ადამიანის ცოფის ლაბორატორიული მაჩვენებლები. ცოფი შინაურ და გარეულ ცხოველებში. ცოფის ინკუბაციური პერიოდი
ცოფის სწრაფი დიაგნოსტიკა
ანტიგენების გამოვლენის მეთოდები. ცოფის შემთხვევაში ექსპრეს დიაგნოსტიკისთვის შეიძლება გამოყენებულ იქნას ფლუორესცენტური ანტისხეულების მეთოდები (MFA), ნალექის რეაქციები (RP) აგარის გელში, ფერმენტული იმუნოანალიზის მეთოდები (ELISA), პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (PCR). ადამიანებში ცოფის in vivo დიაგნოსტიკისთვის საჭიროა რამდენიმე ტესტი.
ცოფის ვირუსის ანტიგენების მიმართ ანტისხეულების განსაზღვრა. სისხლის შრატში ან ცერებროსპინალურ სითხეში ანტისხეულების გამოვლენა მნიშვნელოვანი დიაგნოსტიკური მეთოდია. ცოფის სპეციფიკური ანტისხეულების სეროლოგიური ტესტირება ტარდება სისხლის შრატში ექსპოზიციამდე და შემდგომ ვაქცინაციის დასადგენად და იმუნური პასუხის გაზრდის მიზნით გამაძლიერებელი იმუნიზაციის დროის განსაზღვრის მიზნით.
ვირუსის იზოლაცია. ვირუსის იზოლაციისა და იდენტიფიკაციისთვის გამოიყენება თეთრ თაგვებზე ბიოანალიზის მეთოდი. ტესტის მასალა შეჩერებულია ფიზიოლოგიურ ხსნარში, რომელიც შეიცავს ანტიბიოტიკებს და ნაყოფის მსხვილფეხა რქოსანი შრატს. სუსპენზია შეჰყავთ ცერებრალურად თეთრ თაგვებზე, რომელთა წონაა 5-6 გ. ინფექციის განვითარების დასადასტურებლად, თაგვებს აკვირდებიან ყოველდღიურად ინოკულაციის შემდეგ 30-ე დღემდე. თაგვები, რომლებსაც დაავადება უვითარდებათ ამ პერიოდის განმავლობაში, დაუყოვნებლივ ექვემდებარებიან ევთანაზიას და ტვინის ქსოვილების გამოკვლევას პირდაპირი MFA-ით.
ამ მიდგომის უპირატესობაა მასალაში ცოფის ვირუსის მცირე რაოდენობით გამოვლენის შესაძლებლობა. მეთოდის მინუსი არის მრავალდღიანი (7-18 დღე) ლოდინის საჭიროება ინოკულაციასა და დაავადების პირველი ნიშნების გამოვლენას შორის. ინკუბაციური პერიოდის შესამცირებლად გამოიყენება ძუძუთი თაგვები. 3 დღეზე ნაკლები ასაკის თაგვები შეიძლება გამოყენებულ იქნას ექსპრეს დიაგნოსტიკისთვის: თაგვებში, რომლებიც დაკლულნი არიან 3 დღის შემდეგ, ვირუსის ანტიგენი უკვე აღმოჩენილია თავის ტვინში, რომელიც შეიძლება გამოვლინდეს MFA-ს მიერ.
ვირუსის იზოლაციის ეს მეთოდი გამოიყენება როგორც დამადასტურებელი დიაგნოსტიკური ტესტი ანტიგენისა და ბაბეს-ნეგრის სხეულების აღმოსაჩენად უარყოფითი შედეგებისთვის და ცოფზე ეჭვმიტანილი ცხოველის მიერ ადამიანის ნაკბენის შემთხვევაში. იგი უზრუნველყოფს შესაბამის მგრძნობელობას და სპეციფიკას, ანუ განიხილება პირდაპირი იმუნოფლუორესცენციის მეთოდის დიაგნოსტიკური მნიშვნელობის დონეზე. გარდა ამისა, ეს მეთოდი არის მთავარი ვირუსის ვარიანტების იდენტიფიკაციისთვის და პერსპექტიულია დიაგნოსტიკური რეაგენტების შემუშავებისთვის.
ვირუსის იზოლაცია და იდენტიფიკაცია უჯრედულ კულტურაში. ლაბორატორიული ცხოველების ინფექციის დროს ვირუსის იზოლაციის მთავარი მინუსი არის მეთოდის ხანგრძლივობა. ამის თავიდან აცილება შესაძლებელია უჯრედული კულტურების გამოყენებით. ჩვეულებრივ, ამ მიზნებისათვის გამოიყენება თაგვის ნეირობლასტომის უჯრედების კულტურა, თუ საჭიროა ტვინის ქსოვილების გამოკვლევა. ტვინი შეჩერებულია კულტურის მკვებავ გარემოში, სუსპენზია გამოიყენება უჯრედული კულტურის ერთ ფენაზე და ინკუბირებულია ერთიდან რამდენიმე დღის განმავლობაში.
მოცემული კულტურის მგრძნობელობა ვირუსის მიმართ შეიძლება გაიზარდოს მისი DEAE დექსტრანით დამუშავებით. უჯრედის მონოფენა შემდეგ ირეცხება, სიცივეში ფიქსირდება აცეტონით ან ფორმალინისა და მეთანოლის ნარევით და იკვლევენ იმუნოფლუორესცენციით. თუ ცხოველი დაინფიცირდა ცოფის ვირუსით, მაშინ ცოფის ვირუსის ანტიგენის ციტოპლაზმური ჩანართები აღმოჩენილია უჯრედული კულტურის მონოფენაში.
ნაჩვენებია, რომ ცოფის ვირუსის ანტიგენი შეიძლება გამოვლინდეს Na C1 300 თაგვის ნეირობლასტომის უჯრედებზე MFA-სთან ერთად 2 დღის შემდეგ. მეთოდის მგრძნობელობა შედარებულია თაგვებში ვირუსის იზოლაციის მგრძნობელობასთან.
მიუხედავად იმისა, რომ ცოფის ვირუსს აქვს სავალდებულო ნეიროპათოგენურობა in vivo, მას შეუძლია დაინფიციროს მასპინძელი უჯრედების ფართო სპექტრი in vitro, რაც შეიძლება გამოყენებულ იქნას სხვა ქსოვილებისა და ორგანოების შესამოწმებლად ცოფის ვირუსის არსებობისთვის. დადგენილია, რომ ცოფის ვირუსი მრავლდება BHK-21 და ვერო უჯრედებში, ქათმის ემბრიონის ან ზაზუნის თირკმლების პირველად უჯრედებში. ნაჩვენებია, რომ ვირუსის ადსორბცია და მისი შეყვანა უჯრედში ხდება 7 საათის განმავლობაში. 24-48 საათის შემდეგ უჯრედის შიგნით წარმოიქმნება ახალი ვირუსული ნაწილაკები, 72 საათის შემდეგ ისინი უჯრედის მემბრანიდან უჯრედშორის სივრცეში იშლება.
Კვლევის მეთოდები
ამისთვის ცოფის ექსპრეს დიაგნოსტიკაშეიძლება გამოყენებულ იქნას:
ა) მეთოდი ᲗᲣ- ცოფის ვირუსის ანტიგენის აღმოჩენა თმის ფოლიკულების შემცველი პაციენტის რქოვანას ან კისრის უკანა ანაბეჭდებში;
ბ) მეთოდი PCR- ვირუსის რნმ-ის გამოსავლენად ქსოვილის ბიოფსიის ნიმუშებში, ნერწყვში, ცერებროსპინალურ ან ცრემლიან სითხეში;
გ) მეთოდი ELISA- ტიპიური ან ატიპიური კურსის მქონე პაციენტებში სპეციფიკური ანტისხეულების (ანტიგენის) გამოსავლენად.
დ) მეთოდი ბიოანალიზები- ვირუსის იზოლირება დაავადების ადრეულ სტადიაზე ან სისხლში ან ცერებროსპინალურ სითხეში ანტისხეულების აღმოჩენა დაავადების შემდგომ სტადიებზე. ექსპრეს დიაგნოსტიკისთვის გამოიყენება კომპლექსური მეთოდი (ბიოანალიზი + MFA), რომელიც მოიცავს 2 დღის ახალშობილ თაგვებს ტესტის მასალით დაინფიცირებას და მათი ტვინის გამოკვლევას MFA-ში 3-4 დღეს.
in vivo დიაგნოსტიკის მეთოდების არჩევანი დიდწილად დამოკიდებულია დაავადების სტადიაზე: ანტიგენების გამოვლენაზე დაფუძნებული მეთოდი, როგორც წესი, ძალიან მგრძნობიარეა ინკუბაციური პერიოდის ბოლოს, დაავადების პირველი რამდენიმე დღის განმავლობაში. ხოლო ვირუსის გამანეიტრალებელი ანტისხეულები ჩვეულებრივ ჩნდება ცერებროსპინალურ სითხეში და შრატის სისხლში დაავადების დაწყებიდან 7-10 დღის შემდეგ.
იმუნოფლუორესცენციის რეაქცია. მეთოდი ეფუძნება საღებავთან შეკრული ანტისხეულების გამოყენებას, მაგალითად, ფლუორესცეინის იზოთიოციანატს. RIF ფართოდ გამოიყენება პაციენტების მასალაში ვირუსული ანტიგენების გამოსავლენად და სწრაფი დიაგნოზისთვის.
მეთოდს აქვს მგრძნობელობის უმაღლესი ხარისხი, ის წარმოადგენს ექსპრეს დიაგნოსტიკის საფუძველს და იძლევა ვირუსული ანტიგენების გამოვლენის საშუალებას რამდენიმე საათში.
MFA-ს მთავარი უპირატესობებია: შესრულების სიჩქარე, მაღალი სპეციფიკა (100%). მისი დახმარებით დაავადების დიაგნოსტირებაზე დახარჯული დრო ერთ დღეზე ნაკლებია. გამოიყენება საგარეო საქმეთა სამინისტროს პირდაპირი და არაპირდაპირი ვერსიები.
პირდაპირი იმუნოფლუორესცენციარჩება ცოფის დიაგნოსტიკის სასურველ მეთოდად. სლაიდები, რომლებიც შეიცავს ტვინის ქსოვილების ნაცხ-ანაბეჭდებს, ან ქსოვილის კულტურის მონოფენიანი სათვალეები ფიქსირდება აცეტონში 1-4 საათის განმავლობაში. შემდეგ პრეპარატები შრება და მუშავდება ფლუორესცენტური პოლიკლონური ანტი-ნუკლეოკაფსიდური ანტისხეულებით (იმუნოფლუორესცენტური რეაგენტი).
ეს რეაგენტი არის კონიუგატი, რომელიც მომზადებულია სპეციფიკური IgG კლასის პოლიკლონური ანტისხეულებისგან ვირუსის ნუკლეოკაფსიდური ანტიგენისა და ფლუორესცეინის იზოციანატის (FITC) მიმართ. სპეციფიკური ანტისხეულები მიიღება ცხოველების (კურდღლების, ზაზუნების ან ცხენების) ჰიპერიმუნიზაციით ვირუსის ნუკლეოკაფსიდური ეპიტოპების ნარევით.
დღეისათვის თაგვის მონოკლონური ანტისხეულები ცოფის ვირუსის ნუკლეოკაფსიდის მიმართ სულ უფრო ხშირად გამოიყენება ამ მიზნებისათვის. 37°C-ზე 30-წუთიანი ინკუბაციის შემდეგ სადიაგნოსტიკო პრეპარატები განმეორებით ირეცხება მარილიანი და გამოხდილი წყლით.
FITC-ით მარკირებული ანტისხეულები ფიქსირდება მხოლოდ ვირუსული ნუკლეოპროტეინების ანტიგენების ლოკალიზაციის ადგილებში. შემდეგ პრეპარატები აშრობენ ჰაერში და იკვლევენ სინათლის მიკროსკოპით ქსენონის ნათურის და შესაბამისი ფილტრის, როგორც სინათლის წყაროს გამოყენებით.
ზე არაპირდაპირი ვერსიაანტიგენი პირველად შერწყმულია შეუღებავ სპეციფიკურ იმუნურ შრატთან. შემდეგ, წარმოქმნილი არაფლუორესცენტული ანტიგენ-ანტისხეულის კომპლექსები ექვემდებარება ფტოროქრომით ეტიკეტირებულ იმუნურ შრატს, რომელიც შეიცავს ანტისხეულებს შრატის სპეციფიკური ცილების მიმართ. MFA-ს არაპირდაპირი ვერსია, ანტიგენის გამოვლენასთან ერთად, შესაძლებელს ხდის სატესტო შრატში ანტისხეულების რაოდენობრივ განსაზღვრას მისი სათანადო განზავების გზით.
FITC-ის მარკირებული წარმონაქმნები სხვადასხვა ქსოვილის უჯრედებში აღმოჩენილია, როგორც ყვითელ-მწვანე ფლუორესცენტური შეღებვა მუქ ფონზე (მრგვალი ან ოვალური ფორმის ინტრაციტოპლაზმური ჩანართების სახით).
დაკავშირებული იმუნოსორბენტული ანალიზი. მეთოდი ეფუძნება ცილის სორბციის პრინციპს მყარ ფაზაზე, რასაც მოჰყვება სუბსტრატ-ინდიკატორის ხსნარით გამოვლენილი ანტიგენ-ანტისხეულების კომპლექსების წარმოქმნა. ჭაბურღილებში დამატებული ანტიგენი სპეციალურად აკავშირებს ანტისხეულებს. სატესტო შრატები გამოიყენება ანტიგენის ფენაზე საჭირო განზავებით. მათში სპეციფიური ანტისხეულების არსებობისას ეს უკანასკნელი ანტიგენს უერთდება. შებოჭვის გამოსავლენად, ანტისხეულების ფენაზე გამოიყენება იმუნოგლობულინი ადამიანის შრატის გლობულინების წინააღმდეგ, რომელიც კონიუგირებულია ცხენის პეროქსიდაზასთან. სორბირებადი კონიუგატის რაოდენობა პროპორციულია ანტიგენთან შეკრული ადამიანის შრატის რაოდენობისა. ეს შეიძლება განისაზღვროს ინდიკატორის ხსნარის გამოყენებით (ორტოფენილილენდიამინი + წყალბადის ზეჟანგი), რომლის კომპონენტები კონიუგატ პეროქსიდაზას მოქმედების შედეგად სითხეს ყავისფერ-ყვითელ ფერს ღებავს. გაურკვეველი შემთხვევების გამოკვლევისას, ELISA-ს გამოყენება RP ან RSK მეთოდების გარდა, საშუალებას გაძლევთ გაზარდოთ ცოფის ლაბორატორიული დიაგნოზის სანდოობა, ამ მეთოდის მაღალი მგრძნობელობის გამო. მეთოდი საშუალებას იძლევა აღმოაჩინოს ინფექციური და დეფექტური ნაწილაკები.
ვაქცინაციის დროს ცოფის საწინააღმდეგო ანტისხეულების დასადგენად შეიძლება გამოყენებულ იქნას არაპირდაპირი ELISA მეთოდი, ანტიგენად გაწმენდილი ვირუსის გამოყენებით და ადამიანის შრატში IgG კლასის ანტისხეულების დასადგენად, სტაფილოკოკის A-პროტეინი, რომელიც ასოცირდება ცხენის პეროქსიდაზასთან. ELISA-ს შედეგები შედარებულია თაგვებში ვირუსის ნეიტრალიზაციის ტესტებში მიღებულ შედეგებთან. მეთოდი საშუალებას გაძლევთ გამოავლინოთ IgM-ის არსებობა იმუნიზაციის პროცესის დასაწყისში.
იმუნოფერმენტული მეთოდები ძალიან პერსპექტიულია ვირუსის ნუკლეოკაფსიდური ანტიგენის გამოსავლენად ტვინის ქსოვილებში სიკვდილის შემდგომი დიაგნოზის დროს. მათ შორის, მაგალითად, არის ცოფის დიაგნოსტიკის სწრაფი ELISA მეთოდი, რომელიც ეფუძნება IgG იზოტიპის ანტისხეულებით სენსიბილიზებული ფირფიტების მომზადებას პირველი სეროტიპის ნუკლეოკაფსიდის მიმართ, რომელიც განზავებულია კარბონატულ ბუფერში.
საცდელი მასალა ჰომოგენიზირებულია ბუფერულ ან კულტურულ გარემოში, გაწმენდილია ცენტრიფუგირებით, ემატება ჭებში და ინკუბირებულია თეფშებში. სპეციფიკური ანტისხეულებით დაფიქსირებული ნუკლეოკაფსიდური ანტიგენი იდენტიფიცირებულია პეროქსიდაზას კონიუგატის დამატებით სხვადასხვა სახეობის სპეციფიურობის ანტინუკლეოკაფსიდური ცოფის საწინააღმდეგო ანტისხეულებთან და ქრომოგენურ სუბსტრატთან. მეთოდის მგრძნობელობაა 0,8–1,0 ნგ/მლ.
ამ მეთოდს შეუძლია აღმოაჩინოს სხვადასხვა სეროტიპის ვირუსების ანტიგენები. ბიოტინით მარკირებული ნუკლეოკაფსიდის სპეციფიკური ანტისხეულების კონიუგატების გამოყენება ზრდის მეთოდის მგრძნობელობას 0,1-0,2 ნგ/მლ-მდე.
ნუკლეოკაფსიდური ანტიგენი წარმატებით არის გამოვლენილი ELISA-ით, მაგრამ მასალა, თუნდაც დაშლილი, არ უნდა დაფიქსირდეს ფორმალინით.
პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის მეთოდი. ცოფის ვირუსის სწრაფი დიაგნოსტიკისა და ლიზავირუსების იდენტიფიცირებისთვის ყველაზე მოსახერხებელი მეთოდია პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (PCR). PCR მეთოდი არის ყველაზე საიმედო და უსწრაფესი მეთოდი ვირიონის რნმ-ის იზოლირებისთვის ნებისმიერი ნიმუშიდან, რომელიც შეიცავს ვირუსს დაბალი კონცენტრაციით. მასთან ერთად შეგიძლიათ შექმნათ რნმ ვირუსის მრავალი ასლი. ეს მეთოდი გამოიყენება MFA-ს შედეგების დასადასტურებლად და ნერწყვში, კისრის და თავის უკანა თმის ფოლიკულებში ვირუსის გამოსავლენად.
PCR ეფუძნება ბუნებრივი დნმ-ის რეპლიკაციის პრინციპს. მეთოდის არსი არის განმეორებითი გამეორებავირუსისთვის სპეციფიური დნმ-ის თანმიმდევრობის სინთეზის (ამპლიფიკაციის) ციკლები თერმოსტაბილური Taq დნმ პოლიმერაზასა და ორი სპეციფიური პრაიმერის, ე.წ.
თითოეული ციკლი შედგება სამი ეტაპისგან განსხვავებული ტემპერატურის პირობებით. თითოეულ ციკლში, სინთეზირებული რეგიონის ასლების რაოდენობა გაორმაგდება. ახლად სინთეზირებული დნმ-ის ფრაგმენტები ემსახურება როგორც შაბლონს ახალი ძაფების სინთეზისთვის მომდევნო გაძლიერების ციკლში, რაც შესაძლებელს ხდის შერჩეული დნმ-ის რეგიონის საკმარისი რაოდენობის ასლების დაგროვებას 25-35 ციკლში მისი დასადგენად, ჩვეულებრივ, აგაროზის გელით. ელექტროფორეზი.
PCR-ის განსაკუთრებით მაღალი მგრძნობელობა N-გენის დამატებითი პრაიმერების გამოყენებისას, როდესაც შესაძლებელია ვირუსის რნმ-ის აღმოჩენა ნიმუშებში, რომლებიც შეიცავს ვირუსს 10 MLD50 ტიტრით. PCR მეთოდს შეუძლია აღმოაჩინოს ვირუსის რნმ დაშლილ პათოლოგიურ მასალაშიც კი.
ამჟამად შემუშავებულია დამადასტურებელი (დადასტურებული) ტესტები, როგორიცაა საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა PCR (RT-PCR), რომლებიც ფართოდ გამოიყენება პრაქტიკაში. RT-PCR მეთოდი ძალიან მგრძნობიარე და ეფექტურია. რნმ ამოღებულია ვირუსით ინფიცირებული ორგანოს ქსოვილებიდან, გადაიწერება cDNA-ში, რომელიც შემდეგ ძლიერდება PCR-ით. RT-PCR საჭიროებს პრაიმერებს, რომლებიც მიიღება ცოფის ვირუსის გენომის კონსერვატიული რეგიონებისთვის. როგორც წესი, გამოიყენება გენები, რომლებიც აკოდირებენ ნუკლეოპროტეინს ან N- პროტეინს.
PCR მეთოდი ძალიან სპეციფიკური და ძალიან მგრძნობიარეა. ერთ-ერთი ყველაზე ზუსტი ტესტებიცოფის ანტიგენის გამოვლენა შესაძლებელს ხდის ცოფის დიაგნოსტირებას მაშინაც კი, თუ მასალაში არის მინიმუმ ერთი ვირიონი. ტესტი ეფუძნება რნმ-ის შაბლონის დამატებით შევსებას, რომელიც ჩატარდა in vitro ფერმენტ RNA პოლიმერაზას გამოყენებით. ბოლო წლებში PCR სულ უფრო ხშირად გამოიყენება ვირუსული ინფექციების დიაგნოსტიკისა და მონიტორინგისთვის. თუმცა, ტექნიკა რთული, ძვირია და ჯერ არ არის საკმარისად ერთიანი რუტინული გამოყენებისთვის.
ციტოლოგიური მეთოდები ამჟამად შეზღუდულია დიაგნოსტიკური ღირებულება, მაგრამ მაინც უნდა იქნას გამოყენებული მთელი რიგი ინფექციების დროს. გაკვეთის მასალებს, ბიოფსიებს, ნაცხებს იკვლევენ, რომლებიც შესაბამისი დამუშავების შემდეგ ხდება შეღებვა და მიკროსკოპის ქვეშ ანალიზი. ცოფის დროს ეს არის უჯრედების ციტოპლაზმაში ჩანართების გამოვლენა (ბაბეს-ნეგრის სხეულები).
ვირუსის იზოლაცია. ვირუსის იზოლაცია შეიძლება საჭირო გახდეს ანტიგენის ტესტების შედეგების დასადასტურებლად და იზოლატების შემდგომი დახასიათებისთვის. და მიუხედავად იმისა, რომ ეს მეთოდი ერთ-ერთი უძველესი და შრომატევადი დიაგნოსტიკური მეთოდია, დღეს ვირუსის იზოლაცია შემდგომი იდენტიფიცირებით ერთ-ერთი თანამედროვე მეთოდით (ELISA მონოკლონური ანტისხეულებით ან PCR) ყველაზე საიმედო დიაგნოსტიკური მეთოდია, ე.წ. "ოქროს სტანდარტი".
ცოფის დიაგნოსტიკური მეთოდების ეფექტურობა შეიძლება განსხვავდებოდეს მრავალი ფაქტორის მიხედვით (დაავადების სტადია, მასალის აღების დრო, მიღებული ნიმუშების ხარისხი, შენახვის პირობები, პერსონალის გამოცდილება, რეაგენტების ხარისხი და ა.შ.). თუ დადებითი შედეგი ცოფს ადასტურებს, მაშინ უარყოფითი შედეგი ყოველთვის არ მიუთითებს დაავადების არარსებობაზე. ამიტომ, ცოფისთვის ჯანდაცვის მსოფლიო ორგანიზაციის ექსპერტები რეკომენდაციას უწევენ რამდენიმე ტესტის გამოყენებას, განსაკუთრებით MFA ბიოანალიზთან ერთად ახალშობილ (2-3 დღის) თეთრ თაგვებზე.
პირადი პრევენციის ღონისძიებები
ცოფის ვირუსის შემცველ მასალასთან, ასევე ცოფის ეჭვმიტანილ ცხოველებთან ყველა სამუშაო უნდა განხორციელდეს პირადი უსაფრთხოების ზომების დაცვით. სამედიცინო მუშაკებიხოლო ვეტერინარებმა უნდა იმუშაონ ხალათებით, ხელთათმანებით, ნიღბებით.
სამუშაოს დასასრულს ყუთები მუშავდება 3%-იანი წყალბადის ზეჟანგის ხსნარით.
ფლაკონები, ამპულები და ხელსაწყოები, ასევე ცოფის ვირუსის შემცველი დარჩენილი მასალები და სამუშაოს შემდეგ ყველა ჭურჭელი დეზინფექცია ხდება ავტოკლავირებით 1 საათის განმავლობაში 1,5 ატმზე (მკვლელობის რეჟიმი).
სახსრები პირადი დაცვადეზინფექცია ხდება ადუღებით ან ავტოკლავით. მაგიდის სამუშაო ზედაპირი და ხელები დეზინფექცია ხდება სადეზინფექციო ხსნარით (0,5% ქლორამინის ხსნარი).
ცოფი (R) არის თბილსისხლიანი ცხოველების მწვავე დაავადება, რომელიც ხასიათდება ცენტრალური ნერვული სისტემის დაზიანებით. ყველა სახის შინაური და გარეული ცხოველები, ისევე როგორც ადამიანები, მგრძნობიარეა.
დაავადება რეგისტრირებულია მსოფლიოს სხვადასხვა რეგიონში. ავსტრალიაში, დიდ ბრიტანეთში, იაპონიაში დაავადების გავრცელების შემთხვევები არ დაფიქსირებულა. დაავადება თითქმის ყოველთვის სიკვდილით მთავრდება. ფაქტიურად დადასტურებულია ცოფისგან გამოჯანმრთელების შემთხვევები ადამიანებში და ძაღლებში ექსპერიმენტული ინფექციის შემდეგ.
ცოფის ვირუსი (ცოფის ვირუსი) ეკუთვნის Rhabdoviridae-ს ოჯახს, Lyssavirus-ის გვარს. ახლა დადგინდა, რომ VB-ს აქვს 4 სეროტიპი, რაც, როგორც ჩანს, განპირობებულია მემბრანის ცილების შემადგენლობით. VB-ის ყველა ვარიანტი დაკავშირებულია იმუნობიოლოგიურად, მაგრამ განსხვავდება ვირულენტობით. WB-ს აქვს GA და GAD თვისებები. არსებობს ხაზოვანი კავშირი ინფექციურ და GA აქტივობას შორის. ცოფის წინააღმდეგ იმუნიზირებული ცხოველები აწარმოებენ VNA, KSA, antiHA და ლიზურ ანტისხეულებს (ვირუსით ინფიცირებულ უჯრედებს ანადგურებენ კომპლემენტის თანდასწრებით).
დიაგნოზს სვამენ ეპიდემიოლოგიური მონაცემების, დაავადების სიმპტომების, პათოლოგიური ცვლილებების (მათ ნაკლები მნიშვნელობის) და, ძირითადად, ლაბორატორიული გამოკვლევების შედეგების საფუძველზე.
ლაბორატორიული დიაგნოსტიკა მოიცავს ცხოველების ტვინის შესწავლას IF, RDP-ში ვირუსული AG-ის გამოსავლენად, ბაბეს-ნეგრის სხეულების გამოვლენას და ბიოანალიზს თეთრ თაგვებზე.
AT რუსეთის ფედერაციაამჟამად, IF-ში და RDP-ში B დიაგნოსტიკის კომპლექტების წარმოება ორგანიზებულია VNITIBP-სა და KazNIVI-ში.
ვირუსის იზოლაცია.მცირე ზომის ცხოველების ახალი ცხედრები იგზავნება ლაბორატორიაში კვლევისთვის, დიდი ცხოველებისგან - თავიდან ან ტვინიდან. ზოგიერთ შემთხვევაში ნებადართულია ტვინის კონსერვაცია 50%-იანი გლიცერინით. გვამი ან თავი ფრთხილად უნდა იყოს შეფუთული პლასტმასის ჩანთაში, ტვინი - ქილაში დაფქული მინის ან რეზინის საცობით, სავსე პარაფინით. მასალა შეფუთულია ტენიანობის საწინააღმდეგო კონტეინერში. მხოლოდ შეუნარჩუნებელი ტვინი არის შესაფერისი ვირუსოლოგიური კვლევებისთვის. უნდა გვახსოვდეს, რომ გაკვეთა, თავის ტვინის ამოღება და პათოლოგიური მასალით სხვა ოპერაციები უნდა ჩატარდეს სტერილობისა და პირადი პრევენციის ზომების მკაცრი დაცვით: მტკიცედ დააფიქსირეთ ცხოველის თავი, დაიცვათ ხელები 2 წყვილი ხელთათმანით ( ქირურგიული და ანატომიური), დაიდეთ სათვალეები თვალების დასაცავად, ხოლო ცხვირსა და პირზე - 6 ფენიანი გაზის სახვევი.
მასალის ლაბორატორიული კვლევაცოფი ტარდება თავის მხრივ; შედეგები დაუყოვნებლივ ეცნობება ფერმის ექიმს და რაიონის (ქალაქის) მთავარ ექიმს.
ვირუსის ჩვენება და იდენტიფიკაცია. კვლევის თანმიმდევრობა: მარცხენა და მარჯვენა მხარის თავის ტვინის თითოეული ნაწილიდან (ამონის რქა, ცერებრუმი, თავის ტვინის ქერქი და წაგრძელებული) ამზადებენ 4 ნაცხის ანაბეჭდს ბაბეშ-ნეგრის სხეულების გამოვლენისთვის; ტვინის ქსოვილთან ერთად დააყენა RDP; უარყოფითი შედეგებით მოთავსებულია ბიოანალიზი.
სპეციფიკური ინკლუზიური ორგანოების გამოვლენა. ანაბეჭდის ნაცხი იღებება გამყიდველების, მურომცევის ან სხვა მეთოდების მიხედვით. შეღებვის შემდეგ პრეპარატებს ათვალიერებენ მსუბუქი მიკროსკოპის ქვეშ ჩაძირვის სისტემით. კონკრეტული ბაბეშ-ნეგრის სხეულების არსებობა დადებით შედეგად ითვლება (სელერსის მიხედვით შეღებვისას - პროტოპლაზმაში მოვარდისფრო-წითელი ფერის მკაფიოდ გამოხატული ოვალური ან მოგრძო მარცვლოვანი წარმონაქმნები, მურომცევის მიხედვით შეღებვისას - ღია მეწამული ბაბეშის მუქი ლურჯი ჩანართებით. -ნეგრის სხეულები, უფრო ხშირად ისინი განლაგებულია ნერვული უჯრედების გარეთ.
ბაბეშ - ნეგრის სხეულების ყველაზე დამახასიათებელი თვისება მათი შინაგანი სტრუქტურაა, რაც მათ აბსოლუტურად ზუსტად დიფერენცირების საშუალებას იძლევა. შიგნიდან ჩანს წვრილი მარცვლები - მუქი ლურჯი, თუნდაც შავი ფერის ბაზოფილური მარცვლები, ზომით 0,2-0,5 მიკრონი.
საყოველთაოდ აღიარებულია ინკლუზიური ორგანოების გამოვლენის დიაგნოსტიკური მნიშვნელობა WB ინფექციის მტკიცებულებებისთვის. თუმცა, ჯანმრთელ ცხოველებში, განსაკუთრებით კატებსა და თეთრ თაგვებში, არის წარმონაქმნები, რომელთა არსებობამ შეიძლება გამოიწვიოს დიაგნოსტიკური სირთულეები. ზოგიერთ შემთხვევაში, კატის ტვინში შესაძლებელია ასეთი ჩანართების დამაჯერებლად დიფერენცირება ბაბეს-ნეგრის სხეულებისგან და აქ რეკომენდებულია იდენტიფიკაციის მეთოდების გამოყენება, განსაკუთრებით IF. ანალოგიურად, ძაღლებში, რომლებიც დაიღუპნენ გველის შხამით მოწამვლის ან დაზიანების შედეგად ელექტრო შოკი, შეიძლება მოიძებნოს ბაბეს-ნეგრის სხეულების მსგავსი ინკლუზიური სხეულები. ბაბეშ-ნეგრის სხეულები აღმოჩენილია ცოფის შემთხვევების მხოლოდ 65-85%-ში, ამიტომ მათი არარსებობა არ არის უარყოფითი პასუხი და მასალა გამოკვლეულია სხვა ტესტებში (IF, RDP, ბიოასეი).
თუ. B-ის დიაგნოსტიკის ერთ-ერთი მთავარი ტესტი. მაღალკვალიფიციური შესრულებით მიიღება 99-100% დამთხვევა ბიოანალიზის მეთოდთან. ჩვეულებრივ დიაგნოსტიკურ პრაქტიკაში გამოიყენება IF-ის პირდაპირი მეთოდი, რომელიც ტარდება ცოფის საწინააღმდეგო ფლუორესცენტური იგ-ის გამოყენებით. პრეპარატების ფიქსაცია გაცივებულ (8-10°C) აცეტონში ტარდება არანაკლებ 4 საათის განმავლობაში, ნეგატიურ კონტროლად გამოიყენება ჯანმრთელი თეთრი თაგვების ტვინის ნაცხი-ანაბეჭდები. შედეგები მხედველობაში მიიღება ვიზუალურად ფლუორესცენტურ მიკროსკოპში AG-AT კომპლექსის ნათების ინტენსივობის შეფასების საფუძველზე. AH VB გამოვლენილია კაშკაშა ყვითელ-მწვანე ან მწვანე გრანულების სახით სხვადასხვა ფორმებიდა მნიშვნელობები უჯრედებში (უფრო ხშირად უჯრედების გარეთ). დიაგნოზი დადასტურებულად ჩაითვლება, თუ საკმარისი რაოდენობის (მინიმუმ 10) ტიპიური გრანულები ნათელი მწვანე ელვარებით ან ბევრი წვრილი წერტილით არის აღმოჩენილი მხედველობის რამდენიმე ველში.საკონტროლოში ასეთი ბზინვარება არ უნდა იყოს.
AG-AT კომპლექსის ფლუორესცენციის სპეციფიკის დასამტკიცებლად გამოიყენება IF სუპრესიის მეთოდი, რომელიც შედგება ცოფის AG-ის უნარში, რომელიც დაკავშირებულია არაფლუორესცენტურ AT-ებთან, არ შეუთავსოს ფლუორესცენტურ სპეციფიკურ AT-ებს. ამისათვის, 5% ცოფის საწინააღმდეგო არაფლუორესცენტური Ig გამოიყენება კვლევის ტვინიდან მომზადებულ ფიქსირებულ პრეპარატებზე, ინკუბირებული 30 წუთის განმავლობაში 37°C-ზე ტენიან კამერაში, გარეცხილი ფიზიოლოგიური ხსნარით და შემდეგ შეღებილია ფლუორესცენტური ცოფის საწინააღმდეგოდ. Ig ჩვეულებრივი პირდაპირი მეთოდით. ამ გზით დამუშავებულ პრეპარატებში არ უნდა იყოს ფლუორესცენცია.
IF მეთოდი შესაძლებელს ხდის თვალის რქოვანას უჯრედებში WB გამოვლენას და წინასწარი დიაგნოზის დასმას in vivo: ცხოველების ავადმყოფობის დროს, აგრეთვე მის კლინიკურ გამოვლინებამდე 1-2 დღით ადრე ან მეტი. მეთოდი შეიძლება გამოყენებულ იქნას B დაავადებაზე ეჭვმიტანილი ცხოველების, ასევე კლინიკურად ჯანმრთელი ძაღლებისა და კატების შესასწავლად, რომლებსაც უკბინეს ადამიანები და ცხოველები. ამისთვის რქოვანას ანაბეჭდებს ამზადებენ, პირადი უსაფრთხოების ყველა წესის დაცვით, ცხოველის პალპებრული ნაპრალის გახსნით დიდი და საჩვენებელი თითებიდა ოდნავ ამობურცულ თვალის კაკლს დაჭერით შუშის სლაიდის ზედაპირით, ბოლოდან 0,5 სმ-ით უკან. აუცილებელია იმის უზრუნველყოფა, რომ ცხოველი არ ახამხამებს მესამე ქუთუთოს, რადგან ეპითელური უჯრედები ამოღებულია მინიდან და მიიღება უხარისხო ნაცხი. თითოეული თვალიდან კეთდება მინიმუმ 2 პრეპარატი, რომელიც შეიცავს 2 ანაბეჭდს. კონტროლისთვის, ჯანმრთელი ცხოველების რქოვანას ანაბეჭდები მზადდება ანალოგიურად. მათი მოხარშვა შესაძლებელია ფერმაში. ანაბეჭდები შრება ჰაერში, ფიქსირდება აცეტონში 4 საათის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე, შეფუთულია და იგზავნება ლაბორატორიაში. შეღებვის პრეპარატები, როგორც IF-ში, ზოგადად მიღებული მეთოდის მიხედვით.
ავადმყოფი ცხოველებისგან ან დაავადების ინკუბაციური პერიოდის ბოლოს მიღებულ პრეპარატებში, მრავალი ეპითელური უჯრედის ციტოპლაზმაში, სხვადასხვა ფორმებისხვადასხვა ზომის ნათელი მანათობელი გრანულები - მტვრის მსგავსი წერტილებიდან 2 მიკრონი და მეტი. მოპოვების მიზნით საიმედო შედეგებითითოეულ პრეპარატში გამოკვლეულია 50-100 უჯრედი, ჯამში კი ცხოველიდან სულ მცირე 200-400 უჯრედი. მიკროსკოპის შედეგები დადებითად ითვლება, თუ ცხოველის რქოვანას ანაბეჭდებში აღმოჩენილია 11% ან მეტი უჯრედი ლუმინესცენციის დამახასიათებელი კერით. გასათვალისწინებელია, რომ ჯანმრთელი ცხოველების პრეპარატებში (საკონტროლო), ავტოფლუორესცენციის გამო, შეიძლება არსებობდეს ცალკეული უჯრედები ფორმისა და ლუმინესცენციის მსგავსი კერებით.
მნიშვნელოვანია აღინიშნოს, რომ IF შესაძლებელს ხდის საბოლოო დიაგნოზზე პასუხის დაჩქარებას ბიოანალიზით, ვინაიდან B-ის დიაგნოზის დადგენა შესაძლებელია მხოლოდ თაგვების ტესტის მასალით ინფიცირებიდან მე-4-8 დღეს, და საინკუბაციო პერიოდითაგვების დაავადებამ შეიძლება 20 დღემდე მიაღწიოს. IF-ს შეუძლია WB აღმოაჩინოს ქვედა ყბის სანერწყვე ჯირკვლის ქსოვილებში. ნაცხი მზადდება ქვედა ყბის სანერწყვე ჯირკვლებიდან, იღებენ მასალას ჯირკვლის მინიმუმ 6 სხვადასხვა ნაწილიდან, ვინაიდან მასში ვირუსის განაწილება არათანაბარია. ხშირად ანაბეჭდის მისაღებად ძლიერი ზეწოლა გიწევთ, რადგან მუცინის სიმრავლის გამო მინაზე ცოტა მასალა რჩება.
ნაჩვენები იყო IF მეთოდით კანში VB-ის იდენტიფიცირების შესაძლებლობა, ამ მიზნით აღებულია სკალპის ნიმუშები, ასევე მჭიდის სენსორული და ტაქტილური თმის ფოლიკულები ან გვერდითი სენსორული პაპილები (ძაღლის ლოყაზე). ნიმუშები ინახება -20 ან -70°C ტემპერატურაზე. მათგან კეთდება კრიოსექცია, რომელსაც ამუშავებენ ფლუორესცენტური გლობულინით. IF ანალიზის შედეგები, რომლებიც მიღებულია კანში VB-ის იდენტიფიკაციის შედეგად, მაღალი ხარისხით შეესაბამება იმავე ცხოველის ტვინის შესწავლის შედეგად მიღებულ მონაცემებს. მჭიდრო კორელაცია აჩვენა AH ვირუსის გამოვლენას ტვინის ნიმუშებსა და ტუჩის ქსოვილებში IF მეთოდით.
RDP.იგი გამოიყენება AH VB-ის გამოსავლენად ცხოველთა არაკონსერვებულ ტვინში, რომლებიც დაიღუპნენ ქუჩის ცოფით, ან თაგვები, რომლებიც გამოიყენება ბიოანალიზში. RDP მოთავსებულია მიკრომეთოდით მინის სლაიდებზე 1-1,5% აგარის გელის გამოყენებით საყოველთაოდ მიღებული მეთოდის მიხედვით. დადებითი შედეგების ყველაზე მაღალი პროცენტი გამოვლინდა შემდეგი სტენლის გამოყენებისას: A - ამონის რქა ( Მარჯვენა მხარე); B - ცერებრალური ქერქი (მარჯვენა მხარე); C - cerebellum (მარჯვენა მხარე);
D - medulla oblongata (მარჯვენა მხარე); + (პლუს) - დადებითი კონტროლი; - (მინუს) - უარყოფითი კონტროლი; 1, 2, 3, 4 - ჭაბურღილები სპეციფიკური იმუნოგლობულინის განზავებით 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 შესაბამისად.
პინცეტის გამოყენებით ტვინის თითოეული ნაწილიდან ამზადებენ პასტისმაგვარ ერთგვაროვან მასას, რომელიც თავსდება შესაბამის ჭებში. თაგვებიდან მთელი ტვინი გამოკვლეულია. მარცხენა მხარის ტვინის უბნებიდან ანალოგიურად მზადდება AG (თითოეული გამოკვლევისთვის საჭიროა სულ 4 მინის სლაიდი აგარის გელით). რეაქცია მხედველობაში მიიღება 6, 24, 48 საათის შემდეგ, თუ AG და იმუნოგლობულინის შემცველ ჭებს შორის არის 1 ან 2-3 ნალექების ხაზი, რეაქცია ითვლება დადებითად.
RDP მარტივი შესასრულებელი და სპეციფიკურია, მაგრამ ვირუსული AG-ის გამოვლენის პროცენტი ტესტის მასალაში არის 45-70. დადებითი ბიოესეიით მიღებული თაგვების ტვინის შესწავლისას RDP ავლენს შემთხვევების 100%-მდე. ბაბეშ-ნეგრის სხეულების არარსებობა, სპეციფიკური ფლუორესცენცია და უარყოფითი RDP ტესტის მასალაში არ იძლევა ვირუსის არსებობის გამორიცხვის საფუძველს. ამ შემთხვევაში საბოლოო დიაგნოზი ეფუძნება თეთრ თაგვებზე ბიოანალიზის შედეგებს, რასაც მოჰყვება ვირუსის იდენტიფიკაცია.
ბიოანალიზი.ზოგადად მიღებულია, რომ ბიოანალიზი უფრო მეტია ეფექტური მეთოდივიდრე ბაბეშის ცხედრების - ნეგრის, IF-ის და ა.შ. აღმოჩენის შემთხვევაში. თუმცა, რიგ შემთხვევებში აღმოჩნდა უარყოფითი, მიუხედავად B-ის დიაგნოზის დადასტურებისა ინკლუზიური ორგანოებისა და IF-ის გამოვლენით. უარყოფითი ბიოანალიზის შედეგების პროცენტული მაჩვენებელი მერყეობდა 1.3-დან 12-მდე.
ინფორმაცია ბიოანალიზის განსხვავებული ეფექტურობის შესახებ შეიძლება აიხსნას მრავალი ფაქტორით: ექსპერიმენტული ცხოველის არჩევანი, მათი რაოდენობა ექსპერიმენტში, ინფექციის მეთოდი, მასალის შენახვის მეთოდი და პერიოდი ლაბორატორიაში შესვლამდე. ინფექციური ნაწილაკების არააქტიურ ნაწილაკებთან ჩარევის ფენომენი ასევე შეიძლება ითამაშოს როლი, თუ არასაკმარისად განზავებული მასალა გამოიყენება ინოკულაციისთვის.
ტვინში და სანერწყვე ჯირკვლებიცოფისგან დაღუპული მელა და სკუნკები, აღმოჩნდა ნივთიერება, რომელიც აფერხებს ვირუსის ინფექციას, რაც არ იძლევა ამ ცხოველებში დაავადების დიაგნოსტიკას თაგვების ინტრაცერებრალური ინფექციით. საცდელ მასალაში ინჰიბიტორული ნივთიერების არსებობა ხელს არ უშლის ვირუსული AG-ის გამოვლენას IF მეთოდით; სკუნებისა და მელაებისთვის ეს ყველაზე მგრძნობიარე დიაგნოსტიკური მეთოდია.
ყველა სახეობის ცხოველიდან (კურდღელი, ზღვის გოჭები, ზრდასრული თეთრი თაგვები და ზაზუნები), რომლებიც გამოიყენება ბიოანალიზისთვის, ძუძუთი თაგვები უპირატესობას ანიჭებს ბევრს, რადგან ისინი უფრო მგრძნობიარენი არიან VB-ის სხვადასხვა შტამების მიმართ და ნაკლებად სახიფათოა მათთან მუშაობა. სირიული ზაზუნები არ ჩამოუვარდებიან თაგვებს მგრძნობელობით, მაგრამ ისინი ნაკლებად ხელმისაწვდომია.
RSK.სპეციფიკური AH-ის გამოვლენა RSK-ში ცოფის დიაგნოსტიკაში გამოიყენება ნაკლებად ხშირად, ვიდრე სხვა მეთოდებს. AG მზადდება ტვინისგან, რომელიც გაგზავნილია კვლევისთვის. ამისათვის ტვინის ქსოვილი (განსაკუთრებით მდიდარია AG-ით, კომპლემენტთან შემაკავშირებელი, თალამუსისა და ტვინის ღეროს ნაჭრები) ტრიტურდება ვერონალურ ბუფერში 1:10 თანაფარდობით და ტოვებს ოთახის ტემპერატურაზე 1 საათის განმავლობაში, რის შემდეგაც სუსპენზია ხდება. ინაქტივირებულია 56°C-ზე 5 საათის განმავლობაში.ასეთი მკურნალობა კლავს ვირუსს და ხსნის თავის ტვინის ქსოვილის ანტიკომპლიმენტურობას სპეციფიკური ანტიგენის დაზიანების გარეშე. სუსპენზიის ცენტრიფუგირება ხდება 15 წუთის განმავლობაში 3500 წთ-1-ზე სუპერნატანტიდან, რომელიც წარმოადგენს მასალას AG-ის არსებობის შესამოწმებლად. .
ELISA. ELISA-ში ცოფისგან დაღუპული ცხოველების ტვინის უჯრედებში AG-ის სპეციფიკური შეღებვა გამოვლინდა როგორც ახლად აღებულ, გლიცეროლში შენახულ, ასევე გლიცეროლის გარეშე შენახულ ნიმუშებში 8-18 საათის განმავლობაში 20 ° C ტემპერატურაზე. ეს ტესტი შესაფერისია. ცოფის რუტინული დიაგნოზი ცხოველებში, AG WB-ის გამოვლენა ქსოვილის პარაფინის სექციებში პრეპარატების ფიქსაციის დროს 10% ფორმალინის ხსნარით pH 5.3 და შემდგომი დამუშავების პარაფინში ჩაშენებული პრეპარატების პეპსინით.
თაგვებში და უჯრედულ კულტურაში RN-ისგან განსხვავებით, ELISA შესაძლებელს ხდის ცხოველებში AT გამოვლენას რამდენიმე საათში, ELISA არის ყველაზე პერსპექტიული. ლაბორატორიული მეთოდი AT-ის გამოვლენა და თავად ვირუსის ჩვენება. ცოფის დიაგნოსტიკის ექსპრეს მეთოდი არის დაჭერის ტექნიკა და IF მეთოდი AH BB-ს გამოვლენისთვის. დადასტურებულია, რომ პარაფინიზებულ მონაკვეთებში AH VB-ის გამოვლენის მეთოდი პეროქსიდაზა-ანტიპეროქსიდაზას მეთოდით მნიშვნელოვნად აღემატება ELISA მეთოდს. 1987 წელს შეიქმნა ცოფის სწრაფი ფერმენტის იმუნოდიაგნოსტიკის ნაკრები (RREID), შესაფერისი ეპიდემიოლოგიური და ლაბორატორიული კვლევებისთვის.
ვარიანტის იდენტიფიკაცია mAT-ის გამოყენებით. WB გლიკოპროტეინებისადმი mAbs-ის დახმარებით შეირჩა AG ვარიანტები, რომელთა შორის გამოვლინდა ფენოტიპურად თერმოლაბილური (არავირუსული) ვარიანტები. mAbs-ის 2 ჯგუფის გამოყენებისას ნაჩვენები იყო, რომ განზავების შტამები განსხვავდება ც. დააფიქსირეთ (პასტერი), CVS, Flury HEP, ERA და "იხვის" შტამები AH დეტერმინანტებისთვის. 7 შტამის იზოლირებული პაციენტებისგან B ადამიანების გამოყენებით mAbs შესაძლებელი გახდა გარკვეული განსხვავებების იდენტიფიცირება მათსა და ვაქცინის შტამს შორის AH დეტერმინანტებთან მიმართებაში.
ზოგადად მიღებულია, რომ ველურ შტამებს შორის AT განსხვავებები შეიძლება გამოვლინდეს mAbs-ის გამოყენებით ნუკლეოკაფსიდის AT N-ის წინააღმდეგ, რომლებიც რეაგირებენ ვირუსით ინფიცირებული უჯრედების ციტოპლაზმურ ჩანართებთან; ანტი-გლიკოპროტეინი (G AG), რომელიც რეაგირებს ინფიცირებული უჯრედების მემბრანებთან, ასუფთავებს ამ უჯრედებს კომპლემენტის თანდასწრებით და ანეიტრალებს ვირუსს. ზედაპირული გლიკოპროტეინის WB-ს შესაძლო ცვალებადობასთან დაკავშირებით სხვადასხვა გეოგრაფიული რაიონებიდან, დამცავი AG იყო გამოყენებული რიბონუკლეოპროტეინი, რომელიც ხასიათდება AG სტრუქტურის კონსერვატიზმით. ამრიგად, არა მხოლოდ G პროტეინს, არამედ RNP VB-საც აქვს დამცავი აქტივობა.
სეროდიაგნოსტიკა და რეტროსპექტული დიაგნოზი. ეს მეთოდები არ არის დამახასიათებელი ცოფისთვის, რადგან ისინი გამოიყენება მხოლოდ ვაქცინაციის შემდგომი იმუნიტეტის შესამოწმებლად. ვაქცინაციის შემდგომი ანტისხეულების გამოსავლენად და ტიტრაციისთვის გამოიყენება pH, რომელიც დგინდება საყოველთაოდ მიღებული მეთოდით. ფიქსირებული WB გამოიყენება როგორც AG. RN BHK-21 უჯრედებზე უფრო მგრძნობიარე იყო ვიდრე არაპირდაპირი IF ვაქცინირებული მელაების შრატში AT-ის გამოვლენისას. გარდა ამისა, შემოთავაზებულია RTGA და ELISA.
RTGA.მას ჯერ არ ჰპოვა ფართო გამოყენება დიაგნოსტიკურ პრაქტიკაში სისხლის შრატში არასპეციფიკური ინჰიბიტორების არსებობის გამო, რომლებზეც WB ძალიან მგრძნობიარეა და რაც მთავარია, GA AG, რომლებიც არ ექვემდებარებოდნენ საკმარის გაწმენდას, ჰქონდა დაბალი მგრძნობელობა. HA AG WB-ის მოსამზადებლად შემოთავაზებულია ც. მოსკოვი გაიზარდა VNK-21 უჯრედულ კულტურაში საპონინით დამუშავების შემდეგ, რასაც მოჰყვა გაწმენდა და კონცენტრაცია. HA გამოყოფილია ვირიონის სხვა კომპონენტებისგან ულტრაცენტრიფუგაციით. მიღებულ პრეპარატს ჰქონდა გაწმენდის ხარისხი 99,92%, ჰქონდა მაღალი GA აქტივობა (1:128), კარგად შენარჩუნებული 1 თვის განმავლობაში pH 5-9-ზე.
RTGA-ს დაყენებამდე უნდა ჩატარდეს ბატის ერითროციტების ზომიერი 2-ჯერადი ტრიფსინიზაცია მათი სენსიბილიზაციისთვის. ტრიფსინირებული ერითროციტების 0,25%-იანი სუსპენზიის გამოყენებისას (სასურველია 107 უჯრედი 1 მლ-ზე), RTGA-ს მგრძნობელობა იზრდება 4-ჯერ. AG და შრატის გასაზავებლად გამოიყენება ბორატ-მარილის ხსნარი (pH 9) მსხვილფეხა რქოსანი შრატის ალბუმინის 0,4% დამატებით. ერითროციტების სუსპენზია მზადდება მარილიან ხსნარში მჟავე pH-ით, ისე, რომ ვირუსისა და შრატის ნარევთან შერწყმის შემდეგ, რომლის pH არის 9, საბოლოო pH დგინდება 6.2-ის ფარგლებში. ჭაბურღილებში ერითროციტების სუსპენზიის დამატების შემდეგ, პანელი შეირყევა, ილუქება გამჭვირვალე ფილმით და მოთავსებულია ყინულზე. RTHA-ს შედეგები მხედველობაში მიიღება 40-50 წუთის შემდეგ, ხოლო 2 დღის ქათმების ან რეზუს მაიმუნების ერითროციტებთან - 1-1,5 საათის შემდეგ.
შემუშავებულია რადიოიმუნოანალიზი, რომელიც დაფუძნებულია AT-ის უნარზე, დაუკავშირდეს ეტიკეტირებულ 125 1-AG WB-ს. ეტიკეტირებული IgG, რომელიც იზოლირებულია ცოფის საწინააღმდეგო ჰიპერიმუნური შრატიდან, შეიძლება გამოყენებულ იქნას WB AG-ის გამოსავლენად მყარი ფაზის RIA-ით. საუკეთესო შედეგები მიღწეული იქნა ფოსფატ-მარილის ხსნარის გამოყენებით (pH 6.0) იონური სიძლიერით 0.01 M და ეტიკეტირებული IgG აქტივობით 200-250 ათასი პულსი / წთ.
მყარი ფაზის კონკურენტული RIA გამოიყენება შრატში და ჰიბრიდომის სუპერნატანტებში ცოფის ანტისხეულების გამოსავლენად.
დიფერენციალური დიაგნოზი. აუცილებელია აუჟესკის დაავადების გამორიცხვა, რომლის დროსაც ავადმყოფი ცხოველები არ არიან აგრესიულები, არ არის მადის გაუკუღმართება. ძაღლებში ჭირის ნერვული ფორმა გამორიცხულია. ცოფი ეჭვმიტანილია ცხენის ინფექციურ ენცეფალომიელიტში. ლაბორატორიული ტესტების კომპლექსი საშუალებას გაძლევთ დაისვას ცოფის ზუსტი დიაგნოზი. შესთავაზა ახალი მეთოდი VB-ის სხვადასხვა შტამების დიფერენციაცია N გენის სეგმენტის PCR-ში ამპლიფიკაციის პროდუქტების შემზღუდავი გაყოფის საფუძველზე.
სტანდარტიზაციის სახელმწიფოთაშორისი საბჭო. მეტროლოგია და სერტიფიკაცია
სტანდარტიზაციის სახელმწიფოთაშორისი საბჭო. მეტროლოგია და სერტიფიკაცია
სახელმწიფოთაშორისი
სტანდარტი
ცხოველები
ოფიციალური გამოცემა
Სტანდარტული ფორმა
წინასიტყვაობა
სახელმწიფოთაშორისი სტანდარტიზაციის სამუშაოების განხორციელების მიზნები, ძირითადი პრინციპები და ძირითადი პროცედურა დადგენილია GOST 1.0 - 92 „სახელმწიფოთაშორისი სტანდარტიზაციის სისტემით. დებულებების საფუძვლები“ და GOST 1.2-2009 „სახელმწიფოთაშორისი სტანდარტიზაციის სისტემა. სახელმწიფოთაშორისი სტანდარტები. სახელმწიფოთაშორისი სტანდარტიზაციის წესები და რეკომენდაციები. განვითარების წესები. მიღება, განაცხადი, განახლება და გაუქმება"
სტანდარტის შესახებ
1 შემუშავებულია ფედერალური სახელმწიფოს მიერ საბიუჯეტო დაწესებულება„ყოველრუსული სახელმწიფო ცენტრიხარისხი და სტანდარტიზაცია წამლებიცხოველებისა და საკვებისთვის" (FGBU "VGNKI")
2 შემოღებული რუსეთის ფედერაციის ტექნიკური რეგულირებისა და მეტროლოგიის ფედერალური სააგენტოს მიერ
3 მიღებულია სტანდარტიზაციის, მეტროლოგიისა და სერტიფიცირების სახელმწიფოთაშორისი საბჭოს მიერ (2013 წლის 27 ივნისის ოქმი No. 57-P)
|
ქვეყნის მოკლე სახელი MK (ISO 3166) 004-97 მიხედვით |
ქვეყნის კოდი MK (ISO 3166) 004-97 |
ეროვნული სტანდარტების ორგანოს შემოკლებული სახელწოდება |
|
სომხეთის რესპუბლიკის ეკონომიკის სამინისტრო |
||
|
ბელორუსია |
ბელორუსის რესპუბლიკის სახელმწიფო სტანდარტი |
|
|
ყირგიზეთი |
ყირგიზეთის სტანდარტი |
|
|
მოლდოვა-სტანდარტი |
||
|
გოსტანდარტი |
||
|
უზბეკეთი |
უზგანდარტ |
4 ტექნიკური რეგულირებისა და მეტროლოგიის ფედერალური სააგენტოს 2013 წლის 30 სექტემბრის No1127-ს ბრძანებით, 2015 წლის 1 იანვრიდან ამოქმედდა სახელმწიფოთაშორისი სტანდარტი GOST 26075-2013, როგორც რუსეთის ფედერაციის ეროვნული სტანდარტი.
5 GOST 26075-54-ის ნაცვლად
ინფორმაცია ამ სტანდარტის ცვლილებების შესახებ ქვეყნდება ყოველწლიურად გამოქვეყნებულ საინფორმაციო ინდექსში „ეროვნული სტანდარტები“, ხოლო ცვლილებებისა და დამატებების ტექსტი – ყოველთვიურად გამოქვეყნებულ საინფორმაციო ინდექსში „ეროვნული სტანდარტები“. ამ სტანდარტის გადასინჯვის (ჩანაცვლების) ან გაუქმების შემთხვევაში, შესაბამისი შეტყობინება გამოქვეყნდება ყოველთვიურად გამოქვეყნებულ საინფორმაციო ინდექსში „ეროვნული სტანდარტები“. შესაბამისი ინფორმაცია, შეტყობინება და ტექსტები ასევე განთავსებულია საჯარო ინფორმაციის სისტემაში - ტექნიკური რეგულირებისა და მეტროლოგიის ფედერალური სააგენტოს ოფიციალურ ვებგვერდზე ინტერნეტში.
© Standartinform, 2014 წ
რუსეთის ფედერაციაში ამ სტანდარტის სრულად ან ნაწილობრივ რეპროდუცირება შეუძლებელია. გაიმეორა და გავრცელდა როგორც ოფიციალური პუბლიკაცია ტექნიკური რეგულირებისა და მეტროლოგიის ფედერალური სააგენტოს ნებართვის გარეშე
სახელმწიფოთაშორისი სტანდარტი
ცხოველები
ცოფის ლაბორატორიული დიაგნოსტიკის მეთოდები
ცოფის ლაბორატორიული დიაგნოსტიკის მეთოდები
შესავალი თარიღი - 2015 - 01 - 01
1 გამოყენების სფერო
ეს სტანდარტი ვრცელდება ძუძუმწოვრების ყველა სახეობაზე და ადგენს ცოფის ლაბორატორიული დიაგნოსტიკის შემდეგ მეთოდებს:
ფლუორესცენტური ანტისხეულების მეთოდი (MFA);
ცოფის ვირუსის გამოყოფის მეთოდი თაგვის ნეირობლასტომის CCL-131 (ან ვირთხის გასერის კვანძის ნეირინომა - NGUK-1) უჯრედულ კულტურაში;
ბიოანალიზი თეთრ თაგვებზე:
ფერმენტთან დაკავშირებული იმუნოსორბენტული ანალიზის მეთოდი (ELISA);
დიფუზიური ნალექების რეაქცია (RDP).
შენიშვნები
1 ეს მეთოდები გამოიყენება Lyssavwus გვარის ყველა წარმომადგენლისთვის.
2 ქუჩის ცოფის ვირუსი მიეკუთვნება პათოგენურობის II კლასის მიკროორგანიზმებს (ის ადამიანისა და ცხოველისთვის სასიკვდილო საფრთხეს წარმოადგენს).
3 აუცილებლობის შემთხვევაში, ცოფის ვირუსის გენოტიპირება მზად არის ტესტის სისტემებიგამოიყენება საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის (RT-PCR) მეთოდი.
2 ნორმატიული მითითება
ეს სტანდარტი იყენებს ნორმატიულ მითითებებს შემდეგ სტანდარტებზე:
GOST ISO/IEC 17025 - 2009 წ Ძირითადი მოთხოვნებიტესტირებისა და კალიბრაციის ლაბორატორიების კომპეტენციას
GOST 12.0.004 - 90 შრომის უსაფრთხოების სტანდარტების სისტემა. შრომის უსაფრთხოების ტრენინგის ორგანიზება. ზოგადი დებულებები
GOST 12.1.005-68 შრომის უსაფრთხოების სტანდარტების სისტემა. ზოგადი სანიტარული და ჰიგიენური მოთხოვნები სამუშაო ადგილის ჰაერისთვის
GOST 12.1.008 - 76 შრომის უსაფრთხოების სტანდარტების სისტემა. ბიოლოგიური უსაფრთხოება. Ძირითადი მოთხოვნები
GOST 12.4.011 - 89 შრომის უსაფრთხოების სტანდარტების სისტემა. მუშაკთა დაცვის საშუალებები. ზოგადი მოთხოვნები და კლასიფიკაცია
GOST 17.0.0.01 - 76 სტანდარტების სისტემა ბუნების დაცვისა და ბუნებრივი რესურსების გამოყენების გაუმჯობესების სფეროში. ძირითადი დებულებები
GOST 177-88 წყალბადის ზეჟანგი. სპეციფიკაციები GOST 2603 - 79 რეაგენტები. აცეტონი. სპეციფიკაციები GOST 2768 - 84 ტექნიკური აცეტონი. სპეციფიკაციები GOST 4204 - 77 რეაგენტები. Გოგირდის მჟავა. სპეციფიკაციები GOST 6709 - 72 გამოხდილი წყალი. სპეციფიკაციები.
GOST ISO 7218 - 2011 მიკრობიოლოგია საკვები პროდუქტებიდა ცხოველების საკვები. ზოგადი მოთხოვნები და რეკომენდაციები მიკრობიოლოგიური კვლევებისთვის
GOST 8074 - 82 ინსტრუმენტული მიკროსკოპები. ტიპები, ძირითადი პარამეტრები და ზომები. Ტექნიკური მოთხოვნები.
GOST 9147 - 80 ლაბორატორიული ფაიფურის მინის ჭურჭელი და აღჭურვილობა. სპეციფიკაციები GOST 9284-75 მიკროსკოპის სლაიდები. სპეციფიკაციები GOST 12026 - 76 ლაბორატორიული ფილტრის ქაღალდი. სპეციფიკაციები GOST 13739-78 ჩაძირვის ზეთი მიკროსკოპისთვის. Ტექნიკური მოთხოვნები. ტესტის მეთოდები
GOST 16317-87 საყოფაცხოვრებო ელექტრო სამაცივრო მოწყობილობები. ზოგადი სპეციფიკაციები
GOST 21241-69 სამედიცინო პინცეტი. ზოგადი სპეციფიკაციები.
GOST 22967 - 90 სამედიცინო საინექციო შპრიცები მრავალჯერადი გამოყენებადი. ზოგადი ტექნიკური მოთხოვნები და ტესტის მეთოდები
GOST 24661 - 91 (ISO 7866 84) ერთჯერადი საინექციო შპრიცები
GOST 25046 - 81 (ISO 7864-81) ერთჯერადი საინექციო ნემსები. ძირითადი ზომები. Ტექნიკური მოთხოვნები. ტესტის მეთოდები
GOST 25336 - 82 ლაბორატორიული მინის ჭურჭელი და აღჭურვილობა. ტიპები, ძირითადი პარამეტრები და ზომები
GOST 29230 - 91 (ISO 835-4-81) ლაბორატორიული მინის ჭურჭელი. პიპეტებმა დაამთავრა. ნაწილი 4. პიპეტების აფეთქება
შენიშვნა - ამ სტანდარტის გამოყენებისას მიზანშეწონილია შეამოწმოთ საცნობარო სტანდარტების მოქმედება საჯარო ინფორმაციის სისტემაში - ტექნიკური რეგულირებისა და მეტროლოგიის ფედერალური სააგენტოს ოფიციალურ ვებსაიტზე ინტერნეტში ან წლიური ინფორმაციის ინდექსის "ეროვნული სტანდარტების" მიხედვით. , რომელიც გამოქვეყნდა მიმდინარე წლის 1 იანვრის მდგომარეობით და აი, მიმდინარე წლის ყოველთვიური საინფორმაციო ინდექსის „ეროვნული სტანდარტების“ ნომრები. თუ საცნობარო სტანდარტი შეიცვალა (შეცვლილია), მაშინ ამ სტანდარტის გამოყენებისას უნდა იხელმძღვანელოთ შემცვლელი (შეცვლილი) სტანდარტით. თუ მითითებული სტანდარტი გაუქმებულია ჩანაცვლების გარეშე, დებულება, რომელშიც მითითებულია მასზე მითითება, მოქმედებს იმ ზომით, რომ ეს მითითება არ იმოქმედებს.
3 ტერმინები, განმარტებები და აბრევიატურები
3.1 ამ სტანდარტში გამოყენებულია შემდეგი ტერმინები მათი შესაბამისი განმარტებებით:
3.1.1 ადამიანებისა და ცხოველების ცოფის ინფექციური დაავადება გამოწვეული ლისავირუსის (რაბდოვირუსის) გვარის Rhabdoviridae ოჯახის წევრების მიერ, რაც იწვევს ლეტალური შედეგი 100% შემთხვევაში.
3.1.2 ცოფის ვირუსი: პათოგენი ინფექციური დაავადებაადამიანი და ცხოველები.
3.1.3 ცოფის ვირუსის ანტიგენის ზედაპირული ცილოვანი სტრუქტურები ცოფის ვირუსის, რომლის წინააღმდეგაც წარმოიქმნება ანტისხეულები.
3.1.2. .
3.1.3 ცოფის ვირუსის გამოყოფის მეთოდი თაგვის ნეირობლასტომის CCL-131 უჯრედულ კულტურაში (ან ვირთხის გასერის განგლიონის ნეირინომა - NGUK-1): ცოფის ვირუსის ანტიგენის იზოლაციის მეთოდი. ვირუსის უჯრედულ კულტურაში გამრავლებისა და ფლუორესცენტური ანტისხეულების მეთოდით მისი იდენტიფიკაციის საფუძველზე.
3.1.3 ბიოანალიზი: ცოფის ვირუსის იზოლირების მეთოდი თეთრ თაგვებში პათოლოგიური მასალის სუსპენზიის ინექციით, რასაც მოჰყვება ვირუსის იდენტიფიკაცია ფლუორესცენტური ანტისხეულების მეთოდით.
3.1.4 ფერმენტთან დაკავშირებული იმუნოსორბენტული ანალიზის (ELISA) მეთოდი ცოფის ვირუსის ანტიგენის გამოსავლენად მისი სპეციფიკური ურთიერთქმედების საფუძველზე ცოფის საწინააღმდეგო ანტისხეულთან, რომელიც იმობილირდება მყარ მატარებელზე, რასაც მოჰყვება შეკრული ანტიგენის გამოვლენა მეორე ფერმენტით მარკირებული ანტისხეულის გამოყენებით რეაქციის პროდუქტის ქრომოგენით შეღებვით.
3.1.5 დიფუზიური ნალექის ტესტი (RDP): ცოფის ვირუსის გამოვლენის მეთოდი, რომელიც დაფუძნებულია ანტისხეულების და ცოფის ვირუსული ანტიგენის უნარზე, გავრცელდეს აგარის გელში და, სპეციფიური ურთიერთქმედებისას, შექმნას ანტიგენ-ანტისხეულის კომპლექსი, რომელიც ჩანს შიშველისთვის. თვალი ნალექის ხაზის სახით.
3.1.6 საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის (RT-PCR) მეთოდი ცოფის ვირუსის გენომის გამოსავლენად ვირუსის სპეციფიკური რნმ-ის თანმიმდევრობის დნმ-ში გადათარგმნით, რასაც მოჰყვება მიღებული დნმ-ის განმეორებითი კოპირება და რეაქციის პროდუქტების გამოვლენა, განხორციელებული in vitro .
3.2 ამ სტანდარტში გამოყენებულია შემდეგი აბრევიატურები:
FAG - ფლუორესცენტური ცოფის საწინააღმდეგო იმუნოგლობულინი;
ANG - ცოფის საწინააღმდეგო გლობულინი;
CFG - საკონტროლო ფლუორესცენტური გლობულინი;
PBS - ფოსფატის ბუფერული ხსნარი;
NGUK-1-ნეირინომა ვირთხის გასერის კვანძი;
FITC - ფლუორესცეინის იზოთიოცინატი:
რნმ - რიბონუკლეინის მჟავა:
დნმ - დეზოქსირიბონუკლეინის მჟავა:
CCN31 - თაგვის ნეირობლასტომის უჯრედების კულტურა:
OFD - ორთოფენილდიამინი;
TMB - ტეტრამეთილბენზიდინი.
4 კვლევის პირობები და უსაფრთხოების მოთხოვნები
4.1 კვლევის პირობები
4.1.1 ზოგადი მოთხოვნები მიკრობიოლოგიური ანალიზისა და I - II პათოგენურობის ჯგუფების მიკროორგანიზმებთან მუშაობისთვის - GOST ISO 7218-ის მიხედვით.
4.1.2 ზოგადი მოთხოვნები შენობებისთვის - GOST ISO 7218-ის მიხედვით.
4.1.3 მოთხოვნები პერსონალისთვის - GOST ISO 7218, GOST ISO / IEC 17025. (1) მიხედვით.
კვლევის ჩატარების უფლება ეძლევათ I-II პათოგენურობის ჯგუფების მიკროორგანიზმებთან მუშაობის გამოცდილების მქონე კვალიფიციურ თანამშრომლებს, რომლებმაც შეისწავლეს მიკრობიოლოგიური მუშაობის მეთოდები. ცოფის საწინააღმდეგო ვაქცინირებული.
4.2 უსაფრთხოების მოთხოვნები
4.2.1 უსაფრთხოების ზოგადი მოთხოვნები სამუშაოსთვის GOST 12.1.008 შესაბამისად.
4.2.2 მუშაკთა დამცავი აღჭურვილობა უნდა შეესაბამებოდეს GOST 12.4.011 მოთხოვნებს.
4.2.3 სამუშაო ადგილის ჰაერი უნდა შეესაბამებოდეს GOST 12.1.005 მოთხოვნებს.
4.2.4 შრომის უსაფრთხოების პერსონალის მომზადება GOST 12.0.004 შესაბამისად.
4.2.5 კვლევისთვის მოპოვებული მასალის, აგრეთვე გამოყენებული პირადი დამცავი საშუალებების, ხელსაწყოების და ა.შ. ხორციელდება 30 წუთის განმავლობაში ადუღებით ან 15 წუთის განმავლობაში ავტოკლავირებით (0,11 ± 0,20) მპა წნევით.
5 საზომი ხელსაწყოები, აღჭურვილობა, მასალები, რეაგენტები და ცხოველები
5.1 კვლევისთვის გამოიყენეთ:
სკანირების სპექტროფოტომეტრი ტალღის სიგრძის სპექტრული დიაპაზონით 190-დან 1100 ნმ-მდე შეცდომით არაუმეტეს ± 0,5 ნმ და ოპტიკური სიმკვრივის (OD) გაზომვების დიაპაზონი 0,1-დან 3,0-მდე;
ფირფიტები იმუნოლოგიური რეაქციებისთვის 96-ჭაო:
თერმოსტატი, რომელიც ინარჩუნებს ტემპერატურას 20"-დან 50°C-მდე:
საყოფაცხოვრებო მაცივარი, რომელიც უზრუნველყოფს ტემპერატურის შენარჩუნებას 0 ° C-დან 10 ° C-მდე GOST 16317-ის მიხედვით:
ლაბორატორიული ცენტრიფუგა;
წყლის აბაზანა;
ინვერსიული ლუმინესცენტური მიკროსკოპი GOST 8074-ის მიხედვით:
ფაიფურის ნაღმტყორცნები ნაღმტყორცნებით GOST 9147-ით ან ჰომოგენიზატორით GOST ISO/IEC 17025-ის მიხედვით;
სლაიდები GOST 9284-ის მიხედვით:
შუშის საცდელი მილები GOST 25336-ის მიხედვით;
პეტრის კერძები GOST 25336 მიხედვით;
კუვეტი GOST 25336 მიხედვით;
პიპეტები ტევადობით 1.0; 2.0 და 10.0 სმ 3 GOST 29230-ის მიხედვით;
ავტომატური პიპეტები 0,05-დან 0,20 სმ 3-მდე ტევადობით რჩევებით:
სამედიცინო პინცეტი GOST 21241 მიხედვით:
ინსულინის შპრიცები 1.0 სმ 3 მოცულობით GOST 22967 ან GOST 24861 მიხედვით;
საინექციო ნემსები GOST 25046 მიხედვით:
კულტურის სათვალე რვა ხვრელისთვის;
გალიები თაგვების შესანახად;
აცეტონი GOST 2603 ან GOST 2768 მიხედვით;
ფლუორესცენტური ცოფის საწინააღმდეგო იმუნოგლობულინი (FAG);
ცოფის საწინააღმდეგო გლობულინი (AnG);
საკონტროლო ფლუორესცენტური გლობულინი (CFG);
ფლუორესცენტური ჩაძირვის ზეთი GOST 13739-ის მიხედვით;
გამოხდილი წყალი GOST 6709-ის მიხედვით;
ფოსფატის ბუფერული ხსნარი მოლური კონცენტრაციით 0,01 მოლ/დმ 3 (PBS). pH 7,2 - 7,4;
- სტერილური ნატრიუმის ქლორიდის ხსნარი 0,9% იზოტონური:
თაგვის ნეირობლასტომის CC31 ან ვირთხის გასერის კვანძის არაერინომა უჯრედული კულტურა -
პენიცილინი;
სტრეპტომიცინი;
საშუალო ნემსის MEM ამინომჟავების და ვიტამინების ორმაგი კომპლექტით (DMEM), pH 7.2;
ტრიფსინის ხსნარი 0,25%;
მსხვილფეხა პირუტყვის ემბრიონის სისხლის შრატი უჯრედული კულტურებისთვის 10%;
გლუტამინი 3%;
წყალბადის ზეჟანგი 3% GOST 177-ის მიხედვით;
ELISA-ს მიერ ცხოველთა ცოფის ლაბორატორიული დიაგნოსტიკის პრეპარატების ნაკრები;
გოგირდმჟავას ხსნარი მოლური კონცენტრაციით 2 მოლ/დმ 3 GOST 4204-ის მიხედვით;
ფილტრის ქაღალდი GOST 12026-ის მიხედვით;
შტამპი ჭაბურღილების დასამზადებლად;
მერტიოლატი;
აგარი "დიფკო" ან მსგავსი;
მეთილის ფორთოხლის ხსნარი 1% 50% ეთანოლში:
ანტიგენები დადებითი და უარყოფითი;
ცოფის საწინააღმდეგო შრატი ან იმუნოგლობულინი;
კლინიკურად ჯანმრთელი თეთრი თაგვები წონით 6-8 გ.
5.2 ნებადართულია სხვა საზომი ხელსაწყოების გამოყენება მეტროლოგიური მახასიათებლებით და აღჭურვილობით ტექნიკური მახასიათებლებით არანაკლებ უარესი, აგრეთვე რეაგენტები და მასალები არანაკლებ ზემოაღნიშნულზე დაბალი ხარისხის. დასაშვებია ერთჯერადი ჭურჭელი.
6 სინჯის აღება
6.1 ცოფის ვირუსის არსებობის შესახებ კვლევის ჩასატარებლად ლაბორატორიაში იგზავნება პათოლოგიური მასალა - ახალი გვამი ან პატარა ცხოველების თავი, დიდი ცხოველების თავი ან ტვინი.
6.2 კვლევისთვის შერჩეული პათოლოგიური მასალა იფუთება ტენიან ჭურჭელში და მიეწოდება ლაბორატორიას ლითონის კონტეინერებში. გაყინული მასალა მოთავსებულია კრიოკონტეინერში.
6.3 პათოლოგიურ მასალას თან ერთვის შემდეგი მონაცემების შემცველი დოკუმენტი; გამომგზავნის სახელი და მისამართი, ცხოველის ტიპი, ანამნეზური და კლინიკური და ელიოტოლოგიური მონაცემები.
6.4 ლაბორატორიული კვლევები ტარდება დაუყოვნებლივ პათოლოგიური მასალის მიღებისთანავე.
6.5 კვლევისთვის, ტვინის თითოეული ნაწილის ქსოვილის ნაჭრები (ამონის რქები, ცერებრელი, ცერებრალური ქერქი, მედულა წაგრძელებული) 0.5 - 1.0 სმ ზომის იღებენ მსხვილ ცხოველებს. პატარა ცხოველების, როგორიცაა თაგვების ტვინი გამოკვლეულია როგორც მთელი.
მხოლოდ ახალი ან ახლად გაყინული ტვინის ქსოვილის ნიმუშები შესაფერისია MFA-ს შესასწავლად და ცოფის ვირუსის იზოლირების მეთოდით თაგვის ნეირობლასტომის CCL-131 (ან NGUK-1) უჯრედულ კულტურაში. ცხოველის ტვინის ნიმუშები, რომლებიც იშლება (დაშლის სტადიაში), შენარჩუნებულია გლიცერინით, ფიქსირდება მეთილის სპირტით, ფორმალინით ან სხვა საშუალებებით, რომლებიც ხელს უწყობენ არასპეციფიკური ფლუორესცენციის წარმოქმნას, დაუშვებელია კვლევისთვის.
ბიოანალიზის დასაყენებლად ნებადართულია ტვინის ნიმუშების გამოყენება, რომლებიც დაცულია 30%-50% * გლიცეროლის ხსნარში. სხვა კონსერვანტების გამოყენება დაუშვებელია. შესანარჩუნებლად, პათოლოგიური მასალის გაყინვა შესაძლებელია არაუმეტეს მინუს 10 C ტემპერატურაზე.
7 ფლუორესცენტური ანტისხეულების მეთოდი (MFA)
7.1 მეთოდის არსი
ფლუორესცენტური ანტისხეულების მეთოდის არსი მდგომარეობს ფლუორესცენტური ცოფის საწინააღმდეგო ანტისხეულების სპეციფიკურ ურთიერთქმედებაში ცოფის ვირუსის ჰომოლოგიურ ანტიგენთან. შედეგად მიღებული ანტიგენ-ანტისხეულის კომპლექსი ეტიკეტირებულია FITC-ით. ვიზუალურად გამოვლენილია მხედველობის ველში დამახასიათებელი ბზინვარებით, ფლუორესცენტური მიკროსკოპის ქვეშ დათვალიერებისას.
7.2 მომზადება კვლევისთვის
7.2.1 ნიმუშის მომზადება
7.2.1.1 თავის ტვინის თითოეული ნაწილიდან სულ მცირე სამი პრეპარატი (ანაბეჭდი ან ნაცხი) მზადდება 6.5-ის მიხედვით შერჩეული ქსოვილის ნაჭრებისგან, საგულდაგულოდ გაცხიმებულ მინის სლაიდებზე. თუ პათოლოგიური მასალის მდგომარეობა საშუალებას იძლევა, მაშინ ამზადებენ ანაბეჭდებს, სხვა შემთხვევაში კეთდება ნაცხი.
7.2.1.2 ანაბეჭდების მომზადება
6.5-ის მიხედვით შერჩეული ქსოვილის ნაჭრები. დადეთ ოთხ-ექვს ფენად დაკეცილ ფილტრის ქაღალდზე. პატარა ცხოველების ტვინი იჭრება, იჭერს მის ყველა განყოფილებას და ათავსებს მას ამოჭრილი გვერდით ოთხ-ექვს ფენად დაკეცილ ფილტრის ქაღალდზე. მოჭრილ ზედაპირს აკარებენ შუშის სლაიდს, ოდნავ აჭერენ მას მინაზე თხელი ანაბეჭდის მიღებამდე.
7.2.1.3 ნაცხის მომზადება
ქსოვილის ნაჭერი ტვინის თითოეული ნაწილიდან (პატარა ცხოველებში მთელი ტვინი), შერჩეული 6.5-ის მიხედვით. შეიზილეთ ფაიფურის ნაღმტყორცნებით, სანამ ერთგვაროვანი მასა არ წარმოიქმნება, საიდანაც შუშის სლაიდებზე კეთდება ნაცხი.
7.2.1.4 როგორც კონტროლი, ნაცხი ან ანაბეჭდები კეთდება ჯანმრთელი, ცოფისგან თავისუფალი და არავაქცინირებული თეთრი თაგვების ტვინიდან, როგორც აღწერილია 7.3.1.2 და 7.3.1.3.
7.2.1.5 მომზადების შემდეგ ნაცხი ან ანაბეჭდი აშრობენ ჰაერში 20-30 წუთის განმავლობაში. ფიქსირდება გაცივებულ აცეტონში 4'C ტემპერატურაზე 4 - 12 საათის განმავლობაში ან მინუს 20 *C ტემპერატურაზე 1 საათის განმავლობაში, რის შემდეგაც აცეტონიდან ამოღებულია და აშრობს ჰაერში 10 - 15 მჯ.
7.2.2 რეაგენტების მომზადება
FAG. Ang და KFG იხსნება გამოხდილი წყლით ამპულის ეტიკეტზე მითითებულ საწყის მოცულობამდე. გახსნილი FA-ების შენახვის ვადა. AnH და CFG (5 ± 2) C ტემპერატურაზე - არა უმეტეს ორი კვირისა.
უშუალოდ კვლევისთვის, საჭირო რაოდენობის გახსნილი FAG. AnG და KFG განზავებულია FBI-ით ამპულის ეტიკეტზე მითითებულ სამუშაო განზავებამდე. გახსნილი FAG-ების სამუშაო განზავება. Ang და CFG გამოიყენება მომზადების დღეს.
7.3 კვლევის ჩატარება
სლაიდები პრეპარატებით (ნაცხი ან ანაბეჭდი) 7.2.1-ის მიხედვით მოთავსებულია ტენიან კამერაში (პეტრის ჭურჭელი ან კუვეტა დატენიანებული ფსკერით). შემდეგ, სამი მომზადებული პრეპარატიდან ერთ-ერთი დაფარულია FAG-ით სამუშაო განზავებით თანაბრად ნაცხის ან ანაბეჭდის მთელ ზედაპირზე პიპეტის გამოყენებით. KFG-ის სამუშაო განზავება გამოიყენება მეორე პრეპარატზე. დახურეთ პალატა წამლებით. მოთავსებულია თერმოსტატში (37 ± 1) *C ტემპერატურაზე და ინახება 30
წთ. საკონტროლო პრეპარატები იღებება პარალელურად. შეღებვის დასასრულს პრეპარატები სამჯერ ირეცხება, ყოველ ჯერზე 10 წუთის განმავლობაში ჩაყრიან ჭურჭელში PBS-ით. ჩამოიბანეთ გამოხდილი წყლით და გააშრეთ ჰაერში 20-30 წუთის განმავლობაში.
ანგის სამუშაო განზავება გამოიყენება მესამე პრეპარატზე. მოთავსებულია თერმოსტატში (37 ± 1) *C ტემპერატურაზე და ინკუბაცია 30 წუთის განმავლობაში. შემდეგ პრეპარატი სამჯერ ირეცხება, ყოველ ჯერზე 10 წუთის განმავლობაში ჩაეფლო ჭურჭელში PBS-ით. ჩამოიბანეთ გამოხდილი წყლით, გააშრეთ ჰაერში 20 - 30 წთ და შეღებეთ FAG-ის სამუშაო განზავებით. როგორც ზემოთ იყო აღწერილი.
7.4 დამუშავების შედეგები
შეღებილ პრეპარატებში ცოფის ვირუსით დაზარალებული ტვინის ქსოვილი სუსტად ანათებს. ნაცრისფერი ყვითელი.
ცოფის ვირუსის ანტიგენი აღმოჩენილია ნეირონებში და გარე უჯრედებში სხვადასხვა ფორმისა და ზომის კაშკაშა მწვანე გრანულების სახით - ძლივს შესამჩნევიდან 15-20 მიკრონის დიამეტრამდე. ზოგჯერ არის დიდი რაოდენობით პატარა კაშკაშა მწვანე ნაწილაკები (1 მიკრონი ზომით) მრგვალი და ოვალური ფორმის.
ცოფის დიაგნოზი დადგენილად ითვლება, თუ შესწავლილ პრეპარატში გვხვდება ტიპიური მოყვითალო-მომწვანო გრანულები მიკროსკოპის ხედვის რამდენიმე ველში. ამავდროულად, საკონტროლო პრეპარატებში (ცოფის გარეშე ჯანმრთელი თეთრი თაგვების ტვინიდან ნაცხებში ან ანაბეჭდებში, შეღებილი FAG-ით), ასევე შესწავლილ პრეპარატებში, შეღებილი CFG და წინასწარ დამუშავებული AnG-ით და შეღებილი FAG-ით. ასეთი წარმონაქმნები არ უნდა არსებობდეს.
კვლევის შედეგები ეცნობება კომპეტენტურ ორგანოებს სტანდარტის მიმღები სახელმწიფოს ტერიტორიაზე მოქმედი პროცედურის შესაბამისად.
უარყოფითი შედეგის 8 შემთხვევაში, კვლევები ტარდება 8 ან 9.
8 ცოფის ვირუსის გამოყოფის მეთოდი თაგვის ნეირობლასტომის CCL-131 უჯრედულ კულტურაში
8.1 მეთოდის არსი
მეთოდის არსი მდგომარეობს თაგვის უჯრედულ კულტურაში ცოფის ვირუსის იზოლირებაში.
ნეირობლასტომა CCL-131 ან NGUK-1 მისი შემდგომი იდენტიფიკაციით ფლუორესცენტური ანტისხეულების მეთოდით.
მეთოდი თეთრ თაგვებზე ბიოანალიზის ალტერნატივაა 9-ის მიხედვით.
8.2 მომზადება კვლევისთვის
8.2.1 ნიმუშის მომზადება
ქსოვილის თანაბარი ნაწილები სტერილურად აღებული პატარა ცხოველის ტვინის თითოეული ნაწილიდან (ამონის რქები, ცერებრალური ჯირკვალი, თავის ტვინის ქერქი, მედულა oblongata) ან ქსოვილის ნაჭრები დიდი ცხოველის ტვინის თითოეული ნაწილიდან, აღებული 6.5-ის მიხედვით. გაანადგურა მაკრატლით და დაფქული ნაღმტყორცნებით ან ჰომოგენიზატორით, თანდათანობით დაუმატეთ სტერილური 0,9% ნატრიუმის ქლორიდის იზოტონური ხსნარი 10% სუსპენზიის მიღებამდე. პენიცილინი და სტრეპტომიცინი ემატება ტვინის სუსპენზიას აშშ ერთეულების/სმ 3 და 1 მგ/სმ3 შესაბამისად.
მიღებულ სუსპენზიას საფუძვლიანად ურევენ და 5-10 წუთის განმავლობაში ცენტრიფუგირებენ 2000 ბრ/წთ სიჩქარით. ზემოაღნიშნული დანალექი სითხე გადადის სტერილურ სინჯარაში და ინახება არაუმეტეს 4°C ტემპერატურაზე გამოყენებამდე.
8.2.2 კულტურის სლაიდების მომზადება
თაგვის ნეირობლასტომის უჯრედების ყოველდღიური კულტურა CCL-131 (ან NGUK-1) ამოღებულია კულტურის კოლბიდან 0,25% ტრიპსინის ხსნარის გამოყენებით და განზავებულია DMEM გარემოთი 10% ნაყოფის მსხვილფეხა რქოსანი შრატით და 3% გლუტამინით 2 * 10 s უჯრედების კონცენტრაციამდე. /სმ 3. მიღებულ უჯრედულ სუსპენზიის 0,1 სმ 3 ემატება კულტურის მინის ჭებს, იფარება სახურავით და მოთავსებულია ტენიან CO გ-ინკუბატორში CO 5% შემცველობით (37 ± 1) ° C ტემპერატურაზე 18- 20 საათი
8.3 კვლევის ჩატარება
0.05 სმ 3 სუსპენზია ტვინის თითოეული ნაწილიდან ემატება კულტურის მინის ორ ჭაბურღილს 8.2.2-ის მიხედვით. დადებითი და უარყოფითი კონტროლისთვის თითოეულ სლაიდზე რჩება ორი ჭა. დადებითი კონტროლის სახით გამოიყენება ცოფის ვირუსით ინფიცირებული თაგვის ტვინის სუსპენზია - CVS შტამი. ნეგატიური კონტროლის სახით შემოღებულია კლინიკურად ჯანმრთელი თაგვის ტვინის შეჩერება. კულტურის მინა მოთავსებულია ტენიან CO2 ინკუბატორში CO2 შემცველობით 5% (37 ± 1) *C ტემპერატურაზე 42–48 საათის განმავლობაში.
ინკუბაციის დასასრულს, ავტომატური პიპეტის გამოყენებით ნიადაგი ამოღებულია კულტურის შუშის ჭიდან, უჯრედები ერთხელ ირეცხება PBS-ით (ავტომატური პიპეტის გამოყენებით, თითოეულ ჭაბურღილს ემატება 0,2 სმ 3 ხსნარი) და აშრობენ. ლამინირებული ჰაერის ნაკადი 20-30 წუთის განმავლობაში. შემდეგ თითოეულ ჭაბურღილს ემატება 0,1 სმ 3 აცეტონი გაცივებული მინუს 20 *C ტემპერატურაზე და 30 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე რჩება.
უჯრედის ფიქსაციის შემდეგ კულტურულ მინას აბრუნებენ და აკანკალებენ აცეტონის მოსაშორებლად და შემდეგ აშრობენ ლამინირებულ ჰაერში 20-30 წუთის განმავლობაში. სკალპელისა და პინცეტის გამოყენებით ამოიღეთ პლასტმასის საქშენი და გააშრეთ ჭიქა კიდევ 5-10 წუთის განმავლობაში. 0,05 - 0,10 სმ 3 FAG ემატება თითოეულ ჭაბურღილს FBI-ში მომზადებულ სამუშაო განზავებაში (შერჩეული ემპირიულად). მოთავსებულია სველ პეტრის ჭურჭელში და ინკუბირებულია (37 ± 1) C ტემპერატურაზე 30 წუთის განმავლობაში.
შეღებვის დასასრულს სლაიდები სამჯერ ირეცხება, ყოველ ჯერზე 10 წუთის განმავლობაში ჩაყრიან ჭურჭელში PBS-ით. შემდეგ პრეპარატებს რეცხავენ გამოხდილი წყლით და აშრობენ ჰაერში 20-30 წუთის განმავლობაში.
ფლუორესცენტური ჩაძირვის ზეთი გამოიყენება შეღებილ პრეპარატებზე და ათვალიერებენ ფლუორესცენტური მიკროსკოპის ქვეშ.
8.4 დამუშავების შედეგები
შეღებილ პრეპარატებში ცოფის ვირუსით დაზარალებული უჯრედული კულტურა სუსტად ანათებს. მონაცრისფრო-მოყვითალო ფერი (უარყოფითი კონტროლი). ცოფის ვირუსის ანტიგენი აღმოჩენილია უჯრედული კულტურის ციტოპლაზმაში სხვადასხვა ფორმისა და ზომის კაშკაშა მწვანე გრანულების სახით მკაფიოდ განსაზღვრული კიდეებით (დადებითი კონტროლი).
ცოფის დიაგნოზი დადასტურებულად ითვლება, თუ ტესტის მომზადებაში ნაპოვნია ტიპიური ყვითელ-მწვანე გრანულები მიკროსკოპის რამდენიმე ხედვის ველში.
თუ ცოფის ვირუსი არ არის გამოვლენილი უჯრედულ კულტურაში, მაშინ დგება უარყოფითი დიაგნოზი.
ცოფის ვირუსის უჯრედულ კულტურაში გამოყოფის შედეგები საბოლოოა, შემდგომი კვლევები არ ჩატარებულა.
9 ბისტლერობი თეთრ თაგვებზე
9.1 მეთოდის არსი
მეთოდის არსი მდგომარეობს ცოფის ვირუსის იზოლაციაში თეთრ თაგვებში პათოლოგიური მასალის ინტრაცერებრული ინექციის გზით, რასაც მოჰყვება ვირუსის იდენტიფიკაცია ფლუორესცენტური ანტისხეულების მეთოდით 7-ის მიხედვით.
9.2 ნიმუშების მომზადება გამოკვლევისთვის - 6.2.1-ის მიხედვით.
9.3 კვლევის ჩატარება
ხუთი-ექვსი თეთრი თაგვი ინფიცირებულია პათოლოგიური მასალის 10%-იანი სუსპენზიით im-tracerebral მოცულობით 0,02 - 0,03 სმ 3. ინფიცირებულ თაგვებს ათავსებენ ცალკე გალიაში, რომელზედაც დამაგრებულია ეტიკეტი, სადაც მითითებულია დაინფიცირების თარიღი, თაგვების რაოდენობა, დაინფიცირების მეთოდი და პათოლოგიური მასალის გამოკვლევის ნომერი. ცხოველებს აკვირდებიან მინიმუმ 30 დღის განმავლობაში. ჟურნალში ფიქსირდება ჯანმრთელი, ავადმყოფი და მკვდარი თაგვების რაოდენობა.
9.4 დამუშავების შედეგები
შედეგების შეფასებისას მხედველობაში მიიღება ინფიცირებულ თაგვებში კლინიკური ნიშნების არსებობა (გახეხილი ქურთუკი, საკვების მიღება, მოძრაობის კოორდინაციის დარღვევა, დამბლა, ტრემორი, პროსტრაცია). ინფიცირებიდან პირველი ორი დღის განმავლობაში თაგვების სიკვდილი არ არის გათვალისწინებული. ავადმყოფი და მკვდარი ცხოველების ტვინის ნიმუშები, მესამე დღიდან, საგარეო საქმეთა სამინისტროს მიერ 7-ით განიხილება.
ბიოანალიზი დადებითად ითვლება, თუ დაინფიცირებიდან მესამე დღიდან დაწყებული, სულ მცირე ერთი თაგვი დაავადდა და მოკვდა, და ცოფის ვირუსის სპეციფიკური ჩანართები გამოვლინდა ტვინის ნიმუშში MFA-ს გამოყენებით.
უარყოფითი დიაგნოზის დადგენა შესაძლებელია მხოლოდ დაკვირვებიდან 30 დღის შემდეგ, იმ პირობით, რომ ყველა ინფიცირებული ცხოველი ცოცხალი და ჯანმრთელი დარჩება.
ბიოანალიზის შედეგები განიხილება საბოლოო, შემდგომი კვლევა არ ჩატარებულა.
10 ფერმენტული იმუნოანალიზის მეთოდი (ELISA)
10.1 მეთოდის არსი
8 ELISA ეფუძნება ცოფის ვირუსის ანტიგენის სპეციფიკურ ურთიერთქმედებას ანტიჰელიუმთან. იმობილიზაცია მყარ მატარებელზე. შეკრული ანტიგენი გამოვლენილია მეორე პეროქსიდაზაზე მარკირებული ცოფის ანტისხეულის გამოყენებით. რომლის რეაქციის პროდუქტი შეფერილია ქრომოგენის დამატებისას. რეაქციის პროდუქტის შეღებვის ინტენსივობა პირდაპირპროპორციულია ანტიგენის რაოდენობაზე.
10.2 მომზადება კვლევისთვის
10.2.1 ტესტის მასალად (ანტიგენად) გამოიყენება გარდაცვლილი, იძულებით მოკლული, ცოფზე ეჭვმიტანილი ან ცოფის ვირუსით ექსპერიმენტულად ინფიცირებული ცხოველების ტვინის ქსოვილის ნიმუშები.
10.2.2 საცდელი ანტიგენის მომზადება
6.5-ის მიხედვით მიღებულ ტვინის ქსოვილის ნიმუშებს აჭყლიტებენ, ფქვავენ ნაღმტყორცნებში და 10% * სუსპენზიებს ამზადებენ C.9% ნატრიუმის ქლორიდის იზოტონურ ხსნარში, აცხელებენ წყლის აბაზანაში 60*C ტემპერატურაზე 15 წუთის განმავლობაში და ადუღებენ ცენტრიფუგს. 5-10 წუთი 2000 rpm-ზე. სუპერნატანტი გამოიყენება როგორც ტესტი ანტიგენი.
10.2.3 რეაგენტების მომზადება
ყველა ხსნარი და რეაგენტი რეაქციის დაყენებამდე უნდა ინახებოდეს მინიმუმ 30 წუთის განმავლობაში (22 ± 1) *C ტემპერატურაზე.
ნაკრების კომპონენტების მომზადება ხორციელდება გამოყენების ინსტრუქციის მიხედვით.
10.3 კვლევის ჩატარება
10.3.1 ELISA ტარდება სენდვიჩის ვერსიით, კომპონენტებში შემავალი კომპონენტების გამოყენებით პათოლოგიურ მასალაში ცოფის გამომწვევის ანტიგენის გამოსავლენად.
ELISA-სთვის გამოიყენება იმუნოლოგიური რეაქციების ფირფიტები ბრტყელი ფსკერით.
ტაბლეტის ჭაბურღილებში ეტაპობრივად შეყვანილი ინგრედიენტების მოცულობა ერთმანეთის ტოლია და არის
10.3.2 ფირფიტის სენსიბილიზაცია
პოლისტიროლის ფირფიტის 6 ჭაბურღილი იტვირთება ANG-ით ეტიკეტზე მითითებული სამუშაო განზავებისას. ფირფიტა ANG-ით იფარება თავსახურით და ინკუბირებულია თერმოსტატში (37 ± 0,5) *C ტემპერატურაზე 3 საათის განმავლობაში ან 4 *C ტემპერატურაზე 18 საათის განმავლობაში.ინკუბაციის შემდეგ ფირფიტის ჭები ირეცხება. სამჯერ სარეცხი ბუფერული ხსნარით. ყოველი დაბანისას ამოიღეთ ჭების შიგთავსი. ხოლო დარჩენილი ხსნარი ამოღებულია ფილტრის ქაღალდზე დაჭერით.
10.3.3 ანტიგენების გამოყენება
8 რიგები ფირფიტა A. 8 და C დაამატეთ სარეცხი ბუფერი. კომპლექტში შემავალი საკონტროლო დადებითი (ჭაბურა A1) და უარყოფითი (ჭაბურა A2) ანტიგენები, ასევე სატესტო ნიმუშები (ჭები AZ. A4 და ა.შ.) შეჰყავთ ტაბლეტის ჭურჭელში და ტიტრირდება ვერტიკალურად, მიიღება განზავები 1-დან. : 2-დან 1-მდე: 8. ნიმუშების დიდი რაოდენობით შეავსეთ ტაბლეტის სხვა რიგები. ფირფიტა იფარება თავსახურით და ინკუბირებულია ჰერმოსტატში (37 ± 0,5) *C ტემპერატურაზე 1 საათის განმავლობაში.ინკუბაციის ბოლოს ფირფიტის ჭები სამჯერ ირეცხება იმუნოგლობულინთან შეუკავშირებელი ანტიგენებისგან. როგორც აღწერილია 10.3.2-ში.
10.3.4 ცოფის ლეროქსიდაზას კონიუგატის გამოყენება
ცოფის საწინააღმდეგო პეროქსიდაზას კონიუგატის სამუშაო განზავებას ემატება ფირფიტის ჭები, შემდეგ ახურავს თავსახური და ინკუბირებულია თერმოსტატში (37 ± 0,5) C ტემპერატურაზე 1 საათის განმავლობაში. შემდეგ ფირფიტის ჭები გარეცხილი სამჯერ, როგორც ეს აღწერილია 10.3.2-ში.
10.3.5 სუბსტრატის ნარევის გავრცელება
რეაქციის მანიფესტაციისთვის მომზადებული სუბსტრატის ნარევი ემატება ტაბლეტის ჭებს. რეაქცია ნაჩვენებია 15 - 30 წუთის განმავლობაში (22 ± 0,5) *C ტემპერატურაზე სიბნელეში. რეაქცია წყდება გოგირდმჟავას ხსნარის დამატებით 2 მოლ/დმ 3 მოლური კონცენტრაციით.
10.4 დამუშავების შედეგები
რეაქციის აღრიცხვა ხორციელდება ვიზუალურად ან სკანირების სპექტროფოტომეტრზე, ნაკრების გამოყენების ინსტრუქციის შესაბამისად.
თუ OPD გამოიყენება როგორც ქრომოგენი სუბსტრატის ნარევში. შემდეგ ოპტიკური სიმკვრივის გაზომვა ხორციელდება 490 ნმ. თუ იყენებთ TMB-ს. შემდეგ 450 კმ-ზე.
რეაქცია განიხილება მხოლოდ იმ შემთხვევაში, თუ ჭაბურღილებში არ არის სპეციფიკური შეღებვა უარყოფითი ანტიგენის კონტროლით, ხოლო ჭაბურღილების ინტენსიური შეღებვა კონტროლით. დადებითი ანტიგენი. ვიზუალური დათვლისას ნიმუში ითვლება დადებითად, თუ მინიმუმ ერთი (პირველი) განზავება აჩვენებს სპეციფიკურ შეღებვას.
ELISA-ს შედეგის სპექტროფოტომეტრიულად გათვალისწინებისას ტარდება სპეციფიკურობის კოეფიციენტის K sp გამოთვლა. რომელიც უდრის საკონტროლო დადებითი ანტიგენის ან ტესტის მასალის (OD) ჭაბურღილებში რეაქციის პროდუქტის ოპტიკური სიმკვრივის (OD) თანაფარდობას საკონტროლო უარყოფითი ანტიგენით (OD) ჭაბურღილებში სუბსტრატის ნარევის ოპტიკურ სიმკვრივესთან. . რეაქცია დადებითად ითვლება. თუ სპეციფიკურობის კოეფიციენტი 2.1-ზე მეტია და უარყოფითი თუ 2.1-ზე ნაკლებია.
OP1 * 0,641, OPg a 0,120, Ksp \u003d 5,34 - რეაქცია დადებითია ან OP1 \u003d 0,180, OPg 0,120 K-ზე „ * 1,5 - რეაქცია უარყოფითია.
დადებითი რეაქციის შემთხვევაში დიაგნოზი დადასტურებულად ითვლება. უარყოფითი შედეგი უნდა დადასტურდეს სხვა მეთოდებით 7 - 9 შესაბამისად.
11 დიფუზიური ნალექების რეაქცია (RDP)
11.1 მეთოდის არსი
RDP მეთოდის არსი მდგომარეობს ანტისხეულების და ვირუსული ანტიგენის უნარში, გავრცელდეს აგარის გელში და, სპეციფიკური ურთიერთქმედებისას, შექმნას ანტიგენ-ანტისხეულის კომპლექსი, რომელიც შეუიარაღებელი თვალით ჩანს ნალექის ხაზის სახით.
11.2 საგამოცდო მომზადება
11.2.1 ნიმუშის მომზადება
ნიმუშების მომზადება კვლევისთვის - 8.2.1-ის მიხედვით.
ბაქტერიული მიკროფლორით დაბინძურებული ცხოველის ტვინის ძველი ნიმუშები დასაშვებია კვლევისთვის.
11.2.2 აგარის მომზადება
აგარის მოსამზადებლად შეურიეთ 1,5 გრ დიფკო აგარი. მეთილის ფორთოხლის 1 სმ 3 1% ხსნარი 50% ეთანოლში. 0,01გრ მერტიოლატი. 100 სმ 3 იზოტონური ნატრიუმის ქლორიდის ხსნარი. მიღებულ ნარევს ადუღებენ აგარის სრულ დნობამდე, ასხამენ სინჯარებში, ამუშავებენ 0,5 ატმ წნევით 30 წუთის განმავლობაში და ინახება მაცივარში 4°C ტემპერატურაზე.
11.2.3 სლაიდების (პეტრის კერძების) მომზადება
რეაქცია მოთავსებულია ან მინის სლაიდებზე ან პეტრის ჭურჭელზე. გამდნარი აგარის წვეთს სვამენ ცხიმისმცველ მინაზე, იგი თანაბრად ნაწილდება მინაზე და ტოვებენ ოთახის ტემპერატურაზე 20-30 წუთის განმავლობაში, რათა გამაგრდეს აგარი. შემდეგ 2,5 სმ 3 გამდნარი აგარი გამოიყენება მინაზე, აყალიბებს ფენას დაახლოებით 2 მმ სისქით. და გააჩერეთ 20-30 წუთი. ხვრელები აგარის გაყინულ ფენაში კეთდება სპეციალური შტამპის ან ლითონის თხელკედლიანი მილის გამოყენებით 4-5 მმ დიამეტრით. აგარის სვეტები საგულდაგულოდ იხსნება თვალის პინცეტის ან სხვა ხელსაწყოს გამოყენებით.
ანალოგიურად ამზადებენ პეტრის ჭურჭელს, მათ უმატებენ 10 - 15 სმ 3 გამდნარ აგარს 2-3 მმ სისქის ფენის მისაღებად.
11.3 კვლევის ჩატარება
რეაქციის დაყენებამდე უშუალოდ ამზადებენ ცოფის საწინააღმდეგო შრატის (იმუნოგლობულინის) განზავებას, რისთვისაც 1,0 სმ 3 ნატრიუმის ქლორიდის იზოტონური ხსნარი ემატება ოთხ სინჯარას. პირველ სინჯარაში დაამატეთ 1.0 სმ 3 ცოფის საწინააღმდეგო შრატი, მიიღება განზავება 1:2.
აურიეთ და გადაიტანეთ 1.0 სმ 3 ნარევი მეორე სინჯარაში და ა.შ. ამგვარად, მიიღება ოთხი საცდელი მილი 1: 2.1: 4.1: 8 და 1:16 განზავებით.
8 მომზადებული ჭაბურღილი ხელს უწყობს 0.05 - 0.07 სმ 3 ტვინის ნიმუშის (თითოეული ნიმუში ცალკე ჭაში), მიღებული 8.2.1-ის მიხედვით. და ცოფის საწინააღმდეგო შრატის ან იმუნოგლობულინის განზავება (1:2; 1:4; 1:8:1:16) სურათი 1-ის მიხედვით.
სურათი 1 - მასალის გამოყენების სქემა
არ - ემონის რქა; Pm - medulla oblongata; A+ - დადებითი კონტროლის ანტიგენი; M - cerebellum; K - ცერებრალური ქერქი; A- - უარყოფითი კონტროლის ანტიგენი.
მასალის შესატანად შესაძლებელია სხვა სქემების გამოყენება, მაგრამ დადებითი და უარყოფითი ანტიგენების გამოყენება სავალდებულოა.
საცდელი მასალით სლაიდები მოთავსებულია პეტრის ჭურჭელში დატენიანებული ფსკერით ან სველი საშრობით, შემდეგ კი თერმოსტატში (37 ± 1) *C ტემპერატურაზე 48 საათის განმავლობაში (პეტრის ჭურჭელი იფარება თავსახურით და მოთავსებულია თერმოსტატი).
რეაქცია მხედველობაში მიიღება 6.24 და 48 საათის შემდეგ.
11.4 დამუშავების შედეგები
რეაქცია დადებითად ითვლება, როდესაც ჩნდება თუნდაც ერთი ნებისმიერი ინტენსივობის ნალექების ხაზი საცდელ მასალასა და ცოფის საწინააღმდეგო შრატს (იმუნოგლობულინი) შორის.
ამ შემთხვევაში ნალექის შესამჩნევი ხაზი უნდა შეინიშნოს დადებით ანტიგენსა და ცოფის საწინააღმდეგო შრატს შორის (იმუნოგლობულინი) და არ უნდა იყოს ნალექის ხაზი უარყოფით ანტიგენსა და ცოფის საწინააღმდეგო შრატს (იმუნოგლობულინი) შორის.
დადებითი რეაქციის 8 შემთხვევაში დიაგნოზი დადასტურებულად ითვლება. უარყოფითი შედეგი უნდა დადასტურდეს სხვა მეთოდებით 7-10-ის მიხედვით.
ბიბლიოგრაფია
ადამიანის და ვეტერინარული გამოყენების სამკურნალო პროდუქტების კარგი წარმოების პრაქტიკის ევროკავშირის გზამკვლევი
UDC 619:616.98:579.852.1:615371 MKS 11.220
საკვანძო სიტყვები: ცოფი, დიაგნოსტიკა, ფლუორესცენტური ანტისხეულების მეთოდი, დაკავშირებული იმუნოსორბენტული ანალიზი, ბიოანალიზი, დიფუზიური ნალექების რეაქცია
ხელმოწერილია გამოსაქვეყნებლად 04/01/2014. ფორმატი 60x84V
უელ. pvc. ლ. 1.40. ტირაჟი 31 ეკვ. ზაქ. 1363 წ.
მომზადებულია სტანდარტის შემქმნელის მიერ მოწოდებული ელექტრონული ვერსიის საფუძველზე
FSUE "STANDARTINFORM"
123995 მოსკოვი. გარნეტის შესახვევი, 4.
მეთოდოლოგიური ინსტრუქციები
ცოფის ლაბორატორიული დიაგნოსტიკა
1. ცოფის დიაგნოზი დგება ეპიზოოტოლოგიური, კლინიკური, პათოანატომიური მონაცემების კომპლექსის საფუძველზე და ძირითადად ლაბორატორიული გამოკვლევების საფუძველზე.
2. კვლევისთვის კურიერით იგზავნება ლაბორატორიაში: ახალი გვამი ან თავი ძაღლისგან (კატა, მელა, არქტიკული მელა, ცხვარი, ხბო და ა.შ.), მსხვილი ცხოველებისგან - თავი ან ტვინი (ახალი ან დაკონსერვებული). 30 - 50% გლიცერინის ხსნარში). მხოლოდ შეუნარჩუნებელი ტვინი არის შესაფერისი სეროლოგიური კვლევებისთვის.
3. ცოფის ლაბორატორიული დიაგნოსტიკა მოიცავს თავის ტვინის მიკროსკოპულ გამოკვლევას (ბაბეს-ნეგრის სხეულების აღმოსაჩენად), სეროლოგიურ გამოკვლევას (ცოფის სპეციფიური ანტიგენის გამოვლენა), აგრეთვე თეთრ თაგვებზე ან კურდღლებზე ბიოლოგიური ტესტის დაყენებას. .
კვლევის ბრძანება.
4. კვლევისთვის მიღებული ტვინიდან ისინი პირველად ითესება მკვებავ გარემოზე. თავის ტვინის ნაწილი დაუყოვნებლივ მოთავსებულია მაცივარში და ინახება ხელახალი გამოკვლევის საჭიროების შემთხვევაში. მასალა აღებულია ტვინის დანარჩენი ნაწილიდან მიკროსკოპული გამოკვლევისთვის, სეროლოგიური რეაქციებისა და ბიოლოგიური ნიმუშებისთვის.
შენიშვნა. გაკვეთა, თავის ტვინის ამოღება და სხვა სამუშაოები ტარდება სტერილურ პირობებში, პირადი პრევენციის ზომების მკაცრი დაცვით (ცხოველის თავის ძლიერი ფიქსაცია, ხელების დაცვა ორი წყვილი ხელთათმანით: ქირურგიული და ანატომიური; სათვალეების დადება. დაიცავით თვალები, ხოლო ცხვირი და პირი დაფარულია მარლის ბინტით).
I. მიკროსკოპული კვლევები
5. მიკროსკოპული გამოკვლევისთვის კეთდება ანაბეჭდები და ნაცხი ტვინის სხვადასხვა ნაწილიდან.
6. ანაბეჭდის მოსამზადებლად 4-6 ფენად დაკეცილი ფილტრის ქაღალდზე ათავსებენ თავის ტვინის ნაჭრებს (ამონის რქა, თავის ტვინის ქერქი, ტვინი, ტვინი). ამოჭრილ ზედაპირს ზედიზედ რამდენიმეჯერ (3 - 4) ეხება სუფთა შუშის სლაიდით, მსუბუქად დაჭერით მინაზე თხელი ანაბეჭდის გასაკეთებლად.
7. ნაცხი კეთდება ტვინის ერთი და იგივე უბნებიდან. ამისთვის ტვინის ნაჭრებს ფაიფურის ნაღმტყორცნებით აფქვავთ ან საცდელ მილში მინის ჯოხით ერთგვაროვანი მასის წარმოქმნამდე, საიდანაც უხეში ნაცხი კეთდება ცხიმისმცველ შუშის სლაიდზე.
თქვენ შეგიძლიათ გააკეთოთ ნაცხი სხვა გზით. ამისათვის ტვინის პატარა ნაწილს ათავსებენ შუშის სლაიდის კიდეზე, აჭედებენ მეორე ჭიქით და აწებებენ ერთი კიდედან მეორესკენ, რის შედეგადაც მიიღება თხელი ერთიანი ნაცხი ზედაპირზე. მინა.
8. მიღებული ნაცხი ან ანაბეჭდი იღებება ერთ-ერთი შემდეგი გზით:
ა) შეღებვა მურომცევის მიხედვით. დამზადებული, ჯერ კიდევ სველი ნაცხი ან ანაბეჭდი დაუყოვნებლივ ფიქსირდება ეთილის ან მეთილის სპირტში ან სპირტის ნარევში ნახევარში ეთერთან ან აცეტონთან (ქიმიურად სუფთა) 1-2 საათის განმავლობაში და შემდეგ გარეცხილია წყლით. ფიქსატორის კონტეინერი კარგად უნდა იყოს დალუქული, რათა არ მოხდეს ფიქსატორის სითხის აორთქლება. წყლით დაბანის შემდეგ სველ ნაცხებს 5-10 წუთის განმავლობაში ათავსებენ წყალში 1:40 განზავებულ მუნსონის საღებავის ხსნარში. შემდეგ საღებავს აშრობენ და მაშინვე ნაცხებს ყრიან ტანინის 10%-იან წყალხსნარში 8-10 წუთის განმავლობაში, სანამ მოლურჯო შეფერილობა არ გამოჩნდება. ამის შემდეგ ნაცხებს რეცხავენ წყლით, აშრობენ ფილტრის ქაღალდით, გადიან სპირტის თანაბარი ნაწილების აცეტონთან (ქიმიურად სუფთა) ან სპირტთან ქსილენთან ერთად და კვლავ აშრობენ ფილტრის ქაღალდით. შეღებილ ნაცხს უნდა ჰქონდეს ღია ცისფერი ფონი, ხოლო ნერვული უჯრედების ბირთვები შეღებილია ლურჯად, ხოლო ბაბეშ-ნეგრის სხეულები ღია იისფერია მუქი ჩანართებით;
ბ) გამყიდველების ლაქა. მომზადებულ სველ ანაბეჭდზე ან ნაცხზე წაისვით 4 წამის განმავლობაში რეაგენტის "A" (მეთილენის ლურჯი - 2 გ, მეთილის სპირტი აცეტონის გარეშე - 100 მლ) და რეაგენტი "B" (ძირითადი ფუქსინი - 0,5 გ, ეთილის სპირტი კვალის გარეშე) ნარევი. აცეტონი - 100 მლ). საღებავის სამუშაო ხსნარი შედგება 15 მლ რეაგენტი "A", 2 - 4 მლ რეაგენტი "B" და 25 მლ მეთილის სპირტი. შეღებვის შემდეგ პრეპარატს რეცხავენ გამდინარე წყლით და აშრობენ. შეღებილ ნაცხში ნეირონების ციტოპლაზმა ღია ცისფერია, ბირთვები მუქი ლურჯია, ერითროციტები აგურისფერია, ბაბეშ-ნეგრის სხეულები მეწამულ-წითელია სხეულების აშკარად შესამჩნევი ბაზოფილური სტრუქტურით;
გ) შეღებვა მიხინის მიხედვით. ნაცხი ან ანაბეჭდები ფიქსირდება ალკოჰოლისა და ეთერის ნარევში (თანაბრად) 5-10 წუთის განმავლობაში, რის შემდეგაც აშრობენ ფილტრის ქაღალდით და 30-40 წუთის განმავლობაში ღებულობენ Giemsa-ს საღებავით (1-2 წვეთი 1 მლ გამოხდილ წყალზე). ), სწრაფად გარეცხეთ დამჟავებული სპირტით (1 წვეთი გამყინვარების ძმარმჟავა 30 მლ 96 ° სპირტზე), შემდეგ კი წყლით, გაშრეს ფილტრის ქაღალდით და დაექვემდებარა კვლევას. თუ მასალა გლიცერინში იყო, მაშინ მას წინასწარ კარგად რეცხავენ წყალში და აშრობენ ფილტრის ქაღალდით.
შეღებილ პრეპარატში, მიკროსკოპული გამოკვლევით, ძირითადი ფონი წითელი უნდა იყოს მეწამული ელფერით. ლურჯი ტონის უპირატესობით, ნაცხი კვლავ ირეცხება მჟავე ალკოჰოლით და ირეცხება წყლით. პირამიდულ ნერვულ უჯრედებს აქვთ მოლურჯო ფერი ინტენსიურად შავი ბირთვით, ხოლო ბაბეშ-ნეგრის სხეულები მოვარდისფრო-წითელია მუქი ლურჯი ფერის წერტილოვანი ჩანართებით;
დ) შეღებვა ბორმან-გაინულინას მიხედვით. თხელი ნაცხი ან ანაბეჭდები ფიქსირდება 5 წუთის განმავლობაში შემდეგი შემადგენლობის ნარევში: სპირტი და ეთერი (თანაბრად) - 98 მლ, გლაციალური ძმარმჟავა - 2 მლ; ფიქსაციის შემდეგ 5 წუთის განმავლობაში ყრიან კრისტალური სოდის 10%-იან ხსნარში, შემდეგ რეცხავენ წყლით და აშრობენ ჰაერში. ფიქსირებული ნაცხი 2 წუთის განმავლობაში იღებება გამოყენებამდე მომზადებული საღებავით (მეთილენის ლურჯის გაჯერებული წყალხსნარი - 3 წვეთი, ფუქსინის გაჯერებული ძირითადი ხსნარი - 2 წვეთი, ონკანის წყალი - 20 მლ). საღებავის ხსნარს ასხამენ ნაცხზე, ამაგრებენ ცეცხლმოკიდებულ ცეცხლზე, შემდეგ საღებავს ტოვებენ კიდევ ერთი წუთის განმავლობაში, რის შემდეგაც მას რეცხავენ წყლით და აშრობენ ფილტრის ქაღალდით. შეღებილ ნაცხში ძირითადი ფონი უნდა იყოს ღია წითელი, ნერვული უჯრედების პროტოპლაზმა შეღებილია მოწითალო-ლურჯად, ხოლო მათი ბირთვები მუქი ლურჯია, ბაბეს-ნეგრის სხეულები შეღებილია მარწყვის წითლად, ტიპიური მარცვლოვანი სტრუქტურით. ერითროციტები უფერულ წრეებს ჰგავს.
II. სეროლოგიური კვლევები
9. დიფუზური ნალექის რეაქცია აგარის გელში. რეაქცია გამოიყენება ცოფის სპეციფიური ანტიგენის გამოსავლენად ქუჩის ცოფით დაღუპული ცხოველების არაკონსერვებულ ტვინში, ასევე იმ ცხოველებში, რომლებზეც ჩატარდა ბიოანალიზი. რეაქციისთვის შეგიძლიათ გამოიყენოთ შემორჩენილი (1 თვემდე) ტვინი.
რეაქცია ტარდება უცხიმო მინის სლაიდებზე, რომლებზედაც 2,5 მლ გამდნარი და გაცივებული აგარის გელი 60°C-მდე, მომზადებულია რეცეპტის მიხედვით: მშრალი აგარ-აგარი - 12 - 15 გ; ქიმიურად სუფთა ნატრიუმის ქლორიდი - 8,6 გ; მეთილის ფორთოხლის 1% ხსნარი (გაფილტრული) 50 ° სპირტზე - 5 - 10 მლ; მერტიოლატი - 0,01 გ; გამოხდილი წყალი - 1 ლ.
შენიშვნა. რეაქციის დასაყენებლად უმჯობესია გამოიყენოთ დიფკო აგარ-აგარი, ის მთლიანად იხსნება, არ არის საჭირო გარემოს ფილტრაცია. აგარ-აგარის სხვა ჯიშები საჭიროებს ფრთხილად ფილტრაციას.
აგარის გამაგრების შემდეგ მასში კეთდება ნახვრეტები 4–5 მმ შიდა დიამეტრის თხელკედლიანი ლითონის ან შუშის მილის გამოყენებით და აწყობენ ტრაფარეტის მიხედვით (იხ. ნახ. -).
მსხვილ ცხოველებში რეაქციისთვის გამოიყენება ტვინის ნაწილაკები - ამონის რქა, ნახევარსფეროების ქერქი, ცერებრუმი, მედულა მოგრძო; ვირთხებში, გოფერებში, გვინეის ღორები, ზაზუნები და ა.შ – ტვინის ნებისმიერი სამი ნაწილი; თაგვებს აქვთ მთელი ტვინი.
მიკრონალექის დაყენების სქემა:
მაგრამ
- ქერქი (მარცხენა ნახევარსფერო); AT- ქერქი (მარჯვენა ნახევარსფერო); FROM- ამონის რქა (მარცხნივ);
დ- ამონის რქა (მარჯვნივ); ე- ცერებრელი; და- მედულა;
1
, 2
, 3
, 4
- გლობულინის განზავება, შესაბამისად 1:2, 1:4, 1:8, 1:16.
დადებითი RP ყველა გლობულინის განზავებით
(ცერებრალური ქერქი, ქუჩის ცოფი)
დადებითი RP გლობულინის განზავებით 1:4; 1:8, 1:16
(ამონი ძაღლის რქა, ქუჩის ცოფი)
დადებითი RP გლობულინის განზავებით 1:16,
არ არის ნალექის ხაზები 1:2, 1:4 განზავებით,
(ძაღლის ტვინი, ქუჩის ცოფი)
ტვინი იფქვება ფაიფურის ნაღმტყორცნებში ნაღმტყორცნებით ან თავის ქალაში „პასტად“, რომელიც ივსება ანტიგენისთვის ჭებით. დარჩენილი ჭები ივსება ცოფის საწინააღმდეგო გლობულინით 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 განზავებით. გამოყენებული ინგრედიენტების მოცულობაა 0.02 მლ.
კონტროლი დადებითი და უარყოფითი ანტიგენებით ერთდროულად მოთავსებულია ცალკეულ სლაიდზე იმავე აგარის გამოყენებით იმავე სტენლის გამოყენებით.
რეაქციის ინგრედიენტების შესაბამის ჭებში მოთავსების შემდეგ, შუშის სლაიდები გადაიტანება ტენიან კამერაში (პეტრის ჭურჭელი სველი ფილტრის ქაღალდით ან ბამბის ბამბით) და მოთავსებულია თერმოსტატში 6 საათის განმავლობაში 37-38 °C ტემპერატურაზე. შემდეგ კერძები რჩება ოთახის ტემპერატურაზე კიდევ 18 საათის განმავლობაში.
რეაქციის აღრიცხვა ხორციელდება მისი დაყენებიდან 3, 6 და 24 საათის შემდეგ. აგარის გაშრობის თავიდან ასაცილებლად, რეაქციის სლაიდები მოთავსებულია იმავე პეტრის ჭურჭელში, რომელიც შეიცავს დატენიანებულ ბამბას ყოველი დათვალიერების შემდეგ.
აგარის ნალექის დადებითი რეაქციით, ერთი, ორი და ძალიან იშვიათად სამი პარალელური ნალექების ხაზი შეიძლება ჩამოყალიბდეს გლობულინისა და ანტიგენის მქონე ჭებს შორის. შედეგად მიღებული ნალექის ხაზები ვიზუალურად ჩანს, როდესაც სათვალეები განათებულია ქვემოდან ზემოდან, დაახლოებით 45° კუთხით.
ნალექის რეაქციის უარყოფითი ჩვენებით მოთავსებულია ბიოანალიზი.
10. იმუნოფლუორესცენციის რეაქცია. იგი დაფუძნებულია სპეციალური მიკროსკოპით (ML-1, ML-2, ML-3 და ა.შ.) ვირუსული ანტიგენის გამოვლენაზე, რომელმაც რეაგირება მოახდინა ცოფის საწინააღმდეგო სპეციფიურ შრატთან, ეტიკეტირებული ფლუორესცენტური საღებავით.
რეაქციისთვის თხელი და თანაბარი ანაბეჭდები კეთდება სუფთა ან ახლად გაყინული ტვინის საგულდაგულოდ გასუფთავებულ ჭიქებზე. ანაბეჭდები მზადდება ტვინის ნაწილებისგან (ამონის რქა, ცერებრალური ქერქი, ტვინი, მედულლა მოგრძო) ისევე, როგორც მიკროსკოპული გამოკვლევისთვის. ტვინის თითოეული ნაწილისგან ამზადებენ მინიმუმ 4 პრეპარატს. კონტროლისთვის, წამლები ასევე მზადდება ჯანმრთელი ცხოველის ტვინისგან.
ჰაერში გაშრობის შემდეგ პრეპარატები ფიქსირდება აცეტონში 4 საათის განმავლობაში არაუმეტეს 4°C ტემპერატურაზე. ფიქსატორის კონტეინერი კარგად უნდა იყოს დალუქული, რათა არ მოხდეს ფიქსატორის სითხის აორთქლება. აცეტონით დამაგრების შემდეგ კონიუგატის (ფლუორესცენტული ცოფის საწინააღმდეგო გამა გლობულინი) რამდენიმე წვეთი გამოიყენება მუშა განზავებაში არსებულ პრეპარატებზე. შემდეგ ათავსებენ ტენიან კამერაში (პეტრის ჭურჭელი ან დახურული ემალირებული კუვეტა დატენიანებული ფსკერით) 20 - 30 წუთის განმავლობაში 25 °C ტემპერატურაზე.
ამის შემდეგ პრეპარატებს რეცხავენ წყლით ან ფოსფატის ბუფერული ხსნარით (pH 7,2 - 7,4) 1 საათის განმავლობაში, შემდეგ რეცხავენ გამოხდილი წყლით, აშრობენ ჰაერში და ექვემდებარებიან კვლევას. პრეპარატები განიხილება ჩაძირვის სისტემის ქვეშ. ჩაძირვისთვის გამოიყენება არალუმინესცენტური ზეთი.
შეღებილ პრეპარატში, ფლუორესცენტური მიკროსკოპის ქვეშ, ტვინის ქსოვილი ფლუორესცირდება (ანათებს) მოლურჯო-მოყვითალო შეფერილობით. ცოფის ვირუსის ანტიგენი გამოვლენილია პრეპარატებში სხვადასხვა ფორმისა და ზომის კაშკაშა მოყვითალო-მომწვანო ან მწვანე გრანულების სახით - ძლივს შესამჩნევიდან 15-20 მიკრონი დიამეტრის ჩათვლით.
საკონტროლო პრეპარატში ყვითელ-მწვანე ინტენსიურად მანათობელი გრანულები არ შეინიშნება.
ფლუორესცენტური ანტისხეულების მეთოდის გამოყენებით ჩატარებულ კვლევაში, ცოფის დიაგნოზი დადგენილად ითვლება, თუ მიკროსკოპის რამდენიმე ხედში ნაპოვნია სხვადასხვა ზომის კაშკაშა მომწვანო ბზინვის მქონე ტიპიური გრანულების საკმარისი რაოდენობა (მინიმუმ 10). ასეთი წარმონაქმნების კონტროლი არ უნდა იყოს.
დადებითი ფლუორესცენციის არარსებობის შემთხვევაში მოთავსებულია ბიოლოგიური ნიმუში.
III. ბიოლოგიური ნიმუში
11. ცოფის ბიოლოგიური ტესტი ტარდება მიკროსკოპული გამოკვლევისას (ბაბეს-ნეგრის სხეულები არ არის გამოვლენილი), სეროლოგიური რეაქციებით (ცოფის სპეციფიკური ანტიგენი არ არის გამოვლენილი), აგრეთვე ატიპიური ჩანართების გამოვლენისას უარყოფითი შედეგის მიღებით. ბიოლოგიური ტესტი ტარდება თეთრ თაგვებზე ან კურდღლებზე.
12. ექსპერიმენტული თაგვები ან კურდღლები ინფიცირდებიან საცდელი ტვინიდან 10%-იანი სუსპენზიით ფიზიოლოგიურ ხსნარში ან ხორც-პეპტონის ბულიონში pH 7,2 - 7,4. სუსპენზიის მოსამზადებლად გამოიყენება ტვინის იგივე ნაწილები, საიდანაც მასალა აღებულია მიკროსკოპული და სეროლოგიური კვლევებისთვის.
თავის ტვინის ამოკვეთილ ნაწილებს აგროვებენ სტერილურ სინჯარაში და აწონიან, შემდეგ საფუძვლიანად ფქვავენ ნაღმტყორცნებით ნაღმტყორცნებით, რის შემდეგაც უმატებენ ფიზიოლოგიურ ფიზიოლოგიურ ხსნარს ან ხორც-პეპტონის ბულიონს 10%-იანი სუსპენზიის მისაღებად. მიღებული სუსპენზია ნებადართულია 10 წუთის განმავლობაში და ზედმეტად გამოიყენება ინფექციისთვის.
თუ პათოლოგიური მასალა იყო დაბინძურებული, მაშინ ზენატანს ასხამენ სხვა ჭურჭელში (სატესტო მილში) და მას უმატებენ 500-1000 სე პენიცილინს და სტრეპტომიცინს 1 მლ სითხეზე, რის შემდეგაც ნებადართულია კიდევ 30 წუთი გაჩერდეს. ოთახის ტემპერატურაზე და შემდეგ გამოიყენება ინფექციისთვის. სუსპენზია უნდა მომზადდეს სტერილურ პირობებში და პირადი პრევენციის წესების მკაცრი დაცვით.
ბიოლოგიური ტესტი თეთრ თაგვებზე. ინფექციისთვის გამოიყენება თეთრი თაგვები, რომელთა წონაა 8-10 გ, ყოველი კვლევისთვის იღებენ 6 თაგვს, აქედან 3 ინფიცირებულია ტვინში, ხოლო 3 - კანქვეშ. თავის ტვინში ინფიცირებისას ნემსი ჩასმულია უკანა კუთხეების დამაკავშირებელი ხაზის უკან და თავის შუაში გამავალი ხაზისგან ოდნავ მოშორებით. ინფექციის ადგილი იწმინდება ალკოჰოლით. სუსპენზია შეჰყავთ დოზით 0,03 მლ. ნემსის ტვინში ღრმად შეღწევის თავიდან ასაცილებლად მის წვერზე სვამენ შემზღუდველს - რეზინის მილის პატარა ნაჭერს, რომელიც ფიქსირდება ნემსის ბოლოდან 2-3 მმ მანძილზე. კანქვეშა ინფექციის შემთხვევაში სუსპენზია შეჰყავთ ცხვირის წვერის მიდამოში (ზედა ტუჩი) დოზით 0,05 მლ. ინექციის ადგილზე ჩნდება მცირე შეშუპება. ინფიცირებულ თაგვებს ათავსებენ მინის ქილებში და აკვირდებიან 30 დღის განმავლობაში. ზე დადებითი შედეგიბიოლოგიური ნიმუშები თაგვებში, ჩვეულებრივ, ინფიცირებიდან მე-7-15 დღეს, ვითარდება პარალიზური ცოფის კლინიკა.
თავდაპირველად აღინიშნება ლეთარგია, დაბურული ქურთუკი და ერთგვარი ხუჭუჭა, ასევე მოძრაობების კოორდინაციის დარღვევა. შემდეგ მოდის უკანა კიდურების დამბლა, მოგვიანებით კი – წინა, გადაიქცევა ზოგად დამბლაში, მთავრდება სიკვდილით. დაავადების ხანგრძლივობა 2-3 დღეა.
ზოგადი დამბლის განვითარებით, თაგვებს სწირავენ ეთერის ან ქლოროფორმის ანესთეზიის გამოყენებით. მკვდარ და მოკლულ თაგვებში იხსნება კრანიალური ღრუ, ტვინი ინოკულირებულია მკვებავი საშუალებებით, რის შემდეგაც ტვინი ამოღებულია, საიდანაც ამზადებენ პრეპარატებს მიკროსკოპული და იმუნობიოლოგიური კვლევებისთვის.
არყოფნით კლინიკური გამოვლინებებიინფიცირებულ თაგვებში ცოფი ნადგურდება 30 დღის განმავლობაში. ქილები, რომელშიც ისინი ინახებოდა, კარგად არის დეზინფექცია.
ბიოლოგიური ტესტი კურდღლებზე. ბიოლოგიური ნიმუშის დასაყენებლად იღებენ 4 კურდღელს, რომელთა წონა თითო მინიმუმ 1,5 კგ. 2 კურდღელი ინფიცირებულია თავის ტვინში და 2 ინტრამუსკულარულად ბარძაყის არეში. სუსპენზია შეჰყავთ ინტრაცერებრალურად დოზით 0,2 მლ და ინტრამუსკულურად 2 მლ დოზით.
ბიოლოგიური ტესტის დადებითი შედეგით კურდღლები ავადდებიან 16-დან 21 დღემდე. ცოფის დაავადება კურდღლებში გვხვდება ჩუმად პარალიზური ფორმით ფატალური. მკვდარ კურდღლებში ტვინი ამოღებულია და შემდგომი გამოკვლევა ტარდება ისევე, როგორც თაგვების ინფიცირებისას. კურდღლებს აკვირდებიან 45-50 დღის განმავლობაში. მითითებული პერიოდის შემდეგ კურდღლებს ანადგურებენ. გალიები, რომლებშიც საცდელი ცხოველები ინახებოდა, დეზინფექციაა.
IV. ჰისტოლოგიური გამოკვლევა 1
1 დამატებით მეთოდად გამოიყენება ჰისტოლოგიური გამოკვლევა
ჰისტოლოგიური გამოკვლევისთვის იღებენ ამონის რქის, ცერებრალური ქერქის, ცერებრულის, მედულას მოგრძო ნაჭრებს და ფიქსირდება აცეტონის ერთ ან ორ პორციაში ისე, რომ ფიქსაციის ხანგრძლივობა იყოს 6-18 საათის განმავლობაში.
უმჯობესია, ფიქსაცია აცეტონში დატოვოთ მთელი ღამით. შემდეგ პათოლოგიური მასალა გადის ქსილენის ორ პორციაში თითო 30 წუთის განმავლობაში, ხოლო პარაფინის ორ პორციაში - თითო 1 საათი. მზა მონაკვეთები დეპარაფინირებულია ჩვეულებრივი მეთოდით და შეღებილია ლენცის ან ტურევიჩის მიხედვით:
შეღებვა ლენცის მიხედვით. სექციები იღებება ეოზინის ხსნარით 1-3 წუთის განმავლობაში (0,5 გ ეოზინი იხსნება 100 მლ 60 ° ეთილის სპირტი). ეოზინი სწრაფად ირეცხება წყლით და შეღებილია ლეფლერის მეთილენის ლურჯით 1 წუთის განმავლობაში, გარეცხილია წყლით, ფრთხილად აშრობს ფილტრის ქაღალდით და დიფერენცირებულია ერთეულების ხსნარით. რომელსაც ნატრიუმი აბსოლუტურ ალკოჰოლში (5 წვეთი კაუსტიკური სოდა 30 მლ ალკოჰოლზე) ღია ვარდისფერ ფერამდე. პრეპარატზე ასხამენ ძმარმჟავას ხსნარს (1 წვეთი გამყინვარების ძმარმჟავას 60 მლ აბსოლუტურ სპირტზე) და ინახება მკრთალი ლურჯი ფერის გამოჩენამდე, სწრაფად ჩამოიბანება სპირტით და იხსნება ქსილენით 4-5 წუთის განმავლობაში. ბაბეშ-ნეგრის სხეულები შეღებილია კაშკაშა წითლად ლურჯი ჩანართებით, განგლიური უჯრედების ციტოპლაზმა ღია ცისფერია;
შეღებვა ტურევიჩის მიხედვით. დეპარაფინირებული სექციები სპირტებსა და გამოხდილ წყალში გავლისთანავე იღებება ვეიგერტის ან ერლიხის ჰემატოქსილინით, ირეცხება გამოხდილი წყლით. შემდეგ შეღებეთ ფუქსინის მჟავას 1% წყალხსნარით 1 წუთის განმავლობაში და კარგად გარეცხეთ გამოხდილი წყლით, სანამ არ გამოჩნდება ღია ვარდისფერი ელფერი. გარეცხვის შემდეგ მას ამუშავებენ პიკრინის მჟავას გაჯერებული წყალხსნარის (25-30 გ პიკრინის მჟავა 1 ლიტრ ცხელ გამოხდილ წყალზე) და 96%-იანი სპირტის ნარევით (თანაბარი ნაწილებით). დამუშავების დროს შეინიშნება წითელი საღებავის ღრუბლების გამონადენი და სექციები იძენს ყვითელ ელფერს 10-20 წამის შემდეგ. სექციები სწრაფად ირეცხება წყალში და მსუბუქად აშრობენ ფილტრის ქაღალდით. შემდეგ, ისევე სწრაფად, გადის აბსოლუტური ან 96 ° სპირტით, კარბოლ-ქსილენით, სუფთა ქსილენით და მოთავსებულია ბალზამში. ბაბეშ-ნეგრის სხეულები ალუბლისფერია, უჯრედების ბირთვები შავი ან ლურჯია, იმისდა მიხედვით, თუ რომელი ჰემატოქსილინით არის შეღებილი. ბაბეშ-ნეგრის სხეულების ფორმა და ზომა ძალიან მრავალფეროვანია, ისინი განლაგებულია ციტოპლაზმაში და ნერვული უჯრედების პროცესებში მრავალრიცხოვანი ან ცალკეული ასლების სახით. უფრო ხშირად ბაბეს-ნეგრის სხეულები გვხვდება დიდ განგლიურ უჯრედებში და მათ შემცველ უჯრედებს არ აქვთ გამოხატული გადაგვარების ნიშნები.
ხშირად გვხვდება სხვა ჩანართები, რომლებიც, რიგი მსგავსი მახასიათებლების გამო, ზოგჯერ შეცდომით მიიღება ნეგრის სხეულებად. უნდა გვახსოვდეს, რომ ჯანმრთელი კატებისა და თეთრი თაგვების ტვინი ზოგჯერ შეიცავს არასპეციფიკურ აციდოფილურ ინკლუზიურ სხეულებს. ეს სხეულები შეიძლება განვასხვავოთ ნეგრის სხეულებისგან შიდა გრანულების არარსებობით და ძირითადი ნივთიერების ერთგვაროვნებით.
ცოფს ასევე ახასიათებს მწვავე ენცეფალომიელიტის ნიშნები: უპირატესად მცირე ვენების ირგვლივ გვხვდება პერივასკულარული ინფილტრატები, რომლებიც ძირითადად შედგება ლიმფოიდური უჯრედებისგან, რომლებიც უჯრედის მაფს ჰგავს.
თავის ტვინის განგლიურ უჯრედებში შეიძლება მოხდეს ქრომატოლიზი, ვაკუოლიზაცია და უჯრედების მწვავე შეშუპება, აგრეთვე ცალკეული უჯრედების სიკვდილი. დაზიანებული ნერვული უჯრედების მიდამოში გლიის პროლიფერაციული რეაქცია საკმაოდ მუდმივია, იღებს ჭეშმარიტი ნეირონოფაგის ფორმას, რასაც მოჰყვება ნერვული უჯრედების ჩანაცვლება გამრავლებული გლიის ელემენტებით. გამრავლებული უჯრედების ამგვარ დაგროვებას დაშლილი ნერვული უჯრედის ადგილზე ეწოდება "ცოფის კვანძი" - ზოგჯერ კვანძების განვითარების პროცესი შეიძლება შეინიშნოს მონაკვეთზე (1).
მეთოდოლოგიური ინსტრუქციები
ცოფის ლაბორატორიული დიაგნოსტიკა
1. ცოფის დიაგნოზი დგება ეპიზოოტოლოგიური, კლინიკური, პათოანატომიური მონაცემების კომპლექსის საფუძველზე და ძირითადად ლაბორატორიული გამოკვლევების საფუძველზე.
2. კვლევისთვის კურიერით იგზავნება ლაბორატორიაში: ახალი გვამი ან თავი ძაღლისგან (კატა, მელა, არქტიკული მელა, ცხვარი, ხბო და ა.შ.), მსხვილი ცხოველებისგან - თავი ან ტვინი (ახალი ან დაკონსერვებული). 30 - 50% გლიცერინის ხსნარში). მხოლოდ შეუნარჩუნებელი ტვინი არის შესაფერისი სეროლოგიური კვლევებისთვის.
3. ცოფის ლაბორატორიული დიაგნოსტიკა მოიცავს თავის ტვინის მიკროსკოპულ გამოკვლევას (ბაბეს-ნეგრის სხეულების აღმოსაჩენად), სეროლოგიურ გამოკვლევას (ცოფის სპეციფიური ანტიგენის გამოვლენა), აგრეთვე თეთრ თაგვებზე ან კურდღლებზე ბიოლოგიური ტესტის დაყენებას. .
კვლევის ბრძანება.
4. კვლევისთვის მიღებული ტვინიდან ისინი პირველად ითესება მკვებავ გარემოზე. თავის ტვინის ნაწილი დაუყოვნებლივ მოთავსებულია მაცივარში და ინახება ხელახალი გამოკვლევის საჭიროების შემთხვევაში. მასალა აღებულია ტვინის დანარჩენი ნაწილიდან მიკროსკოპული გამოკვლევისთვის, სეროლოგიური რეაქციებისა და ბიოლოგიური ნიმუშებისთვის.
შენიშვნა. გაკვეთა, თავის ტვინის ამოღება და სხვა სამუშაოები ტარდება სტერილურ პირობებში, პირადი პრევენციის ზომების მკაცრი დაცვით (ცხოველის თავის ძლიერი ფიქსაცია, ხელების დაცვა ორი წყვილი ხელთათმანით: ქირურგიული და ანატომიური; სათვალეების დადება. დაიცავით თვალები, ხოლო ცხვირი და პირი დაფარულია მარლის ბინტით).
I. მიკროსკოპული კვლევები
5. მიკროსკოპული გამოკვლევისთვის კეთდება ანაბეჭდები და ნაცხი ტვინის სხვადასხვა ნაწილიდან.
6. ანაბეჭდის მოსამზადებლად 4-6 ფენად დაკეცილი ფილტრის ქაღალდზე ათავსებენ თავის ტვინის ნაჭრებს (ამონის რქა, თავის ტვინის ქერქი, ტვინი, ტვინი). ამოჭრილ ზედაპირს ზედიზედ რამდენიმეჯერ (3 - 4) ეხება სუფთა შუშის სლაიდით, მსუბუქად დაჭერით მინაზე თხელი ანაბეჭდის გასაკეთებლად.
7. ნაცხი კეთდება ტვინის ერთი და იგივე უბნებიდან. ამისთვის ტვინის ნაჭრებს ფაიფურის ნაღმტყორცნებით აფქვავთ ან საცდელ მილში მინის ჯოხით ერთგვაროვანი მასის წარმოქმნამდე, საიდანაც უხეში ნაცხი კეთდება ცხიმისმცველ შუშის სლაიდზე.
თქვენ შეგიძლიათ გააკეთოთ ნაცხი სხვა გზით. ამისათვის ტვინის პატარა ნაწილს ათავსებენ შუშის სლაიდის კიდეზე, აჭედებენ მეორე ჭიქით და აწებებენ ერთი კიდედან მეორესკენ, რის შედეგადაც მიიღება თხელი ერთიანი ნაცხი ზედაპირზე. მინა.
8. მიღებული ნაცხი ან ანაბეჭდი იღებება ერთ-ერთი შემდეგი გზით:
ა) შეღებვა მურომცევის მიხედვით. დამზადებული, ჯერ კიდევ სველი ნაცხი ან ანაბეჭდი დაუყოვნებლივ ფიქსირდება ეთილის ან მეთილის სპირტში ან სპირტის ნარევში ნახევარში ეთერთან ან აცეტონთან (ქიმიურად სუფთა) 1-2 საათის განმავლობაში და შემდეგ გარეცხილია წყლით. ფიქსატორის კონტეინერი კარგად უნდა იყოს დალუქული, რათა არ მოხდეს ფიქსატორის სითხის აორთქლება. წყლით დაბანის შემდეგ სველ ნაცხებს 5-10 წუთის განმავლობაში ათავსებენ წყალში 1:40 განზავებულ მუნსონის საღებავის ხსნარში. შემდეგ საღებავს აშრობენ და მაშინვე ნაცხებს ყრიან ტანინის 10%-იან წყალხსნარში 8-10 წუთის განმავლობაში, სანამ მოლურჯო შეფერილობა არ გამოჩნდება. ამის შემდეგ ნაცხებს რეცხავენ წყლით, აშრობენ ფილტრის ქაღალდით, გადიან სპირტის თანაბარი ნაწილების აცეტონთან (ქიმიურად სუფთა) ან სპირტთან ქსილენთან ერთად და კვლავ აშრობენ ფილტრის ქაღალდით. შეღებილ ნაცხს უნდა ჰქონდეს ღია ცისფერი ფონი, ხოლო ნერვული უჯრედების ბირთვები შეღებილია ლურჯად, ხოლო ბაბეშ-ნეგრის სხეულები ღია იისფერია მუქი ჩანართებით;
ბ) გამყიდველების ლაქა. მომზადებულ სველ ანაბეჭდზე ან ნაცხზე წაისვით 4 წამის განმავლობაში რეაგენტის "A" (მეთილენის ლურჯი - 2 გ, მეთილის სპირტი აცეტონის გარეშე - 100 მლ) და რეაგენტი "B" (ძირითადი ფუქსინი - 0,5 გ, ეთილის სპირტი კვალის გარეშე) ნარევი. აცეტონი - 100 მლ). საღებავის სამუშაო ხსნარი შედგება 15 მლ რეაგენტი "A", 2 - 4 მლ რეაგენტი "B" და 25 მლ მეთილის სპირტი. შეღებვის შემდეგ პრეპარატს რეცხავენ გამდინარე წყლით და აშრობენ. შეღებილ ნაცხში ნეირონების ციტოპლაზმა ღია ცისფერია, ბირთვები მუქი ლურჯია, ერითროციტები აგურისფერია, ბაბეშ-ნეგრის სხეულები მეწამულ-წითელია სხეულების აშკარად შესამჩნევი ბაზოფილური სტრუქტურით;
გ) შეღებვა მიხინის მიხედვით. ნაცხი ან ანაბეჭდები ფიქსირდება ალკოჰოლისა და ეთერის ნარევში (თანაბრად) 5-10 წუთის განმავლობაში, რის შემდეგაც აშრობენ ფილტრის ქაღალდით და 30-40 წუთის განმავლობაში ღებულობენ Giemsa-ს საღებავით (1-2 წვეთი 1 მლ გამოხდილ წყალზე). ), სწრაფად გარეცხეთ დამჟავებული სპირტით (1 წვეთი გამყინვარების ძმარმჟავა 30 მლ 96 ° სპირტზე), შემდეგ კი წყლით, გაშრეს ფილტრის ქაღალდით და დაექვემდებარა კვლევას. თუ მასალა გლიცერინში იყო, მაშინ მას წინასწარ კარგად რეცხავენ წყალში და აშრობენ ფილტრის ქაღალდით.
შეღებილ პრეპარატში, მიკროსკოპული გამოკვლევით, ძირითადი ფონი წითელი უნდა იყოს მეწამული ელფერით. ლურჯი ტონის უპირატესობით, ნაცხი კვლავ ირეცხება მჟავე ალკოჰოლით და ირეცხება წყლით. პირამიდულ ნერვულ უჯრედებს აქვთ მოლურჯო ფერი ინტენსიურად შავი ბირთვით, ხოლო ბაბეშ-ნეგრის სხეულები მოვარდისფრო-წითელია მუქი ლურჯი ფერის წერტილოვანი ჩანართებით;
დ) შეღებვა ბორმან-გაინულინას მიხედვით. თხელი ნაცხი ან ანაბეჭდები ფიქსირდება 5 წუთის განმავლობაში შემდეგი შემადგენლობის ნარევში: სპირტი და ეთერი (თანაბრად) - 98 მლ, გლაციალური ძმარმჟავა - 2 მლ; ფიქსაციის შემდეგ 5 წუთის განმავლობაში ყრიან კრისტალური სოდის 10%-იან ხსნარში, შემდეგ რეცხავენ წყლით და აშრობენ ჰაერში. ფიქსირებული ნაცხი 2 წუთის განმავლობაში იღებება გამოყენებამდე მომზადებული საღებავით (მეთილენის ლურჯის გაჯერებული წყალხსნარი - 3 წვეთი, ფუქსინის გაჯერებული ძირითადი ხსნარი - 2 წვეთი, ონკანის წყალი - 20 მლ). საღებავის ხსნარს ასხამენ ნაცხზე, ამაგრებენ ცეცხლმოკიდებულ ცეცხლზე, შემდეგ საღებავს ტოვებენ კიდევ ერთი წუთის განმავლობაში, რის შემდეგაც მას რეცხავენ წყლით და აშრობენ ფილტრის ქაღალდით. შეღებილ ნაცხში ძირითადი ფონი უნდა იყოს ღია წითელი, ნერვული უჯრედების პროტოპლაზმა შეღებილია მოწითალო-ლურჯად, ხოლო მათი ბირთვები მუქი ლურჯია, ბაბეს-ნეგრის სხეულები შეღებილია მარწყვის წითლად, ტიპიური მარცვლოვანი სტრუქტურით. ერითროციტები უფერულ წრეებს ჰგავს.
II. სეროლოგიური კვლევები
9. დიფუზური ნალექის რეაქცია აგარის გელში. რეაქცია გამოიყენება ცოფის სპეციფიური ანტიგენის გამოსავლენად ქუჩის ცოფისგან დაღუპული ცხოველების არაკონსერვებულ ტვინში, ასევე იმ ცხოველებში, რომლებზეც ბიოანალიზი ჩატარდა. რეაქციისთვის შეგიძლიათ გამოიყენოთ შემორჩენილი (1 თვემდე) ტვინი.
რეაქცია ტარდება უცხიმო მინის სლაიდებზე, რომლებზედაც 2,5 მლ გამდნარი და გაცივებული აგარის გელი 60°C-მდე, მომზადებულია რეცეპტის მიხედვით: მშრალი აგარ-აგარი - 12 - 15 გ; ქიმიურად სუფთა ნატრიუმის ქლორიდი - 8,6 გ; მეთილის ფორთოხლის 1% ხსნარი (გაფილტრული) 50 ° სპირტზე - 5 - 10 მლ; მერტიოლატი - 0,01 გ; გამოხდილი წყალი - 1 ლ.
შენიშვნა. რეაქციის დასაყენებლად უმჯობესია გამოიყენოთ დიფკო აგარ-აგარი, ის მთლიანად იხსნება, არ არის საჭირო გარემოს ფილტრაცია. აგარ-აგარის სხვა ჯიშები საჭიროებს ფრთხილად ფილტრაციას.
აგარის გამაგრების შემდეგ მასში კეთდება ნახვრეტები 4–5 მმ შიდა დიამეტრის თხელკედლიანი ლითონის ან შუშის მილის გამოყენებით და აწყობენ შაბლონის მიხედვით (იხ. ნახ. -).
მსხვილ ცხოველებში რეაქციისთვის გამოიყენება ტვინის ნაწილაკები - ამონის რქა, ნახევარსფეროების ქერქი, ტვინი, მედულა მოგრძო; ვირთხებში, გოფერებში, ზღვის გოჭებში, ზაზუნებში და ა.შ. – ტვინის ნებისმიერი სამი ნაწილი; თაგვებს აქვთ მთელი ტვინი.
მიკრონალექის დაყენების სქემა:
მაგრამ
- ქერქი (მარცხენა ნახევარსფერო); AT- ქერქი ( მარჯვენა ნახევარსფერო); FROM- ამონის რქა (მარცხნივ);
დ- ამონის რქა (მარჯვნივ); ე- ცერებრელი; და- მედულა;
1
, 2
, 3
, 4
- გლობულინის განზავება, შესაბამისად 1:2, 1:4, 1:8, 1:16.
დადებითი RP ყველა გლობულინის განზავებით
(ცერებრალური ქერქი, ქუჩის ცოფი)
დადებითი RP გლობულინის განზავებით 1:4; 1:8, 1:16
(ამონი ძაღლის რქა, ქუჩის ცოფი)
დადებითი RP გლობულინის განზავებით 1:16,
არ არის ნალექის ხაზები 1:2, 1:4 განზავებით,
(ძაღლის ტვინი, ქუჩის ცოფი)
ტვინი იფქვება ფაიფურის ნაღმტყორცნებში ნაღმტყორცნებით ან თავის ქალაში „პასტად“, რომელიც ივსება ანტიგენისთვის ჭებით. დარჩენილი ჭები ივსება ცოფის საწინააღმდეგო გლობულინით 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 განზავებით. გამოყენებული ინგრედიენტების მოცულობაა 0.02 მლ.
კონტროლი დადებითი და უარყოფითი ანტიგენებით ერთდროულად მოთავსებულია ცალკეულ სლაიდზე იმავე აგარის გამოყენებით იმავე სტენლის გამოყენებით.
რეაქციის ინგრედიენტების შესაბამის ჭებში მოთავსების შემდეგ, შუშის სლაიდები გადაიტანება ტენიან კამერაში (პეტრის ჭურჭელი სველი ფილტრის ქაღალდით ან ბამბის ბამბით) და მოთავსებულია თერმოსტატში 6 საათის განმავლობაში 37-38 °C ტემპერატურაზე. შემდეგ კერძები რჩება ოთახის ტემპერატურაზე კიდევ 18 საათის განმავლობაში.
რეაქციის აღრიცხვა ხორციელდება მისი დაყენებიდან 3, 6 და 24 საათის შემდეგ. აგარის გაშრობის თავიდან ასაცილებლად, რეაქციის სლაიდები მოთავსებულია იმავე პეტრის ჭურჭელში, რომელიც შეიცავს დატენიანებულ ბამბას ყოველი დათვალიერების შემდეგ.
აგარის ნალექის დადებითი რეაქციით, ერთი, ორი და ძალიან იშვიათად სამი პარალელური ნალექების ხაზი შეიძლება ჩამოყალიბდეს გლობულინისა და ანტიგენის მქონე ჭებს შორის. შედეგად მიღებული ნალექის ხაზები ვიზუალურად ჩანს, როდესაც სათვალეები განათებულია ქვემოდან ზემოდან, დაახლოებით 45° კუთხით.
ნალექის რეაქციის უარყოფითი ჩვენებით მოთავსებულია ბიოანალიზი.
10. იმუნოფლუორესცენციის რეაქცია. იგი დაფუძნებულია სპეციალური მიკროსკოპით (ML-1, ML-2, ML-3 და ა.შ.) ვირუსული ანტიგენის გამოვლენაზე, რომელმაც რეაგირება მოახდინა ცოფის საწინააღმდეგო სპეციფიურ შრატთან, ეტიკეტირებული ფლუორესცენტური საღებავით.
რეაქციისთვის თხელი და თანაბარი ანაბეჭდები კეთდება სუფთა ან ახლად გაყინული ტვინის საგულდაგულოდ გასუფთავებულ ჭიქებზე. ანაბეჭდები მზადდება ტვინის ნაწილებისგან (ამონის რქა, ცერებრალური ქერქი, ტვინი, მედულლა მოგრძო) ისევე, როგორც მიკროსკოპული გამოკვლევისთვის. ტვინის თითოეული ნაწილისგან ამზადებენ მინიმუმ 4 პრეპარატს. კონტროლისთვის, წამლები ასევე მზადდება ჯანმრთელი ცხოველის ტვინისგან.
ჰაერში გაშრობის შემდეგ პრეპარატები ფიქსირდება აცეტონში 4 საათის განმავლობაში არაუმეტეს 4°C ტემპერატურაზე. ფიქსატორის კონტეინერი კარგად უნდა იყოს დალუქული, რათა არ მოხდეს ფიქსატორის სითხის აორთქლება. აცეტონით დამაგრების შემდეგ კონიუგატის (ფლუორესცენტული ცოფის საწინააღმდეგო გამა გლობულინი) რამდენიმე წვეთი გამოიყენება მუშა განზავებაში არსებულ პრეპარატებზე. შემდეგ ათავსებენ ტენიან კამერაში (პეტრის ჭურჭელი ან დახურული ემალირებული კუვეტა დატენიანებული ფსკერით) 20 - 30 წუთის განმავლობაში 25 °C ტემპერატურაზე.
ამის შემდეგ პრეპარატებს რეცხავენ წყლით ან ფოსფატის ბუფერული ხსნარით (pH 7,2 - 7,4) 1 საათის განმავლობაში, შემდეგ რეცხავენ გამოხდილი წყლით, აშრობენ ჰაერში და ექვემდებარებიან კვლევას. პრეპარატები განიხილება ჩაძირვის სისტემის ქვეშ. ჩაძირვისთვის გამოიყენება არალუმინესცენტური ზეთი.
შეღებილ პრეპარატში, ფლუორესცენტური მიკროსკოპის ქვეშ, ტვინის ქსოვილი ფლუორესცირდება (ანათებს) მოლურჯო-მოყვითალო შეფერილობით. ცოფის ვირუსის ანტიგენი გამოვლენილია პრეპარატებში სხვადასხვა ფორმისა და ზომის კაშკაშა მოყვითალო-მომწვანო ან მწვანე გრანულების სახით - ძლივს შესამჩნევიდან 15-20 მიკრონი დიამეტრის ჩათვლით.
საკონტროლო პრეპარატში ყვითელ-მწვანე ინტენსიურად მანათობელი გრანულები არ შეინიშნება.
ფლუორესცენტური ანტისხეულების მეთოდის გამოყენებით ჩატარებულ კვლევაში, ცოფის დიაგნოზი დადგენილად ითვლება, თუ მიკროსკოპის რამდენიმე ხედში ნაპოვნია სხვადასხვა ზომის კაშკაშა მომწვანო ბზინვის მქონე ტიპიური გრანულების საკმარისი რაოდენობა (მინიმუმ 10). ასეთი წარმონაქმნების კონტროლი არ უნდა იყოს.
დადებითი ფლუორესცენციის არარსებობის შემთხვევაში მოთავსებულია ბიოლოგიური ნიმუში.
III. ბიოლოგიური ნიმუში
11. ცოფის ბიოლოგიური ტესტი ტარდება მიკროსკოპული გამოკვლევისას (ბაბეს-ნეგრის სხეულები არ არის გამოვლენილი), სეროლოგიური რეაქციებით (ცოფის სპეციფიკური ანტიგენი არ არის გამოვლენილი), აგრეთვე ატიპიური ჩანართების გამოვლენისას უარყოფითი შედეგის მიღებით. ბიოლოგიური ტესტი ტარდება თეთრ თაგვებზე ან კურდღლებზე.
12. ექსპერიმენტული თაგვები ან კურდღლები ინფიცირდებიან საცდელი ტვინიდან 10%-იანი სუსპენზიით ფიზიოლოგიურ ხსნარში ან ხორც-პეპტონის ბულიონში pH 7,2 - 7,4. სუსპენზიის მოსამზადებლად გამოიყენება ტვინის იგივე ნაწილები, საიდანაც მასალა აღებულია მიკროსკოპული და სეროლოგიური კვლევებისთვის.
თავის ტვინის ამოკვეთილ ნაწილებს აგროვებენ სტერილურ სინჯარაში და აწონიან, შემდეგ საფუძვლიანად ფქვავენ ნაღმტყორცნებით ნაღმტყორცნებით, რის შემდეგაც უმატებენ ფიზიოლოგიურ ფიზიოლოგიურ ხსნარს ან ხორც-პეპტონის ბულიონს 10%-იანი სუსპენზიის მისაღებად. მიღებული სუსპენზია ნებადართულია 10 წუთის განმავლობაში და ზედმეტად გამოიყენება ინფექციისთვის.
თუ პათოლოგიური მასალა იყო დაბინძურებული, მაშინ ზენატანს ასხამენ სხვა ჭურჭელში (სატესტო მილში) და მას უმატებენ 500-1000 სე პენიცილინს და სტრეპტომიცინს 1 მლ სითხეზე, რის შემდეგაც ნებადართულია კიდევ 30 წუთი გაჩერდეს. ოთახის ტემპერატურაზე და შემდეგ გამოიყენება ინფექციისთვის. სუსპენზია უნდა მომზადდეს სტერილურ პირობებში და პირადი პრევენციის წესების მკაცრი დაცვით.
ბიოლოგიური ტესტი თეთრ თაგვებზე. ინფექციისთვის გამოიყენება თეთრი თაგვები, რომელთა წონაა 8-10 გ, ყოველი კვლევისთვის იღებენ 6 თაგვს, აქედან 3 ინფიცირებულია ტვინში, ხოლო 3 - კანქვეშ. თავის ტვინში ინფიცირებისას ნემსი ჩასმულია უკანა კუთხეების დამაკავშირებელი ხაზის უკან და თავის შუაში გამავალი ხაზისგან ოდნავ მოშორებით. ინფექციის ადგილი იწმინდება ალკოჰოლით. სუსპენზია შეჰყავთ დოზით 0,03 მლ. ნემსის ტვინში ღრმად შეღწევის თავიდან ასაცილებლად მის წვერზე სვამენ შემზღუდველს - რეზინის მილის პატარა ნაჭერს, რომელიც ფიქსირდება ნემსის ბოლოდან 2-3 მმ მანძილზე. ზე კანქვეშა ინფექციასუსპენზია შეჰყავთ ცხვირის წვერის მიდამოში (ზედა ტუჩის) დოზით 0,05 მლ. ინექციის ადგილზე ჩნდება მცირე შეშუპება. ინფიცირებულ თაგვებს ათავსებენ მინის ქილებში და აკვირდებიან 30 დღის განმავლობაში. თაგვებზე ბიოლოგიური ტესტის დადებითი შედეგით, ჩვეულებრივ, ინფიცირებიდან მე-7-15 დღეს, ვითარდება პარალიზური ცოფის კლინიკა.
თავდაპირველად აღინიშნება ლეთარგია, დაბურული ქურთუკი და ერთგვარი ხუჭუჭა, ასევე მოძრაობების კოორდინაციის დარღვევა. შემდეგ მოდის უკანა კიდურების დამბლა, მოგვიანებით კი – წინა, გადაიქცევა ზოგად დამბლაში, მთავრდება სიკვდილით. დაავადების ხანგრძლივობა 2-3 დღეა.
ზოგადი დამბლის განვითარებით, თაგვებს სწირავენ ეთერის ან ქლოროფორმის ანესთეზიის გამოყენებით. მკვდარ და მოკლულ თაგვებში იხსნება კრანიალური ღრუ, ტვინი ინოკულირებულია მკვებავი საშუალებებით, რის შემდეგაც ტვინი ამოღებულია, საიდანაც ამზადებენ პრეპარატებს მიკროსკოპული და იმუნობიოლოგიური კვლევებისთვის.
ინფიცირებულ თაგვებში ცოფის კლინიკური გამოვლინების არარსებობის შემთხვევაში, ისინი ნადგურდებიან 30 დღის განმავლობაში. ქილები, რომელშიც ისინი ინახებოდა, კარგად არის დეზინფექცია.
ბიოლოგიური ტესტი კურდღლებზე. ბიოლოგიური ნიმუშის დასაყენებლად იღებენ 4 კურდღელს, რომელთა წონა თითო მინიმუმ 1,5 კგ. 2 კურდღელი ინფიცირებულია თავის ტვინში და 2 ინტრამუსკულარულად ბარძაყის არეში. სუსპენზია შეჰყავთ ინტრაცერებრალურად დოზით 0,2 მლ და ინტრამუსკულურად 2 მლ დოზით.
ბიოლოგიური ტესტის დადებითი შედეგით კურდღლები ავადდებიან 16-დან 21 დღემდე. ცოფის დაავადება კურდღლებში ვლინდება ჩუმი პარალიზური ფორმით, ფატალური შედეგით. მკვდარ კურდღლებში ტვინი ამოღებულია და შემდგომი გამოკვლევა ტარდება ისევე, როგორც თაგვების ინფიცირებისას. კურდღლებს აკვირდებიან 45-50 დღის განმავლობაში. მითითებული პერიოდის შემდეგ კურდღლებს ანადგურებენ. გალიები, რომლებშიც საცდელი ცხოველები ინახებოდა, დეზინფექციაა.
IV. ჰისტოლოგიური გამოკვლევა 1
1 დამატებით მეთოდად გამოიყენება ჰისტოლოგიური გამოკვლევა
ჰისტოლოგიური გამოკვლევისთვის იღებენ ამონის რქის, ცერებრალური ქერქის, ცერებრულის, მედულას მოგრძო ნაჭრებს და ფიქსირდება აცეტონის ერთ ან ორ პორციაში ისე, რომ ფიქსაციის ხანგრძლივობა იყოს 6-18 საათის განმავლობაში.
უმჯობესია, ფიქსაცია აცეტონში დატოვოთ მთელი ღამით. შემდეგ პათოლოგიური მასალა გადის ქსილენის ორ პორციაში თითო 30 წუთის განმავლობაში, ხოლო პარაფინის ორ პორციაში - თითო 1 საათი. მზა მონაკვეთები დეპარაფინირებულია ჩვეულებრივი მეთოდით და შეღებილია ლენცის ან ტურევიჩის მიხედვით:
შეღებვა ლენცის მიხედვით. მონაკვეთებს ღებავენ ეოზინის ხსნარით 1-3 წუთის განმავლობაში (0,5 გ ეოზინი იხსნება 100 მლ 60%-იან ეთილის სპირტში). ეოზინი სწრაფად ირეცხება წყლით და შეღებილია ლეფლერის მეთილენის ლურჯით 1 წუთის განმავლობაში, გარეცხილია წყლით, ფრთხილად აშრობს ფილტრის ქაღალდით და დიფერენცირებულია ერთეულების ხსნარით. რომელსაც ნატრიუმი აბსოლუტურ ალკოჰოლში (5 წვეთი კაუსტიკური სოდა 30 მლ ალკოჰოლზე) ღია ვარდისფერ ფერამდე. პრეპარატზე ასხამენ ძმარმჟავას ხსნარს (1 წვეთი გამყინვარების ძმარმჟავას 60 მლ აბსოლუტურ სპირტზე) და ინახება მკრთალი ლურჯი ფერის გამოჩენამდე, სწრაფად ჩამოიბანება სპირტით და იხსნება ქსილენით 4-5 წუთის განმავლობაში. ბაბეშ-ნეგრის სხეულები შეღებილია კაშკაშა წითლად ლურჯი ჩანართებით, განგლიური უჯრედების ციტოპლაზმა ღია ცისფერია;
შეღებვა ტურევიჩის მიხედვით. დეპარაფინირებული სექციები სპირტებსა და გამოხდილ წყალში გავლისთანავე იღებება ვეიგერტის ან ერლიხის ჰემატოქსილინით, ირეცხება გამოხდილი წყლით. შემდეგ შეღებეთ ფუქსინის მჟავას 1% წყალხსნარით 1 წუთის განმავლობაში და კარგად გარეცხეთ გამოხდილი წყლით, სანამ არ გამოჩნდება ღია ვარდისფერი ელფერი. გარეცხვის შემდეგ მას ამუშავებენ პიკრინის მჟავას გაჯერებული წყალხსნარის (25-30 გ პიკრინის მჟავა 1 ლიტრ ცხელ გამოხდილ წყალზე) და 96%-იანი სპირტის ნარევით (თანაბარი ნაწილებით). დამუშავების დროს შეინიშნება წითელი საღებავის ღრუბლების გამონადენი და სექციები იძენს ყვითელ ელფერს 10-20 წამის შემდეგ. სექციები სწრაფად ირეცხება წყალში და მსუბუქად აშრობენ ფილტრის ქაღალდით. შემდეგ, ისევე სწრაფად, გადის აბსოლუტური ან 96 ° სპირტით, კარბოლ-ქსილენით, სუფთა ქსილენით და მოთავსებულია ბალზამში. ბაბეშ-ნეგრის სხეულები ალუბლისფერია, უჯრედების ბირთვები შავი ან ლურჯია, იმისდა მიხედვით, თუ რომელი ჰემატოქსილინით არის შეღებილი. ბაბეშ-ნეგრის სხეულების ფორმა და ზომა ძალიან მრავალფეროვანია, ისინი განლაგებულია ციტოპლაზმაში და ნერვული უჯრედების პროცესებში მრავალრიცხოვანი ან ცალკეული ასლების სახით. უფრო ხშირად ბაბეს-ნეგრის სხეულები გვხვდება დიდ განგლიურ უჯრედებში და მათ შემცველ უჯრედებს არ აქვთ გამოხატული გადაგვარების ნიშნები.
ხშირად გვხვდება სხვა ჩანართები, რომლებიც, რიგი მსგავსი მახასიათებლების გამო, ზოგჯერ შეცდომით მიიღება ნეგრის სხეულებად. უნდა გვახსოვდეს, რომ ჯანმრთელი კატებისა და თეთრი თაგვების ტვინი ზოგჯერ შეიცავს არასპეციფიკურ აციდოფილურ ინკლუზიურ სხეულებს. ეს სხეულები შეიძლება განვასხვავოთ ნეგრის სხეულებისგან შიდა გრანულების არარსებობით და ძირითადი ნივთიერების ერთგვაროვნებით.
ცოფს ასევე ახასიათებს მწვავე ენცეფალომიელიტის ნიშნები: უპირატესად მცირე ვენების ირგვლივ გვხვდება პერივასკულარული ინფილტრატები, რომლებიც ძირითადად შედგება ლიმფოიდური უჯრედებისგან, რომლებიც უჯრედის მაფს ჰგავს.
თავის ტვინის განგლიურ უჯრედებში შეიძლება მოხდეს ქრომატოლიზი, ვაკუოლიზაცია და უჯრედების მწვავე შეშუპება, აგრეთვე ცალკეული უჯრედების სიკვდილი. დაზიანებული ნერვული უჯრედების მიდამოში გლიის პროლიფერაციული რეაქცია საკმაოდ მუდმივია, იღებს ჭეშმარიტი ნეირონოფაგის ფორმას, რასაც მოჰყვება ნერვული უჯრედების ჩანაცვლება გამრავლებული გლიის ელემენტებით. გამრავლებული უჯრედების ამგვარ დაგროვებას დაშლილი ნერვული უჯრედის ადგილზე ეწოდება "ცოფის კვანძი" - ზოგჯერ კვანძების განვითარების პროცესი შეიძლება შეინიშნოს მონაკვეთზე (1).
მსგავსი სტატიები
-
ინგლისური - საათი, დრო
ყველას, ვისაც აინტერესებს ინგლისური ენის შესწავლა, მოუწია უცნაურ აღნიშვნებს გვ. მ. და ა. მ , და საერთოდ, სადაც დროა ნახსენები, რატომღაც მხოლოდ 12 საათიანი ფორმატი გამოიყენება. ალბათ ჩვენთვის მცხოვრები...
-
"ალქიმია ქაღალდზე": რეცეპტები
Doodle Alchemy ან Alchemy ქაღალდზე Android-ისთვის არის საინტერესო თავსატეხი ლამაზი გრაფიკით და ეფექტებით. ისწავლეთ როგორ ითამაშოთ ეს საოცარი თამაში და იპოვეთ ელემენტების კომბინაციები, რათა დაასრულოთ ალქიმია ქაღალდზე. Თამაში...
-
თამაშის ავარია Batman: Arkham City?
თუ თქვენ წინაშე აღმოჩნდებით, რომ Batman: Arkham City ანელებს, ავარია, Batman: Arkham City არ დაიწყება, Batman: Arkham City არ დაინსტალირდება, არ არის კონტროლი Batman: Arkham City, არ არის ხმა, გამოდის შეცდომები. ზევით, ბეტმენში:...
-
როგორ მოვიშოროთ ადამიანი სათამაშო აპარატებიდან როგორ მოვიშოროთ ადამიანი აზარტული თამაშებისგან
მოსკოვის Rehab Family კლინიკის ფსიქოთერაპევტთან და აზარტულ თამაშებზე დამოკიდებულების მკურნალობის სპეციალისტთან რომან გერასიმოვთან ერთად, რეიტინგის ბუკმეიკერებმა სპორტულ ფსონებში მოთამაშეს გზა გაუკვლიეს - დამოკიდებულების ჩამოყალიბებიდან ექიმთან ვიზიტამდე,...
-
Rebuses გასართობი თავსატეხები თავსატეხები გამოცანები
თამაში "RIDDLES Charades Rebuses": პასუხი განყოფილებაში "RIDDLES" დონე 1 და 2 ● არც თაგვი, არც ჩიტი - ის ხარობს ტყეში, ცხოვრობს ხეებზე და ღრღნის თხილს. ● სამი თვალი - სამი ბრძანება, წითელი - ყველაზე საშიში. დონე 3 და 4 ● ორი ანტენა თითო...
-
შხამისთვის თანხების მიღების პირობები
რამდენი თანხა მიდის SBERBANK-ის ბარათის ანგარიშზე გადახდის ოპერაციების მნიშვნელოვანი პარამეტრებია სახსრების დაკრედიტების პირობები და ტარიფები. ეს კრიტერიუმები, პირველ რიგში, დამოკიდებულია თარგმანის არჩეულ მეთოდზე. რა პირობებია ანგარიშებს შორის თანხის გადარიცხვისთვის