komponensek felhasználásával a veszettség kórokozó antigénjének kimutatására kóros anyagban.

Az ELISA-hoz az immunológiai reakciókhoz lapos fenekű lemezeket használnak.

A tabletta üregeibe lépésenként bevitt összetevők térfogata megegyezik egymással, és az

10.3.2 A lemez érzékenyítése

Egy polisztirol lemez 6 mérőhelyét ANG-vel töltjük fel a címkén feltüntetett munkahígítással. Az ANG-t tartalmazó lemezt fedővel lefedjük és termosztátban (37 ± 0,5) *C hőmérsékleten 3 órán át, vagy 4 *C hőmérsékleten 18 órán át inkubáljuk.. Inkubálás után a lemez lyukait kimossuk. háromszor mosópufferoldattal. Minden mosásnál rázza ki a lyukak tartalmát. és a maradék oldatot szűrőpapírra ütögetve eltávolítjuk.

10.3.3 Antigének alkalmazása

8 sor A lemez. 8 és C adjunk hozzá mosópuffert. A készletben található kontroll pozitív (A1 üreg) és negatív (A2 üreg) antigéneket, valamint a vizsgálati mintákat (AZ. A4 üregek stb.) bevisszük a tabletta üregeibe, és függőlegesen titráljuk, így 1-től hígítást kapunk. : 2-től 1-ig: 8. Mikor nagy számban a mintákat a tabletta többi sorába töltjük. A lemezt fedővel lefedjük, és hermostátban (37 ± 0,5) *C hőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk.Az inkubálás végén a lemez üregeit háromszor lemossuk az immunglobulinhoz nem kötött antigénektől, a 10.3.2. pontban leírtak szerint.

10.3.4 Veszettség leroxidáz konjugátum alkalmazása

A veszettség elleni peroxidáz konjugátum munkahígítását a lemez üregeibe adjuk, majd fedővel lefedjük és termosztátban (37 ± 0,5) C hőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk, majd a lemez üregeit háromszor mossuk ki a 10.3.2. pontban leírtak szerint.

10.3.5 Az aljzatkeverék felhordása

A reakció megnyilvánulásához az elkészített szubsztrátumkeveréket a tabletta üregeibe adjuk. A reakciót 15-30 percig mutatjuk be (22 ± 0,5) °C hőmérsékleten, sötétben. A reakciót 2 mol/DM 3 moláris koncentrációjú kénsav oldat hozzáadásával állítjuk le.

10.4 Eredmények kezelése

A reakció elszámolása vizuálisan vagy pásztázó spektrofotométeren történik a készlet használati utasításának megfelelően.

Ha az OPD-t kromogénként használjuk a szubsztrátumkeverékben. majd az optikai sűrűségmérést 490 nm-en végezzük. ha TMB-t használ. majd 450 km-nél.

A reakciót csak akkor vesszük figyelembe, ha a negatív antigénkontrollal rendelkező üregekben nincs specifikus festődés, míg a kontrollos üregekben intenzív festődés. pozitív antigén. Vizuális számláláskor a mintát akkor tekintjük pozitívnak, ha legalább egy (első) hígítás specifikus festést mutat.

Az ELISA eredményének spektrofotometriás figyelembevételével a K sp specificitási együttható kiszámítása történik. amely megegyezik a reakciótermék optikai sűrűségének (OD) a kontroll pozitív antigént vagy tesztanyagot tartalmazó üregekben (OD) a kontroll negatív antigént (OD) tartalmazó üregekben lévő szubsztrátumkeverék optikai sűrűségéhez viszonyítva. . A reakció pozitívnak tekinthető. ha a specificitási együttható nagyobb, mint 2,1 és negatív, ha kisebb, mint 2,1.

OP1 * 0,641, OPg a 0,120, Ksp \u003d 5,34 - a reakció pozitív vagy OP1 \u003d 0,180, OPg 0,120 K-en „ * 1,5-tel - a reakció negatív.

Pozitív reakció esetén a diagnózist megállapítottnak tekintik. A negatív eredményt más módszerekkel kell megerősíteni a 7-9.

11 Diffúziós precipitációs reakció (RDP)

11.1 A módszer lényege

Az RDP-módszer lényege, hogy az antitestek és a vírusantigén egy agargélen diffundálnak, és specifikus kölcsönhatás hatására antigén-antitest komplexet képeznek, amely szabad szemmel is látható csapadékvonal formájában.

11.2 Vizsgafelkészítés

11.2.1 Minta előkészítés

Minták előkészítése kutatáshoz - a 8.2.1.

Bakteriális mikroflórával szennyezett, állott állati agymintákat engedélyeznek kutatásra.

11.2.2 Az agar előkészítése

Az agar elkészítéséhez keverjen össze 1,5 g Difko agart. metilnarancs 1 cm 3 1%-os oldata 50%-os etanolban. 0,01 g mertiolát. 100 cm 3 -es izotóniás nátrium-klorid oldat. A kapott elegyet addig forraljuk, amíg az agar teljesen el nem olvad, kémcsövekbe öntjük, 0,5 atm nyomáson 30 percig autoklávozzuk, és hűtőszekrényben 4 °C-on tároljuk.

11.2.3 Diák elkészítése (Petri-csészék)

A reakcióelegyet tárgylemezekre vagy Petri-csészékre helyezzük. Egy csepp olvadt agart csepegtetünk egy zsírtalanított pohárra, egyenletesen elosztjuk az üvegen, és szobahőmérsékleten hagyjuk 20-30 percig, hogy az agar megszilárduljon. Ezután 2,5 cm 3 olvadt agart viszünk fel az üvegre, körülbelül 2 mm vastag réteget képezve. és hagyjuk állni 20-30 percig. Fagyasztott agarrétegben speciális bélyegzővel vagy 4-5 mm átmérőjű vékony falú fémcsővel lyukakat készítenek. Az agaroszlopokat szemcsipesszel vagy más eszközzel óvatosan eltávolítjuk anélkül, hogy megsértenék vagy hagynánk, hogy vékony réteg agargél leváljon az üvegről.

A Petri-csészéket hasonlóan készítjük el, 10-15 cm 3 olvasztott agart adva hozzájuk, hogy 2-3 mm vastag réteget kapjunk.

11.3 A vizsgálat lefolytatása

Közvetlenül a reakció felállítása előtt veszettség elleni szérum (immunglobulin) hígításokat készítenek, amelyekhez négy kémcsőbe 1,0 cm 3 izotóniás nátrium-klorid oldatot adunk. Adjon 1,0 cm 3 veszettség elleni szérumot az első kémcsőbe úgy, hogy 1:2 hígítást kapjon.

keverjük össze, és töltsünk át 1,0 cm 3 keveréket egy második kémcsőbe stb. Így négy kémcsövet kapunk 1:2,1:4,1:8 és 1:16 hígításokkal.

8 előkészített üreg 0,05 - 0,07 cm 3 agymintát tartalmaz (minden minta külön lyukba), amelyet a 8.2.1. szerint nyertünk. és a veszettség elleni szérum vagy immunglobulin hígításai (1:2; 1:4; 1:8:1:16) az 1. ábra szerint.

1. ábra - Anyagfelhasználási séma

Ar - Emmon kürtje; Pm - medulla oblongata; A+ - pozitív kontroll antigén; M - kisagy; K - agykéreg; A- - negatív kontroll antigén.

lehetséges más sémák alkalmazása az anyag bejuttatására, de a pozitív és negatív antigének használata kötelező.

A vizsgálandó anyagot tartalmazó tárgylemezeket nedves aljú Petri-csészékbe vagy nedves exszikkátorba helyezzük, majd termosztátba (37 ± 1) * C hőmérsékleten 48 órán át (a Petri-csészéket fedéllel letakarjuk és termosztát).

A reakciót 6,24 és 48 óra elteltével vesszük figyelembe.

11.4 Eredmények kezelése

A reakció akkor tekinthető pozitívnak, ha a tesztanyagot és a veszettség elleni szérumot (immunglobulint) tartalmazó üregek között akár egyetlen, bármilyen intenzitású precipitációs vonal jelenik meg.

Ebben az esetben észrevehető kicsapódási vonalat kell megfigyelni a pozitív antigén és a veszettség elleni szérum (immunglobulin) között, és nem szabad kicsapódási vonalnak lennie a negatív antigén és a veszettség elleni szérum (immunglobulin) között.

8 pozitív reakció esetén a diagnózis megállapítottnak minősül. A negatív eredményt más módszerekkel kell megerősíteni a 7-10.

bibliográfia

EU-útmutató az emberi és állatgyógyászati ​​felhasználásra szánt gyógyszerek helyes gyártási gyakorlatához

UDC 619:616.98:579.852.1:615371 MKS 11.220

Kulcsszavak: veszettség, diagnosztika, fluoreszcens antitest módszer, kapcsolt immunszorbens vizsgálat, bioassay, diffúziós precipitációs reakció

Közzétételre aláírva 2014.01.04. Formátum 60x84V

Uel. PVC. l. 1.40. Forgalom 31 ekv. Zach. 1363.

A szabvány kidolgozója által biztosított elektronikus változat alapján készült

FUE "STANDARTINFORM"

123995 Moszkva. Gránát sáv, 4.

MÓDSZERTANI UTASÍTÁSOK
VESETSÉG LABORATÓRIUMI DIAGNÓZISJA

1. A veszettség diagnosztizálása járványtani, klinikai, patoanatómiai adatok összessége és főként laboratóriumi vizsgálatok alapján történik.

2. Kutatás céljából futárral küldik a laboratóriumba: egy kutya (macska, róka, sarki róka, birka, borjú stb.) friss holttestét vagy fejét, nagytestű állatokból - fej vagy agy (friss vagy konzerv). 30-50%-os glicerines oldatban). Csak a nem tartósított agy alkalmas szerológiai vizsgálatokra.

3. A veszettség laboratóriumi diagnosztikája az agy mikroszkópos vizsgálatából (Babes-Negri testek kimutatása érdekében), szerológiai vizsgálatból (specifikus veszettség antigén kimutatása), valamint fehér egereken vagy nyulakon végzett biológiai vizsgálatból áll. .

Kutatási sorrend.

4. A vizsgálathoz kapott agyból először táptalajra vetik őket. Az agy egy részét azonnal a hűtőszekrénybe helyezzük és tároljuk, ha újbóli vizsgálatra van szükség. Az agy többi részéből anyagot vesznek ki mikroszkópos vizsgálathoz, szerológiai reakciókhoz és biológiai mintákhoz.

jegyzet. A boncolás, az agy eltávolítása és az egyéb munkavégzés steril körülmények között, a személyes megelőzési intézkedések szigorú betartásával (az állat fejének erős rögzítése, a kezek két pár kesztyűvel: sebészeti és anatómiai kesztyűvel való védelme, védőszemüveg viselése) történik. védje a szemet, az orrot és a szájat gézkötéssel fedjük le).

I. MIKROSZKÓPOS VIZSGÁLATOK

5. A mikroszkópos vizsgálathoz lenyomatokat és keneteket készítenek az agy különböző részeiről.

6. Lenyomat készítéséhez az agy darabjait (Ammon-szarv, agykéreg, kisagy, medulla oblongata) 4-6 rétegben hajtogatott szűrőpapírra helyezzük. A vágott felületet egymás után többször (3-4) érintjük meg tiszta üveglappal, enyhén megnyomva, hogy vékony lenyomatot kapjunk az üvegen.

7. A keneteket az agy azonos területeiről készítik. Ehhez porcelánmozsárban mozsártörővel vagy kémcsőben üvegrúddal addig őröljük az agydarabokat, amíg homogén massza nem keletkezik, amelyből zsírtalanított üveglemezen durva keneteket készítünk.

Más módon is készíthet kenetet. Ehhez az agy egy kis darabját egy tárgylemez szélére helyezzük, majd egy másik pohárral összetörjük és egyik szélétől a másikig elkenjük, aminek eredményeként vékony, egyenletes kenetet kapunk a tárgylemez felületén. üveg.

8. A keletkező keneteket vagy nyomatokat a következő módok egyikével festik meg:

a) festés Muromcev szerint. Az elkészült, még nedves keneteket vagy lenyomatokat azonnal etil- vagy metil-alkoholban, vagy éterrel vagy acetonnal felezett alkoholos keverékben (kémiailag tiszta) 1-2 órán keresztül rögzítjük, majd vízzel mossuk. A fixáló tartályt jól le kell zárni, hogy a fixáló folyadék ne párologjon el. Vizes mosás után a nedves keneteket 5-10 percre Munson-festék oldatába helyezzük, amelyet vízzel 1:40 arányban hígítunk. Ezután a festéket lecsepegtetjük, és a keneteket azonnal 10%-os vizes tannin oldatba merítjük 8-10 percre, amíg kékes színt nem kapunk. Ezt követően a keneteket vízzel mossuk, szűrőpapíron szárítjuk, egyenlő arányú alkohol és aceton (kémiailag tiszta) vagy alkohol xilollal alkotott keverékén átengedjük, majd szűrőpapírral újra szárítjuk. A festett kenetnek világoskék hátterűnek kell lennie, míg az idegsejtek magjai kékre festettek, a Babesh-Negri testek halványlilák, sötét zárványokkal;

b) Eladók folt. Az elkészített nedves nyomatra vagy kenetre vigye fel 4 másodpercig az "A" reagens (metilénkék - 2 g, aceton nélküli metilalkohol - 100 ml) és a "B" reagens (bázis fukszin - 0,5 g, etil-alkohol nyomok nélkül) keverékét aceton - 100 ml). A festék munkaoldata 15 ml "A" reagensből, 2-4 ml "B" reagensből és 25 ml metil-alkoholból áll. A festés után a készítményt folyó vízzel mossuk és szárítjuk. A festett kenetben az idegsejtek citoplazmája élénkkék, a sejtmagvak sötétkékek, az eritrociták téglavörösek, a Babesh-Negri testei lilásvörösek, a testek jól látható bazofil szerkezetével;

c) festés Mikhin szerint. A keneteket vagy lenyomatokat alkohol és éter keverékében (egyenlően) 5-10 percig rögzítjük, majd szűrőpapírral szárítjuk és 30-40 percig Giemsa festékkel (1-2 csepp 1 ml desztillált vízben) megfestjük. ), gyorsan átmossuk savanyított alkohollal (1 csepp jégecet 30 ml 96°-os alkoholhoz), majd vízzel, szűrőpapírral szárítjuk és kutatásnak vetjük alá. Ha az anyag glicerinben volt, akkor vízben jól leöblítjük és szűrőpapírral szárítjuk.

A festett készítményben mikroszkópos vizsgálat mellett a fő háttér piros, lilás árnyalatú legyen. A kék tónus dominanciájával a kenetet ismét savanyított alkohollal mossuk, majd vízzel mossuk. A piramis idegsejtek kékes színűek, magjuk intenzíven fekete, a babesh-négri testek rózsaszín-vörösek, sötétkék pontozott zárványokkal;

d) Bormann-Gainullina szerinti festés. A vékony keneteket vagy nyomatokat 5 percig rögzítjük a következő összetételű keverékben: alkohol és éter (egyenlő mértékben) - 98 ml, jégecet - 2 ml; rögzítés után 5 percre 10%-os kristályos szódaoldatba merítjük, majd vízzel mossuk és levegőn szárítjuk. A rögzített keneteket 2 percig festjük a felhasználás előtt elkészített festékkel (metilénkék telített vizes oldata - 3 csepp, telített bázikus fukszin oldat - 2 csepp, csapvíz- 20 ml). A festékoldatot kenetre öntjük, égőláng fölött rögzítjük, majd a festéket még egy percig állni hagyjuk, majd vízzel mossuk és szűrőpapírral szárítjuk. A foltos kenetben a fő háttér élénkvörös legyen, az idegsejtek protoplazmája vöröseskékre festődik, magjaik sötétkékek, a Babes-Negri testek epervörösre festettek, jellemzően szemcsés szerkezettel. Az eritrociták festetlen köröknek tűnnek.

II. SZEROLÓGIAI TANULMÁNYOK

9. Diffúz precipitációs reakció agargélen. A reakciót a veszettség specifikus antigénjének kimutatására használják utcai veszettségben elpusztult állatok nem konzervált agyában, valamint olyan állatokban, amelyeken biológiai vizsgálatot végeztek. A reakcióhoz használhat egy elavult (legfeljebb 1 hónapos) agyat.

A reakciót sovány üveglemezeken hajtjuk végre, amelyeken 2,5 ml megolvasztott és 60 °C-ra hűtött agar gélt, a recept szerint elkészítve: száraz agar-agar - 12-15 g; vegytiszta nátrium-klorid - 8,6 g; 1%-os (szűrt) metilnarancsoldat 50°-os alkoholon - 5-10 ml; mertiolát - 0,01 g; desztillált víz - 1 l.

jegyzet. A reakció beállításához jobb a Difko agar-agar használata, teljesen feloldódik, a közeg szűrése nem szükséges. Az agar-agar más fajtái gondos szűrést igényelnek.

Az agar megszilárdulása után vékonyfalú, 4-5 mm belső átmérőjű fém- vagy üvegcsővel lyukakat készítünk benne, a sablonnak megfelelően elrendezve (lásd - ábra).

A nagy állatok reakciójához az agy darabjait használják - az ammon szarvát, a féltekék kérgét, a kisagyot, a medulla oblongata-t; patkányokban, gopherekben, tengerimalacok, hörcsög stb. - az agy bármely három része; az egereknek az egész agyuk van.

Mikrocsapadék beállítási séma:
DE - kéreg (bal félteke); NÁL NÉL- kéreg (jobb félteke); TÓL TŐL- ammonkürt (balra);
D- ammóni kürt (jobbra); E- kisagy; ÉS- medulla;
1 , 2 , 3 , 4 - globulin hígítása 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 arányban.

Pozitív RP minden globulin hígítással
(birka agykéreg, utcai veszettség)

Pozitív RP globulin 1:4 hígításaival; 1:8, 1:16
(ammon kutyakürt, utcai veszettség)

Pozitív RP a globulin 1:16 hígításával,
nincsenek 1:2, 1:4 hígítású csapadékvonalak,
(kutya medulla oblongata, utcai veszettség)

Az agyat porcelán mozsárban mozsártörővel, vagy magában a koponyában „pasztává” őröljük, amelyet az antigén számára lyukak töltenek meg. A fennmaradó lyukakat 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 hígítású, kicsapódó veszettség elleni globulinnal töltjük. A felhasznált összetevők térfogata 0,02 ml.

A pozitív és negatív antigéneket tartalmazó kontrollokat egyidejűleg helyezzük egy külön tárgylemezre, ugyanazt az agart, ugyanazt a sablont használva.

A reakció-összetevők megfelelő lyukakba helyezése után a tárgylemezeket nedves kamrába (Petri-csészék nedves szűrőpapírral vagy vattával) helyezzük, és 6 órára termosztátba helyezzük 37-38 °C hőmérsékleten. Ezután az edényeket további 18 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk.

A reakció számítását 3, 6 és 24 órával a megkötés után végezzük. Az agar kiszáradásának megelőzése érdekében a reakciólemezeket minden egyes megtekintés után ugyanabba a Petri-csészékbe helyezzük, amely nedves vattát tartalmaz.

Pozitív agar kicsapási reakció esetén a globulin és az antigén üregei között egy, kettő és nagyon ritkán három párhuzamos kicsapási vonal is kialakulhat. A keletkező csapadékvonalak vizuálisan láthatóak, ha az üvegeket egy megvilágítóval alulról felfelé, körülbelül 45°-os szögben megvilágítják.

A kicsapási reakció negatív jelzései esetén biológiai vizsgálatot kell végezni.

10. Immunfluoreszcens reakció. Egy olyan vírusantigén speciális mikroszkóppal (ML-1, ML-2, ML-3 stb.) történő kimutatásán alapul, amely reagált egy fluoreszcens festékkel jelölt, specifikus veszettség elleni szérummal.

A reakcióhoz friss vagy frissen fagyasztott agyból vékony és egyenlő rétegű nyomatokat készítenek gondosan zsírtalanított poharakra. Az agydarabokból (Ammon-szarv, agykéreg, kisagy, medulla oblongata) a mikroszkópos vizsgálathoz hasonlóan készítünk lenyomatot. Minden agydarabból legalább 4 készítményt készítenek. A kontrollhoz hasonlóan egy egészséges állat agyából állítanak elő gyógyszereket.

Levegőn történő szárítás után a készítményeket acetonban 4 órán át 4 °C-ot meg nem haladó hőmérsékleten rögzítik. A fixáló tartályt jól le kell zárni, hogy a fixáló folyadék ne párologjon el. Acetonos rögzítés után néhány csepp konjugátumot (fluoreszcens veszettség elleni gammaglobulin) csepegtetünk a készítményekre munkahígításban. Ezután nedves kamrába (Petri-csészébe vagy zárt, nedves aljú zománcozott küvettába) helyezzük 20-30 percre 25 °C-os hőmérsékleten.

Ezt követően a készítményeket vízzel vagy foszfát pufferoldattal (pH 7,2-7,4) 1 órán át mossuk, majd desztillált vízzel öblítjük, levegőn szárítjuk és kutatásnak vetjük alá. Az előkészületeket merítési rendszerben tekintjük meg. A merítéshez nem lumineszcens olajat használnak.

A festett készítményben fluoreszcens mikroszkóp alatt az agyszövet tompa szürkéssárga színnel fluoreszkál (világít). A veszettségvírus antigénjét a készítményekben élénk sárgás-zöld vagy zöld szemcsék formájában mutatják ki, különböző formájú és méretű - az alig észrevehetőtől a 15-20 mikron átmérőjűig.

A kontroll készítményben sárga-zöld intenzíven világító szemcsék nem figyelhetők meg.

A fluoreszcens antitestek módszerével végzett vizsgálatban a veszettség diagnózisa akkor tekinthető megalapozottnak, ha a mikroszkóp több látómezőjében elegendő számú (legalább 10) jellegzetes, élénk zöldes fényű, különböző méretű granulátum található. Az ilyen formációk ellenőrzésében nem szabad.

Pozitív fluoreszcencia hiányában biológiai mintát helyezünk el.

III. BIOLÓGIAI MINTA

11. Veszettség biológiai tesztet végzünk, ha mikroszkópos vizsgálat (Babes-Negri testek nem észlelhető), szerológiai reakciók (specifikus veszettségantigén nem mutatható ki), valamint atipikus zárványok észlelése esetén negatív eredményt adnak. A biológiai tesztet fehér egereken vagy nyulakon végezzük.

12. Kísérleti egereket vagy nyulakat fertőzünk meg a vizsgált agy 10%-os szuszpenziójával 7,2-7,4 pH-jú sóoldatban vagy hús-peptonlevesben. A szuszpenzió elkészítéséhez ugyanazokat az agyrészeket használják, amelyekből az anyagot mikroszkópos és szerológiai vizsgálatokhoz vették.

A kimetszett agyrészeket steril kémcsőbe gyűjtjük és lemérjük, majd mozsárban mozsártörővel alaposan megőröljük, majd fiziológiás sóoldatot vagy hús-peptonlevest adunk hozzá, hogy 10%-os szuszpenziót kapjunk. A kapott szuszpenziót 10 percig állni hagyjuk, és a felülúszót fertőzésre használjuk.

Ha a kóros anyag szennyezett volt, a felülúszót egy másik edénybe (kémcsőbe) öntjük, és 1 ml folyadékonként 500-1000 NE penicillint és sztreptomicint adunk hozzá, majd további 30 percig állni hagyjuk. szobahőmérsékleten, majd fertőzésre használják. A szuszpenziót steril körülmények között, a személyes megelőzés szabályainak szigorú betartásával kell elkészíteni.

Biológiai teszt fehér egereken. A fertőzéshez 8-10 g tömegű fehér egereket használunk, minden vizsgálathoz 6 egeret vettünk, amelyek közül 3 az agyban, 3 pedig szubkután fertőzött. Ha az agyban fertőződik, a tűt a hátsó sarkokat összekötő vonal mögötti és a fej közepén futó vonaltól kissé távolabbi pontba szúrják be. A fertőzés helyét alkohollal töröljük le. A szuszpenziót 0,03 ml-es dózisban adjuk be. A tűnek az agyba való mély behatolásának megakadályozása érdekében egy határolót helyeznek a hegyére - egy kis gumicsődarabot, amelyet a tű végétől 2-3 mm távolságra rögzítenek. Subcutan fertőzés esetén a szuszpenziót az orrhegy régiójába fecskendezik (a felső ajak) 0,05 ml-es adagban. Az injekció beadásának helyén kis duzzanat képződik. A fertőzött egereket üvegedényekbe helyezzük, és 30 napig megfigyeljük. Nál nél pozitív eredmény biológiai minták egerekben, általában a fertőzést követő 7.-15. napon kialakul a bénulásos veszettség klinikája.

Kezdetben letargiát, kócos kabátot és egyfajta púposságot, valamint a mozgáskoordináció zavarát figyelik meg. Ezután jön a hátsó végtagok, majd később - az elülső végtagok bénulása, általános bénulásba fordulva, amely halállal végződik. A betegség időtartama 2-3 nap.

Az általános bénulás kialakulásával az egereket éteres vagy kloroformos érzéstelenítéssel leölték. Az elpusztult és elpusztult egereknél a koponyaüreget kinyitják, az agyat táptalajra oltják, majd eltávolítják az agyat, amelyből mikroszkopikus és immunbiológiai vizsgálatokhoz preparátumokat készítenek.

A távolléttel klinikai megnyilvánulásai A fertőzött egerek veszettségét 30 napon belül megsemmisítik. Az üvegeket, amelyekben tárolták, alaposan fertőtlenítik.

Biológiai teszt nyulakon. A biológiai minta felállításához 4, egyenként legalább 1,5 kg-os nyulat veszünk. 2 nyúl az agyban és 2 intramuszkulárisan a comb területén fertőzött. A szuszpenziót intracerebrálisan 0,2 ml-es dózisban és intramuszkulárisan 2 ml-es dózisban adjuk be.

A biológiai teszt pozitív eredménye esetén a nyulak 16-21 napon belül megbetegednek. A veszettség nyulaknál néma bénulásos formában fordul elő halálos. Az elhullott nyulak agyát eltávolítják és további kutatásokat végeznek ugyanúgy, mint az egerek megfertőzésekor. A nyulakat 45-50 napig figyelik meg. A megadott idő elteltével a nyulakat megsemmisítik. A ketreceket, amelyekben a kísérleti állatokat tartották, fertőtlenítik.

IV. SZÖVETTANI VIZSGÁLAT 1

1 Kiegészítő módszerként szövettani vizsgálatot alkalmaznak

Szövettani vizsgálathoz az Ammon-szarv, az agykéreg, a kisagy, a medulla oblongata darabjait egy vagy két adag acetonban rögzítjük úgy, hogy a rögzítés időtartama 6-18 órán belül legyen.

Jobb, ha a rögzítést egy éjszakán át acetonban hagyjuk. Ezután a kóros anyagot két adag xilolon vezetjük át, mindegyik 30 percig tartva, és két adag paraffin - egyenként 1 órán keresztül. A kész metszeteket a szokásos módszerrel paraffinmentesítjük, és Lenz vagy Turevich szerint festjük:

Színezés Lenz szerint. A metszeteket eozin oldattal festjük 1-3 percig (0,5 g eozint feloldunk 100 ml 60 °C-os vízben etilalkohol). Az eozint gyorsan lemossuk vízzel, és Lefleur-féle metilénkékkel festjük 1 percig, vízzel mossuk, szűrőpapíron óvatosan szárítjuk, majd egységnyi oldattal differenciáljuk. aki nátriumot abszolút alkoholban (5 csepp nátronlúg 30 ml alkoholra) halvány rózsaszín színűvé. A készítményre ecetsavoldatot öntünk (1 csepp jégecet 60 ml abszolút alkoholra), és halvány kék szín megjelenéséig tartjuk, alkohollal gyorsan lemossuk és xilollal 4-5 percig derítjük. Babesh-Negri teste élénkvörösre festett kék zárványokkal, a ganglionsejtek citoplazmája halványkék;

Színezés Turevich szerint. A paraffinmentesített metszeteket közvetlenül az alkoholon és desztillált vízen való átengedés után Weigert- vagy Ehrlich-féle hematoxilinnel megfestjük, desztillált vízzel mossuk. Ezután 1%-os vizes savas fukszin oldattal festjük 1 percig, és alaposan mossuk desztillált vízzel, amíg halvány rózsaszín árnyalat nem jelenik meg. Mosás után pikrinsav telített vizes oldatának (25-30 g pikrinsav/1 liter forró desztillált víz) és 96%-os alkohol keverékével kezeljük (egyenlő arányban). A feldolgozás során megfigyelhető a vörös festékfelhők kiürülése, és a szakaszok 10-20 másodperc múlva sárga árnyalatot kapnak. A metszeteket gyorsan leöblítjük vízben, és szűrőpapírral enyhén megszárítjuk. Ezután ugyanolyan gyorsan átengedik az abszolút vagy 96°-os alkoholon, karbol-xilénen, tiszta xilénen, és balzsamba helyezik. A Babesh-Negri teste cseresznyepiros, a sejtmagok fekete vagy kék színűek, attól függően, hogy melyik hematoxilinnal festettek. A Babesh-Negri testének alakja és mérete nagyon változatos, az idegsejtek citoplazmájában és folyamataiban találhatók számos vagy egyetlen másolat formájában. A Babes-Negri testek gyakrabban nagy ganglionsejtekben találhatók, és az ezeket tartalmazó sejtekben nincs kifejezett degeneráció jele.

Gyakran találnak más zárványokat is, amelyeket számos hasonló tulajdonság miatt néha összetévesztenek négri testekkel. Nem szabad megfeledkezni arról, hogy az egészséges macskák és fehér egerek agya néha nem specifikus acidofil zárványtesteket tartalmaz. Ezeket a testeket a belső szemcsék hiánya és a főanyag homogenitása alapján lehet megkülönböztetni a negri testektől.

A veszettségre az akut encephalomyelitis tünetei is jellemzőek: túlnyomórészt a kis vénák környékén perivaszkuláris infiltrátumok találhatók, amelyek főként sejtmuffnak tűnő limfoid sejtekből állnak.

Az agy ganglionsejtjeiben kromatolízis, vakuolizáció és a sejtek akut duzzanata, valamint egyes sejtek elpusztulása fordulhat elő. A sérült idegsejtek területén a glia proliferatív reakciója meglehetősen állandó, valódi neuronofágia formájában, majd az idegsejtek cseréje megsokszorozott glia elemekkel. A burjánzó sejtek ilyen felhalmozódása a leromlott helyén idegsejt"veszettség csomónak" nevezik - a vágáson néha nyomon lehet követni a csomó fejlődését (1).

MÓDSZERTANI UTASÍTÁSOK
VESETSÉG LABORATÓRIUMI DIAGNÓZISJA

1. A veszettség diagnosztizálása járványtani, klinikai, patoanatómiai adatok összessége és főként laboratóriumi vizsgálatok alapján történik.

2. Kutatás céljából futárral küldik a laboratóriumba: egy kutya (macska, róka, sarki róka, birka, borjú stb.) friss holttestét vagy fejét, nagytestű állatokból - fej vagy agy (friss vagy konzerv). 30-50%-os glicerines oldatban). Csak a nem tartósított agy alkalmas szerológiai vizsgálatokra.

3. A veszettség laboratóriumi diagnosztikája az agy mikroszkópos vizsgálatából (Babes-Negri testek kimutatása érdekében), szerológiai vizsgálatból (specifikus veszettség antigén kimutatása), valamint fehér egereken vagy nyulakon végzett biológiai vizsgálatból áll. .

Kutatási sorrend.

4. A vizsgálathoz kapott agyból először táptalajra vetik őket. Az agy egy részét azonnal a hűtőszekrénybe helyezzük és tároljuk, ha újbóli vizsgálatra van szükség. Az agy többi részéből anyagot vesznek ki mikroszkópos vizsgálathoz, szerológiai reakciókhoz és biológiai mintákhoz.

jegyzet. A boncolás, az agy eltávolítása és az egyéb munkavégzés steril körülmények között, a személyes megelőzési intézkedések szigorú betartásával (az állat fejének erős rögzítése, a kezek két pár kesztyűvel: sebészeti és anatómiai kesztyűvel való védelme, védőszemüveg viselése) történik. védje a szemet, az orrot és a szájat gézkötéssel fedjük le).

I. MIKROSZKÓPOS VIZSGÁLATOK

5. A mikroszkópos vizsgálathoz lenyomatokat és keneteket készítenek az agy különböző részeiről.

6. Lenyomat készítéséhez az agy darabjait (Ammon-szarv, agykéreg, kisagy, medulla oblongata) 4-6 rétegben hajtogatott szűrőpapírra helyezzük. A vágott felületet egymás után többször (3-4) érintjük meg tiszta üveglappal, enyhén megnyomva, hogy vékony lenyomatot kapjunk az üvegen.

7. A keneteket az agy azonos területeiről készítik. Ehhez porcelánmozsárban mozsártörővel vagy kémcsőben üvegrúddal addig őröljük az agydarabokat, amíg homogén massza nem keletkezik, amelyből zsírtalanított üveglemezen durva keneteket készítünk.

Más módon is készíthet kenetet. Ehhez az agy egy kis darabját egy tárgylemez szélére helyezzük, majd egy másik pohárral összetörjük és egyik szélétől a másikig elkenjük, aminek eredményeként vékony, egyenletes kenetet kapunk a tárgylemez felületén. üveg.

8. A keletkező keneteket vagy nyomatokat a következő módok egyikével festik meg:

a) festés Muromcev szerint. Az elkészült, még nedves keneteket vagy lenyomatokat azonnal etil- vagy metil-alkoholban, vagy éterrel vagy acetonnal felezett alkoholos keverékben (kémiailag tiszta) 1-2 órán keresztül rögzítjük, majd vízzel mossuk. A fixáló tartályt jól le kell zárni, hogy a fixáló folyadék ne párologjon el. Vizes mosás után a nedves keneteket 5-10 percre Munson-festék oldatába helyezzük, amelyet vízzel 1:40 arányban hígítunk. Ezután a festéket lecsepegtetjük, és a keneteket azonnal 10%-os vizes tannin oldatba merítjük 8-10 percre, amíg kékes színt nem kapunk. Ezt követően a keneteket vízzel mossuk, szűrőpapíron szárítjuk, egyenlő arányú alkohol és aceton (kémiailag tiszta) vagy alkohol xilollal alkotott keverékén átengedjük, majd szűrőpapírral újra szárítjuk. A festett kenetnek világoskék hátterűnek kell lennie, míg az idegsejtek magjai kékre festettek, a Babesh-Negri testek halványlilák, sötét zárványokkal;

b) Eladók folt. Az elkészített nedves nyomatra vagy kenetre vigye fel 4 másodpercig az "A" reagens (metilénkék - 2 g, aceton nélküli metilalkohol - 100 ml) és a "B" reagens (bázis fukszin - 0,5 g, etil-alkohol nyomok nélkül) keverékét aceton - 100 ml). A festék munkaoldata 15 ml "A" reagensből, 2-4 ml "B" reagensből és 25 ml metil-alkoholból áll. A festés után a készítményt folyó vízzel mossuk és szárítjuk. A festett kenetben az idegsejtek citoplazmája élénkkék, a sejtmagvak sötétkékek, az eritrociták téglavörösek, a Babesh-Negri testei lilásvörösek, a testek jól látható bazofil szerkezetével;

c) festés Mikhin szerint. A keneteket vagy lenyomatokat alkohol és éter keverékében (egyenlően) 5-10 percig rögzítjük, majd szűrőpapírral szárítjuk és 30-40 percig Giemsa festékkel (1-2 csepp 1 ml desztillált vízben) megfestjük. ), gyorsan átmossuk savanyított alkohollal (1 csepp jégecet 30 ml 96°-os alkoholhoz), majd vízzel, szűrőpapírral szárítjuk és kutatásnak vetjük alá. Ha az anyag glicerinben volt, akkor vízben jól leöblítjük és szűrőpapírral szárítjuk.

A festett készítményben mikroszkópos vizsgálat mellett a fő háttér piros, lilás árnyalatú legyen. A kék tónus dominanciájával a kenetet ismét savanyított alkohollal mossuk, majd vízzel mossuk. A piramis idegsejtek kékes színűek, magjuk intenzíven fekete, a babesh-négri testek rózsaszín-vörösek, sötétkék pontozott zárványokkal;

d) Bormann-Gainullina szerinti festés. A vékony keneteket vagy nyomatokat 5 percig rögzítjük a következő összetételű keverékben: alkohol és éter (egyenlő mértékben) - 98 ml, jégecet - 2 ml; rögzítés után 5 percre 10%-os kristályos szódaoldatba merítjük, majd vízzel mossuk és levegőn szárítjuk. A rögzített keneteket 2 percig festjük a felhasználás előtt elkészített festékkel (telített vizes metilénkék oldat - 3 csepp, telített bázikus fukszin oldat - 2 csepp, csapvíz - 20 ml). A festékoldatot kenetre öntjük, égőláng fölött rögzítjük, majd a festéket még egy percig állni hagyjuk, majd vízzel mossuk és szűrőpapírral szárítjuk. A foltos kenetben a fő háttér élénkvörös legyen, az idegsejtek protoplazmája vöröseskékre festődik, magjaik sötétkékek, a Babes-Negri testek epervörösre festettek, jellemzően szemcsés szerkezettel. Az eritrociták festetlen köröknek tűnnek.

II. SZEROLÓGIAI TANULMÁNYOK

9. Diffúz precipitációs reakció agargélen. A reakciót a veszettség specifikus antigénjének kimutatására használják utcai veszettségben elpusztult állatok nem konzervált agyában, valamint olyan állatokban, amelyeken biológiai vizsgálatot végeztek. A reakcióhoz használhat egy elavult (legfeljebb 1 hónapos) agyat.

A reakciót sovány üveglemezeken hajtjuk végre, amelyeken 2,5 ml megolvasztott és 60 °C-ra hűtött agar gélt, a recept szerint elkészítve: száraz agar-agar - 12-15 g; vegytiszta nátrium-klorid - 8,6 g; 1%-os (szűrt) metilnarancsoldat 50°-os alkoholon - 5-10 ml; mertiolát - 0,01 g; desztillált víz - 1 l.

jegyzet. A reakció beállításához jobb a Difko agar-agar használata, teljesen feloldódik, a közeg szűrése nem szükséges. Az agar-agar más fajtái gondos szűrést igényelnek.

Az agar megszilárdulása után vékonyfalú, 4-5 mm belső átmérőjű fém- vagy üvegcsővel lyukakat készítünk benne, a sablonnak megfelelően elrendezve (lásd - ábra).

A nagy állatok reakciójához az agy darabjait használják - az ammon szarvát, a féltekék kérgét, a kisagyot, a medulla oblongata-t; patkányoknál, gophereknél, tengerimalacoknál, hörcsögöknél stb. - az agy bármely három része; az egereknek az egész agyuk van.

Mikrocsapadék beállítási séma:
DE - kéreg (bal félteke); NÁL NÉL- ugat ( jobb agyfélteke); TÓL TŐL- ammonkürt (balra);
D- ammóni kürt (jobbra); E- kisagy; ÉS- medulla;
1 , 2 , 3 , 4 - globulin hígítása 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 arányban.

Pozitív RP minden globulin hígítással
(birka agykéreg, utcai veszettség)

Pozitív RP globulin 1:4 hígításaival; 1:8, 1:16
(ammon kutyakürt, utcai veszettség)

Pozitív RP a globulin 1:16 hígításával,
nincsenek 1:2, 1:4 hígítású csapadékvonalak,
(kutya medulla oblongata, utcai veszettség)

Az agyat porcelán mozsárban mozsártörővel, vagy magában a koponyában „pasztává” őröljük, amelyet az antigén számára lyukak töltenek meg. A fennmaradó lyukakat 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 hígítású, kicsapódó veszettség elleni globulinnal töltjük. A felhasznált összetevők térfogata 0,02 ml.

A pozitív és negatív antigéneket tartalmazó kontrollokat egyidejűleg helyezzük egy külön tárgylemezre, ugyanazt az agart, ugyanazt a sablont használva.

A reakció-összetevők megfelelő lyukakba helyezése után a tárgylemezeket nedves kamrába (Petri-csészék nedves szűrőpapírral vagy vattával) helyezzük, és 6 órára termosztátba helyezzük 37-38 °C hőmérsékleten. Ezután az edényeket további 18 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk.

A reakció számítását 3, 6 és 24 órával a megkötés után végezzük. Az agar kiszáradásának megelőzése érdekében a reakciólemezeket minden egyes megtekintés után ugyanabba a Petri-csészékbe helyezzük, amely nedves vattát tartalmaz.

Pozitív agar kicsapási reakció esetén a globulin és az antigén üregei között egy, kettő és nagyon ritkán három párhuzamos kicsapási vonal is kialakulhat. A keletkező csapadékvonalak vizuálisan láthatóak, ha az üvegeket egy megvilágítóval alulról felfelé, körülbelül 45°-os szögben megvilágítják.

A kicsapási reakció negatív jelzései esetén biológiai vizsgálatot kell végezni.

10. Immunfluoreszcens reakció. Egy olyan vírusantigén speciális mikroszkóppal (ML-1, ML-2, ML-3 stb.) történő kimutatásán alapul, amely reagált egy fluoreszcens festékkel jelölt, specifikus veszettség elleni szérummal.

A reakcióhoz friss vagy frissen fagyasztott agyból vékony és egyenlő rétegű nyomatokat készítenek gondosan zsírtalanított poharakra. Az agydarabokból (Ammon-szarv, agykéreg, kisagy, medulla oblongata) a mikroszkópos vizsgálathoz hasonlóan készítünk lenyomatot. Minden agydarabból legalább 4 készítményt készítenek. A kontrollhoz hasonlóan egy egészséges állat agyából állítanak elő gyógyszereket.

Levegőn történő szárítás után a készítményeket acetonban 4 órán át 4 °C-ot meg nem haladó hőmérsékleten rögzítik. A fixáló tartályt jól le kell zárni, hogy a fixáló folyadék ne párologjon el. Acetonos rögzítés után néhány csepp konjugátumot (fluoreszcens veszettség elleni gammaglobulin) csepegtetünk a készítményekre munkahígításban. Ezután nedves kamrába (Petri-csészébe vagy zárt, nedves aljú zománcozott küvettába) helyezzük 20-30 percre 25 °C-os hőmérsékleten.

Ezt követően a készítményeket vízzel vagy foszfát pufferoldattal (pH 7,2-7,4) 1 órán át mossuk, majd desztillált vízzel öblítjük, levegőn szárítjuk és kutatásnak vetjük alá. Az előkészületeket merítési rendszerben tekintjük meg. A merítéshez nem lumineszcens olajat használnak.

A festett készítményben fluoreszcens mikroszkóp alatt az agyszövet tompa szürkéssárga színnel fluoreszkál (világít). A veszettségvírus antigénjét a készítményekben élénk sárgás-zöld vagy zöld szemcsék formájában mutatják ki, különböző formájú és méretű - az alig észrevehetőtől a 15-20 mikron átmérőjűig.

A kontroll készítményben sárga-zöld intenzíven világító szemcsék nem figyelhetők meg.

A fluoreszcens antitestek módszerével végzett vizsgálatban a veszettség diagnózisa akkor tekinthető megalapozottnak, ha a mikroszkóp több látómezőjében elegendő számú (legalább 10) jellegzetes, élénk zöldes fényű, különböző méretű granulátum található. Az ilyen formációk ellenőrzésében nem szabad.

Pozitív fluoreszcencia hiányában biológiai mintát helyezünk el.

III. BIOLÓGIAI MINTA

11. Veszettség biológiai tesztet végzünk, ha mikroszkópos vizsgálat (Babes-Negri testek nem észlelhető), szerológiai reakciók (specifikus veszettségantigén nem mutatható ki), valamint atipikus zárványok észlelése esetén negatív eredményt adnak. A biológiai tesztet fehér egereken vagy nyulakon végezzük.

12. Kísérleti egereket vagy nyulakat fertőzünk meg a vizsgált agy 10%-os szuszpenziójával 7,2-7,4 pH-jú sóoldatban vagy hús-peptonlevesben. A szuszpenzió elkészítéséhez ugyanazokat az agyrészeket használják, amelyekből az anyagot mikroszkópos és szerológiai vizsgálatokhoz vették.

A kimetszett agyrészeket steril kémcsőbe gyűjtjük és lemérjük, majd mozsárban mozsártörővel alaposan megőröljük, majd fiziológiás sóoldatot vagy hús-peptonlevest adunk hozzá, hogy 10%-os szuszpenziót kapjunk. A kapott szuszpenziót 10 percig állni hagyjuk, és a felülúszót fertőzésre használjuk.

Ha a kóros anyag szennyezett volt, a felülúszót egy másik edénybe (kémcsőbe) öntjük, és 1 ml folyadékonként 500-1000 NE penicillint és sztreptomicint adunk hozzá, majd további 30 percig állni hagyjuk. szobahőmérsékleten, majd fertőzésre használják. A szuszpenziót steril körülmények között, a személyes megelőzés szabályainak szigorú betartásával kell elkészíteni.

Biológiai teszt fehér egereken. A fertőzéshez 8-10 g tömegű fehér egereket használunk, minden vizsgálathoz 6 egeret vettünk, amelyek közül 3 az agyban, 3 pedig szubkután fertőzött. Ha az agyban fertőződik, a tűt a hátsó sarkokat összekötő vonal mögötti és a fej közepén futó vonaltól kissé távolabbi pontba szúrják be. A fertőzés helyét alkohollal töröljük le. A szuszpenziót 0,03 ml-es dózisban adjuk be. A tűnek az agyba való mély behatolásának megakadályozása érdekében egy határolót helyeznek a hegyére - egy kis gumicsődarabot, amelyet a tű végétől 2-3 mm távolságra rögzítenek. Nál nél szubkután fertőzés a szuszpenziót 0,05 ml-es adagban az orrhegy (felső ajak) területére fecskendezzük. Az injekció beadásának helyén kis duzzanat képződik. A fertőzött egereket üvegedényekbe helyezzük, és 30 napig megfigyeljük. Az egereken végzett biológiai teszt pozitív eredményével, általában a fertőzés utáni 7-15. napon, a bénulásos veszettség klinikája alakul ki.

Kezdetben letargiát, kócos kabátot és egyfajta púposságot, valamint a mozgáskoordináció zavarát figyelik meg. Ezután jön a hátsó végtagok, majd később - az elülső végtagok bénulása, általános bénulásba fordulva, amely halállal végződik. A betegség időtartama 2-3 nap.

Az általános bénulás kialakulásával az egereket éteres vagy kloroformos érzéstelenítéssel leölték. Az elpusztult és elpusztult egereknél a koponyaüreget kinyitják, az agyat táptalajra oltják, majd eltávolítják az agyat, amelyből mikroszkopikus és immunbiológiai vizsgálatokhoz preparátumokat készítenek.

A veszettség klinikai megnyilvánulása hiányában a fertőzött egerekben 30 napon belül elpusztulnak. Az üvegeket, amelyekben tárolták, alaposan fertőtlenítik.

Biológiai teszt nyulakon. A biológiai minta felállításához 4, egyenként legalább 1,5 kg-os nyulat veszünk. 2 nyúl az agyban és 2 intramuszkulárisan a comb területén fertőzött. A szuszpenziót intracerebrálisan 0,2 ml-es dózisban és intramuszkulárisan 2 ml-es dózisban adjuk be.

A biológiai teszt pozitív eredménye esetén a nyulak 16-21 napon belül megbetegednek. A veszettség nyulakban csendes bénulásban fordul elő, halálos kimenetelű. Az elhullott nyulak agyát eltávolítják és további kutatásokat végeznek ugyanúgy, mint az egerek megfertőzésekor. A nyulakat 45-50 napig figyelik meg. A megadott idő elteltével a nyulakat megsemmisítik. A ketreceket, amelyekben a kísérleti állatokat tartották, fertőtlenítik.

IV. SZÖVETTANI VIZSGÁLAT 1

1 Kiegészítő módszerként szövettani vizsgálatot alkalmaznak

Szövettani vizsgálathoz az Ammon-szarv, az agykéreg, a kisagy, a medulla oblongata darabjait egy vagy két adag acetonban rögzítjük úgy, hogy a rögzítés időtartama 6-18 órán belül legyen.

Jobb, ha a rögzítést egy éjszakán át acetonban hagyjuk. Ezután a kóros anyagot két adag xilolon vezetjük át, mindegyik 30 percig tartva, és két adag paraffin - egyenként 1 órán keresztül. A kész metszeteket a szokásos módszerrel paraffinmentesítjük, és Lenz vagy Turevich szerint festjük:

Színezés Lenz szerint. A metszeteket eozinoldattal festjük 1-3 percig (0,5 g eozint 100 ml 60%-os etil-alkoholban oldunk). Az eozint gyorsan lemossuk vízzel, és Lefleur-féle metilénkékkel festjük 1 percig, vízzel mossuk, szűrőpapíron óvatosan szárítjuk, majd egységnyi oldattal differenciáljuk. aki nátriumot abszolút alkoholban (5 csepp nátronlúg 30 ml alkoholra) halvány rózsaszín színűvé. A készítményre ecetsavoldatot öntünk (1 csepp jégecet 60 ml abszolút alkoholra), és halvány kék szín megjelenéséig tartjuk, alkohollal gyorsan lemossuk és xilollal 4-5 percig derítjük. Babesh-Negri teste élénkvörösre festett kék zárványokkal, a ganglionsejtek citoplazmája halványkék;

Színezés Turevich szerint. A paraffinmentesített metszeteket közvetlenül az alkoholon és desztillált vízen való átengedés után Weigert- vagy Ehrlich-féle hematoxilinnel megfestjük, desztillált vízzel mossuk. Ezután 1%-os vizes savas fukszin oldattal festjük 1 percig, és alaposan mossuk desztillált vízzel, amíg halvány rózsaszín árnyalat nem jelenik meg. Mosás után pikrinsav telített vizes oldatának (25-30 g pikrinsav/1 liter forró desztillált víz) és 96%-os alkohol keverékével kezeljük (egyenlő arányban). A feldolgozás során megfigyelhető a vörös festékfelhők kiürülése, és a szakaszok 10-20 másodperc múlva sárga árnyalatot kapnak. A metszeteket gyorsan leöblítjük vízben, és szűrőpapírral enyhén megszárítjuk. Ezután ugyanolyan gyorsan átengedik az abszolút vagy 96°-os alkoholon, karbol-xilénen, tiszta xilénen, és balzsamba helyezik. A Babesh-Negri teste cseresznyepiros, a sejtmagok fekete vagy kék színűek, attól függően, hogy melyik hematoxilinnal festettek. A Babesh-Negri testének alakja és mérete nagyon változatos, az idegsejtek citoplazmájában és folyamataiban találhatók számos vagy egyetlen másolat formájában. A Babes-Negri testek gyakrabban nagy ganglionsejtekben találhatók, és az ezeket tartalmazó sejtekben nincs kifejezett degeneráció jele.

Gyakran találnak más zárványokat is, amelyeket számos hasonló tulajdonság miatt néha összetévesztenek négri testekkel. Nem szabad megfeledkezni arról, hogy az egészséges macskák és fehér egerek agya néha nem specifikus acidofil zárványtesteket tartalmaz. Ezeket a testeket a belső szemcsék hiánya és a főanyag homogenitása alapján lehet megkülönböztetni a negri testektől.

A veszettségre az akut encephalomyelitis tünetei is jellemzőek: túlnyomórészt a kis vénák környékén perivaszkuláris infiltrátumok találhatók, amelyek főként sejtmuffnak tűnő limfoid sejtekből állnak.

Az agy ganglionsejtjeiben kromatolízis, vakuolizáció és a sejtek akut duzzanata, valamint egyes sejtek elpusztulása fordulhat elő. A sérült idegsejtek területén a glia proliferatív reakciója meglehetősen állandó, valódi neuronofágia formájában, majd az idegsejtek cseréje megsokszorozott glia elemekkel. A proliferált sejtek ilyen felhalmozódását a szétesett idegsejt helyén „veszettséggócnak” nevezik – esetenként egy metszeten nyomon követhető a csomófejlődés folyamata (1).