RABIA DIAGNÓSTICO RÁPIDO

Métodos para detectar antígenos. En caso de rabia para diagnóstico rápido, se pueden utilizar métodos de anticuerpos fluorescentes (MFA), reacciones de precipitación (RP) en gel de agar, métodos de inmunoensayo enzimático (ELISA), reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se requieren varias pruebas para diagnosticar la rabia en humanos in vivo.

Determinación de anticuerpos contra antígenos del virus de la rabia. La detección de anticuerpos en suero sanguíneo o líquido cefalorraquídeo es un importante método de diagnóstico. Las pruebas serológicas de anticuerpos específicos contra la rabia se llevan a cabo en suero sanguíneo para determinar la vacunación antes y después de la exposición y determinar el momento de la inmunización de refuerzo para aumentar la respuesta inmunitaria.

Aislamiento de virus. Para el aislamiento e identificación del virus se utiliza el método de bioensayo en ratones blancos. El material de prueba se suspende en una solución fisiológica que contiene antibióticos y suero bovino fetal. La suspensión se administra por vía intracerebral a ratones blancos que pesan entre 5 y 6 g Para comprobar el desarrollo de la infección, los ratones se observan diariamente hasta el día 30 después de la inoculación. Los ratones que desarrollan la enfermedad durante este período se sacrifican inmediatamente y los tejidos cerebrales se examinan mediante MFA directo.

La ventaja de este enfoque es la capacidad de detectar pequeñas cantidades de virus de la rabia en el material. La desventaja del método es la necesidad de esperar muchos días (7 a 18 días) entre la inoculación y la manifestación de los primeros signos de la enfermedad. Para reducir el período de incubación, se utilizan ratones lactantes. Los ratones de menos de 3 días se pueden utilizar para diagnósticos rápidos: en ratones sacrificados después de 3 días, el antígeno del virus ya se detecta en el cerebro, que puede detectarse mediante MFA.

Este método de aislamiento del virus se practica como prueba diagnóstica confirmatoria de resultados negativos para la detección de antígeno y cuerpos de Babes-Negri y en el caso de mordedura de una persona por un animal sospechoso de rabia. Proporciona sensibilidad y especificidad adecuadas, es decir, se considera al nivel de importancia diagnóstica del método de inmunofluorescencia directa. Además, este método es el principal para la identificación de variantes de virus y es prometedor para el desarrollo de reactivos de diagnóstico.

Aislamiento e identificación de virus en cultivo celular.. La principal desventaja del aislamiento del virus durante la infección de animales de laboratorio es la duración del método. Esto se puede evitar mediante el uso de cultivos celulares. Por lo general, se usa un cultivo de células de neuroblastoma de ratón para estos fines si es necesario examinar tejidos cerebrales. El cerebro se suspende en un medio nutritivo de cultivo, la suspensión se aplica a una monocapa de cultivo celular y se incuba durante uno a varios días.

La sensibilidad de un cultivo determinado al virus se puede aumentar tratándolo con DEAE dextrano. A continuación, se lava la monocapa celular, se fija en frío con acetona o una mezcla de formalina y metanol y se examina por inmunofluorescencia. Si el animal estaba infectado con el virus de la rabia, entonces se detectan inclusiones citoplásmicas del antígeno del virus de la rabia en la monocapa de cultivo celular.

Se demostró que el antígeno del virus de la rabia se puede detectar en células de neuroblastoma de ratón Na C1 300 en combinación con MFA después de 2 días. La sensibilidad del método es comparable a la del aislamiento del virus en ratones.

Aunque el virus de la rabia tiene una neuropatogenicidad obligada in vivo, es capaz de infectar una amplia gama de células huésped in vitro, que pueden usarse para probar otros tejidos y órganos para detectar la presencia del virus de la rabia. Se ha establecido que el virus de la rabia se multiplica en células BHK-21 y Vero, en células primarias de embriones de pollo o riñones de hámster. Se ha demostrado que la adsorción del virus y su introducción en la célula se produce en 7 horas. Después de 24-48 horas, se forman nuevas partículas virales dentro de la célula, después de 72 horas brotan de la membrana celular al espacio intercelular.

Métodos de búsqueda

Para diagnóstico express de rabia puede ser usado:

un método IFA- para detectar el antígeno del virus de la rabia en las huellas de la córnea o la nuca de un paciente que contenga folículos pilosos;
b) método PCR- para detectar el ARN del virus en muestras de biopsia de tejido, saliva, líquido cefalorraquídeo o lagrimal;
c) método ELISA- para detectar anticuerpos específicos (antígeno) en pacientes con un curso típico o atípico.
d) método bioensayos- para aislar el virus en las primeras etapas de la enfermedad o para detectar anticuerpos en la sangre o en el líquido cefalorraquídeo en las últimas etapas de la enfermedad. Para diagnósticos rápidos método complejo(bioensayo + MFA), que consiste en infectar ratones recién nacidos de 2 días con el material de prueba y examinar su cerebro los días 3-4 en MFA.

La elección de los métodos de diagnóstico in vivo depende en gran medida de la etapa de la enfermedad: un método basado en la detección de antígenos, por regla general, es muy sensible al final del período de incubación, durante los primeros días de la enfermedad, mientras que los anticuerpos neutralizantes del virus suelen aparecer en el líquido cefalorraquídeo y sangre sérica después de 7-10 días desde el inicio de la enfermedad.

Reacción de inmunofluorescencia. El método se basa en el uso de anticuerpos unidos a un colorante, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína. RIF se usa ampliamente para detectar antígenos virales en el material de los pacientes y para un diagnóstico rápido.

El método tiene el más alto grado de sensibilidad, es la base para el diagnóstico rápido y permite detectar antígenos virales en pocas horas.

Las principales ventajas de MFA son: velocidad de ejecución, alta especificidad (100%). El tiempo dedicado al diagnóstico de la enfermedad con su ayuda es inferior a un día. Se utilizan versiones directas e indirectas del MFA.

Inmunofluorescencia directa sigue siendo el método preferido para el diagnóstico de la rabia. Los portaobjetos que contienen frotis: impresiones de tejidos cerebrales o vasos con una monocapa de cultivo de tejidos se fijan en acetona durante 1 a 4 horas. A continuación, las preparaciones se secan y se tratan con anticuerpos antinucleocápside policlonales fluorescentes (reactivo inmunofluorescente).

Este reactivo es un conjugado preparado a partir de anticuerpos policlonales de clase IgG específicos contra el antígeno de la nucleocápside del virus e isocianato de fluoresceína (FITC). Los anticuerpos específicos se obtienen por hiperinmunización de animales (conejos, hámsters o caballos) con una mezcla de epítopos de nucleocápside del virus.

En la actualidad, los anticuerpos monoclonales de ratón contra la nucleocápside del virus de la rabia se utilizan cada vez más para estos fines. Después de una incubación de 30 minutos a 37 °C, las preparaciones de diagnóstico se lavan repetidamente con solución salina y agua destilada.

Los anticuerpos marcados con FITC se fijan solo en los sitios de localización de los antígenos de nucleoproteína viral. A continuación, las preparaciones se secan al aire y se examinan al microscopio óptico utilizando una lámpara de xenón y un filtro apropiado como fuente de luz.

A versión indirecta el antígeno se combina primero con suero inmune específico no teñido. A continuación, los complejos antígeno-anticuerpo no fluorescentes formados se exponen a suero inmunitario marcado con fluorocromo que contiene anticuerpos contra proteínas séricas específicas. La versión indirecta del MFA, junto con la detección del antígeno, permite cuantificar los anticuerpos en el suero de prueba al diluirlo adecuadamente.

Las formaciones marcadas con FITC en células de diferentes tejidos se detectan como tinción fluorescente amarillo-verde sobre un fondo oscuro (en forma de inclusiones intracitoplasmáticas redondas u ovaladas).

Ensayo inmunoabsorbente ligado. El método se basa en el principio de sorción de proteínas en la fase sólida seguida de la formación de complejos antígeno-anticuerpo detectados por una solución sustrato-indicador. El antígeno añadido a los pocillos se une específicamente a los anticuerpos. Los sueros de prueba se aplican a la capa de antígeno en las diluciones requeridas. En presencia de anticuerpos específicos en ellos, estos últimos se unen al antígeno. Para detectar la unión, se aplica a la capa de anticuerpo inmunoglobulina contra globulinas de suero humano conjugadas con peroxidasa de rábano picante. La cantidad de conjugado de sorción es proporcional a la cantidad de suero humano unido al antígeno. Esto se puede determinar utilizando una solución indicadora (ortofenililendiamina + peróxido de hidrógeno), cuyos componentes, como resultado de la acción de la peroxidasa conjugada, tiñen el líquido de color marrón amarillento. Al examinar casos poco claros, el uso de ELISA además de los métodos de RP o RSK le permite aumentar la confiabilidad del diagnóstico de laboratorio de la rabia, debido a la alta sensibilidad de este método. El método permite detectar partículas infecciosas y defectuosas.

Para determinar anticuerpos antirrábicos durante la vacunación, se puede utilizar un método ELISA indirecto, utilizando un virus purificado como antígeno, y para determinar anticuerpos de clase IgG en suero humano, proteína A de Staphylococcus asociada a peroxidasa de rábano picante. Los resultados de ELISA son comparables a los obtenidos en pruebas de neutralización viral en ratones. El método permite detectar la presencia de IgM al inicio del proceso de inmunización.

Los métodos inmunoenzimáticos son muy prometedores para la detección del antígeno de la nucleocápside del virus durante el diagnóstico post-mortem en tejidos cerebrales. Entre ellos, por ejemplo, se encuentra un método ELISA rápido para el diagnóstico de la rabia, basado en la preparación de placas sensibilizadas con anticuerpos del isotipo IgG frente a la nucleocápside del primer serotipo, diluidos en tampón carbonato.

El material de prueba se homogeneiza en tampón o medio de cultivo, se aclara por centrifugación, se agrega a los pocillos y se incuba en placas. El antígeno de la nucleocápside fijado con anticuerpos específicos se identifica añadiendo un conjugado de peroxidasa con anticuerpos antirrábico antinucleocápside de diferente especificidad de especie y un sustrato cromogénico. La sensibilidad del método es de 0,8 a 1,0 ng/ml.

Este método puede detectar antígenos de virus de varios serotipos. El uso de conjugados de anticuerpos específicos de nucleocápside marcados con biotina aumenta la sensibilidad del método a 0,1-0,2 ng/ml.

El antígeno de la nucleocápside se detecta con éxito mediante ELISA, pero el material, incluso descompuesto, no debe fijarse con formalina.

método de reacción en cadena de la polimerasa. Para el diagnóstico rápido del virus de la rabia y la identificación de los lyssavirus, el método más conveniente es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El método PCR es el método más confiable y rápido para aislar el ARN del virión de cualquier muestra que contenga el virus en una concentración baja. Con él, puedes crear muchas copias del virus de ARN. Este método se utiliza para confirmar los resultados de MFA y para detectar el virus en la saliva, los folículos pilosos de la nuca y la cabeza.

La PCR se basa en el principio de la replicación natural del ADN. La esencia del método es repetición repetida ciclos de síntesis (amplificación) de una secuencia de ADN específica de virus utilizando una polimerasa de ADN Taq termoestable y dos cebadores específicos, los llamados cebadores.

Cada ciclo consta de tres etapas con diferentes condiciones de temperatura. En cada ciclo, se duplica el número de copias de la región sintetizada. Los fragmentos de ADN recién sintetizados sirven como molde para la síntesis de nuevas hebras en el siguiente ciclo de amplificación, lo que permite acumular un número suficiente de copias de la región de ADN seleccionada en 25-35 ciclos para su determinación, generalmente mediante gel de agarosa. electroforesis

Sensibilidad particularmente alta de la PCR cuando se utilizan cebadores complementarios al gen N, cuando es posible detectar el ARN del virus en muestras que contienen el virus en un título de 10 MLD50. El método PCR puede detectar el ARN del virus incluso en material patológico descompuesto.

Actualmente, se han desarrollado y se utilizan ampliamente en la práctica pruebas confirmatorias (confirmatorias), como la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR). El método RT-PCR es altamente sensible y más eficiente. El ARN se extrae de los tejidos del órgano infectado por el virus, se transcribe en ADNc, que luego se amplifica mediante PCR. La RT-PCR requiere cebadores obtenidos para regiones conservativas del genoma del virus de la rabia. Normalmente, se utilizan genes que codifican una nucleoproteína o una proteína N.

El método PCR es altamente específico y muy sensible. Es uno de los más pruebas precisas la detección del antígeno de la rabia permite diagnosticar la rabia incluso si hay al menos un virión en el material. La prueba se basa en la finalización complementaria de la plantilla de ARN, realizada in vitro utilizando la enzima ARN polimerasa. En los últimos años, la PCR se ha utilizado cada vez más para diagnosticar y controlar infecciones virales. Sin embargo, la técnica es compleja, costosa y aún no suficientemente unificada para su uso rutinario.

Actualmente, los métodos citológicos tienen limitaciones valor de diagnóstico, pero aún debe usarse para una serie de infecciones. Se examinan materiales de autopsia, biopsias, frotis que, después del procesamiento apropiado, se tiñen y analizan bajo un microscopio. En la rabia, es la detección de inclusiones en el citoplasma de las células (cuerpos de Babes-Negri).

Aislamiento de virus. El aislamiento del virus puede ser necesario para confirmar los resultados de las pruebas de antígenos y caracterizar aún más los aislamientos. Y aunque este método es uno de los métodos de diagnóstico más antiguos y que consume más tiempo, hoy en día el aislamiento del virus con la identificación posterior utilizando uno de los métodos modernos (ELISA con anticuerpos monoclonales o PCR) es el método de diagnóstico más confiable, el llamado. "Estándar dorado".

La eficacia de los métodos de diagnóstico de la rabia puede variar según una serie de factores (etapa de la enfermedad, momento del muestreo del material, calidad de las muestras obtenidas, condiciones de almacenamiento, experiencia del personal, calidad de los reactivos, etc.). Si un resultado positivo confirma la rabia, un resultado negativo no siempre indica la ausencia de la enfermedad. Por lo tanto, para la rabia, los expertos de la OMS recomiendan el uso de varias pruebas, especialmente MFA en combinación con un bioensayo en ratones blancos recién nacidos (2-3 días).

Medidas de prevención personal

Todo trabajo con material sospechoso de contener el virus de la rabia, así como con animales sospechosos de tener rabia, debe realizarse respetando las medidas de seguridad personal. trabajadores médicos y los veterinarios deben trabajar con batas, guantes, máscaras.

Al final del trabajo, las cajas se tratan con una solución de peróxido de hidrógeno al 3%.

Los viales, ampollas y herramientas, así como los materiales restantes que contienen el virus de la rabia, y todos los utensilios después del trabajo se desinfectan en autoclave durante 1 hora a 1,5 atm (modo de eliminación).

Fondos protección personal desinfectado por ebullición o autoclave. La superficie de trabajo de la mesa y las manos se desinfectan con una solución desinfectante (solución de cloramina al 0,5%).

La rabia (R) es una enfermedad aguda de los animales de sangre caliente caracterizada por daño al sistema nervioso central. Los animales domésticos y salvajes de todo tipo, así como los humanos, son susceptibles.

La enfermedad está registrada en varias regiones del globo. No hubo casos de propagación de la enfermedad en Australia, Gran Bretaña, Japón. La enfermedad casi siempre termina en la muerte. De hecho, hay casos documentados de recuperación de la rabia en humanos y perros después de una infección experimental.

El virus de la rabia (virus de la rabia) pertenece a la familia Rhabdoviridae, género Lyssavirus. Ahora se ha establecido que VB tiene 4 serotipos, lo que aparentemente se debe a la diferencia en la composición de las proteínas de membrana. Todas las variantes de VB están inmunobiológicamente relacionadas, pero difieren en virulencia. WB tiene propiedades GA y GAD. Existe una relación lineal entre la actividad infecciosa y GA. Los animales inmunizados contra la rabia producen anticuerpos VNA, KSA, antiHA y líticos (que destruyen las células infectadas con el virus en presencia del complemento).

El diagnóstico se realiza en base a datos epidemiológicos, síntomas de la enfermedad, cambios patológicos (son de menor importancia) y, principalmente, los resultados investigación de laboratorio.

Diagnóstico de laboratorio consiste en el estudio del cerebro de animales para la detección de AG viral en IF, RDP, la detección de cuerpos de Babes-Negri y un bioensayo en ratones blancos.

A Federación Rusa en la actualidad, la producción de kits para el diagnóstico de B en IF y RDP se ha organizado en VNITIBP y KazNIVI.

Aislamiento del virus. Los cadáveres frescos de animales pequeños se envían al laboratorio para su investigación, de animales grandes: la cabeza o el cerebro. En algunos casos, se permite el enlatado de sesos en glicerina al 50%. El cadáver o la cabeza deben empacarse cuidadosamente en una bolsa de plástico, el cerebro, en un frasco con un tapón de vidrio esmerilado o de goma, lleno de parafina. El material se envasa en un recipiente a prueba de humedad. Solo los cerebros sin conservantes son adecuados para estudios virológicos. Debe recordarse que la autopsia, la extracción del cerebro y otras operaciones con material patológico deben realizarse en condiciones de esterilidad y observancia estricta de las medidas de prevención personal: fijar firmemente la cabeza del animal, proteger las manos con 2 pares de guantes ( quirúrgica y anatómica), colóquese anteojos para proteger los ojos y en la nariz y la boca, una venda de gasa de 6 capas.

Investigación de laboratorio de materiales la rabia se lleva a cabo fuera de turno; los resultados se informan inmediatamente al médico de la granja y al médico jefe del distrito (ciudad).

Indicación e identificación de virus. El orden de la investigación: de cada parte del cerebro de los lados izquierdo y derecho (cuerno de Amón, cerebelo, corteza cerebral y oblongata), se preparan 4 frotis para IF y detección de cuerpos de Babesh-Negri; con tejido cerebral poner RDP; con resultados negativos, se coloca un bioensayo.

Detección de cuerpos de inclusión específicos. Los frotis de impresión se tiñen de acuerdo con Sellers, Muromtsev u otros métodos. Después de la tinción, las preparaciones se observan bajo un microscopio óptico con un sistema de inmersión. La presencia de cuerpos específicos de Babesh-Negri se considera un resultado positivo (cuando se tiñe según Sellers - formaciones granulares ovaladas u oblongas claramente definidas de color rosa-rojo en el protoplasma, cuando se tiñe según Muromtsev - violeta claro con inclusiones azul oscuro de Babesh -Cuerpos de Negri, más a menudo se encuentran fuera de las células nerviosas.

El rasgo más característico de los cuerpos de Babesh - Negri es su estructura interna, que permite diferenciarlos con absoluta precisión. En el interior se ven pequeños granos: granos basófilos de color azul oscuro, incluso negro, de 0,2 a 0,5 micrones de tamaño.

Generalmente se reconoce el valor diagnóstico de la detección de cuerpos de inclusión para la evidencia de infección por WB. Sin embargo, en animales sanos, especialmente en gatos y ratones blancos, existen formaciones cuya presencia puede causar dificultades de diagnóstico. En algunos casos, en el cerebro del gato, es posible diferenciar con confianza dichas inclusiones de los cuerpos de Babes-Negri, y aquí se recomienda utilizar métodos de identificación, especialmente IF. De manera similar, en perros que murieron como resultado de envenenamiento con veneno de serpiente o daño descarga eléctrica, se pueden encontrar cuerpos de inclusión que se asemejan a los cuerpos de Babes-Negri. Los cuerpos de Babesh-Negri se detectan solo en el 65-85% de los casos de rabia, por lo que su ausencia no es una respuesta negativa, y el material se examina en otras pruebas (IF, RDP, bioensayo).

SI. Una de las principales pruebas en el diagnóstico de B. Con un desempeño altamente calificado se obtiene un 99-100% de coincidencia con el método de bioensayo. Por lo general, en la práctica de diagnóstico, se utiliza el método directo de IF, que se lleva a cabo utilizando Ig fluorescente antirrábica. La fijación de las preparaciones en acetona enfriada (8-10°C) se lleva a cabo durante al menos 4 horas.Se utilizan frotis-improntas del cerebro de ratones blancos sanos como control negativo. Los resultados se tienen en cuenta visualmente en un microscopio fluorescente basado en la evaluación de la intensidad del resplandor del complejo AG-AT. AH VB se detecta como gránulos de color amarillo verdoso o verde brillante varias formas y valores en las celdas (más a menudo fuera de las celdas). El diagnóstico se considera establecido si se encuentra un número suficiente (al menos 10) de gránulos típicos con un brillo verde brillante o muchos puntos diminutos en varios campos de visión.En el control, no debería haber tal brillo.

Para probar la especificidad de la fluorescencia del complejo AG-AT, se utiliza el método de supresión de IF, que consiste en la capacidad de los AG de la rabia asociados a AT no fluorescentes para no recombinarse con AT específicos fluorescentes. Para ello, se aplica Ig antirrábica no fluorescente al 5% a preparaciones fijas preparadas a partir del cerebro en estudio, se incuban durante 30 minutos a 37°C en cámara húmeda, se lavan con solución salina y luego se tiñen con antirrábico fluorescente. Ig por el método directo convencional. No debe haber fluorescencia en las preparaciones tratadas de esta manera.

El método IF permite detectar WB en las células de la córnea de los ojos y hacer un diagnóstico preliminar in vivo: durante la enfermedad de los animales, así como 1-2 días o más antes de su manifestación clínica. El método se puede utilizar para estudiar animales sospechosos de la enfermedad B, así como perros y gatos clínicamente sanos que han mordido a personas y animales. Para ello se preparan improntas a partir de la córnea, observando todas las normas de seguridad personal, abriendo la fisura palpebral del animal con un gran y dedos índices y ligeramente abultado globo ocular presione la superficie del portaobjetos de vidrio, retrocediendo 0,5 cm desde el final. Es necesario asegurarse de que el animal no parpadee con el tercer párpado, ya que las células epiteliales se eliminan del vidrio y se obtiene un frotis de mala calidad. Se hacen al menos 2 preparaciones que contienen 2 impresiones de cada ojo. Para el control, se preparan impresiones corneales de animales sanos de manera similar. Se pueden cocinar en la granja. Las impresiones se secan al aire, se fijan en acetona durante 4 horas a 4°C, se envasan y se envían al laboratorio. Preparaciones de tinción, como en IF, según el método generalmente aceptado.

En preparaciones obtenidas de animales enfermos o al final del período de incubación de la enfermedad, en el citoplasma de muchas células epiteliales, Diferentes formas gránulos brillantemente luminosos de diferentes tamaños, desde puntos similares al polvo hasta 2 micras y más. Con el propósito de obtener resultados confiables en cada preparación se examinan de 50 a 100 células y, en total, al menos de 200 a 400 células del animal. Los resultados de la microscopía se consideran positivos si se encuentran 11% o más de células con focos característicos de luminiscencia en las huellas de la córnea del animal. Debe tenerse en cuenta que en las preparaciones de animales sanos (control), debido a la autofluorescencia, puede haber células individuales con focos de forma y luminiscencia similares.

Es importante señalar que la IF permite acelerar la respuesta al diagnóstico final por bioensayo, ya que el diagnóstico de B solo puede establecerse entre los 4 y 8 días después de la infección de los ratones con el material de prueba, y periodo de incubación las enfermedades de los ratones pueden alcanzar los 20 días. IF puede detectar WB en los tejidos de la glándula salival submandibular. Los frotis se preparan a partir de las glándulas salivales submandibulares, tomando material de al menos 6 partes diferentes de la glándula, ya que la distribución del virus en ella es desigual. A menudo, para obtener una impresión, hay que aplicar una fuerte presión, porque debido a la abundancia de mucina, queda poco material en el vidrio.

Se demostró la posibilidad de identificar VB en la piel por el método IF, para lo cual se toman muestras del cuero cabelludo, así como de folículos pilosos sensoriales y táctiles del hocico o papilas sensoriales laterales (en la mejilla del perro). Las muestras se almacenan a -20 o -70 °C. A partir de ellos se realizan criosecciones, que se tratan con globulina fluorescente. Los resultados del análisis IF obtenidos a partir de la identificación de VB en la piel se correlacionan en alto grado con los datos obtenidos del estudio del cerebro del mismo animal. Se mostró una estrecha correlación entre la detección del virus AH en muestras de cerebro y tejidos labiales por el método IF.

RDP. Se utiliza para detectar AH VB en el cerebro no conservado de animales que murieron de rabia callejera o ratones utilizados en un bioensayo. El RDP se coloca por el micrométodo en portaobjetos de vidrio utilizando un gel de agar al 1-1,5% según el método generalmente aceptado. El mayor porcentaje de resultados positivos se detecta cuando se utiliza la siguiente plantilla: A - cuerno de amonio ( Lado derecho); B - corteza cerebral (lado derecho); C - cerebelo (lado derecho);
D - bulbo raquídeo (lado derecho); + (más) - control positivo; - (menos) - control negativo; 1, 2, 3, 4 - pocillos con dilución de inmunoglobulina específica 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, respectivamente

Con unas pinzas se prepara una masa pastosa homogénea de cada parte del cerebro, que se coloca en los pocillos correspondientes. De los ratones, se examina todo el cerebro. De las regiones cerebrales del lado izquierdo, se prepara AG de manera similar (para cada examen, se requieren un total de 4 portaobjetos de vidrio con gel de agar). La reacción se tiene en cuenta después de 6, 24, 48 horas Si hay 1 o 2-3 líneas de precipitación entre pocillos que contienen AG e inmunoglobulina, la reacción se considera positiva.

RDP es simple de realizar y específico, pero el porcentaje de detección de AG viral en el material de prueba es 45-70. En el estudio del cerebro de ratones obtenido con un bioensayo positivo, RDP revela hasta el 100% de los casos. La ausencia de cuerpos de Babesh-Negri, fluorescencia específica y RDP negativo en el material de prueba no justifican la exclusión de la presencia del virus. En este caso, el diagnóstico final se basa en los resultados de un bioensayo en ratones blancos, seguido de la identificación del virus.

bioensayo. Generalmente se acepta que un bioensayo es más metodo efectivo que la detección de cuerpos de Babesh - Negri, IF, etc. Sin embargo, en algunos casos resultó negativa, a pesar de la confirmación del diagnóstico de B por la detección de cuerpos de inclusión y IF. El porcentaje de resultados negativos del bioensayo osciló entre 1,3 y 12.

La información sobre la diferente eficiencia de un bioensayo puede explicarse por una serie de factores: la elección de un animal de experimentación, su número en el experimento, el método de infección, el método y el período de almacenamiento del material antes de ingresar al laboratorio. El fenómeno de interferencia de partículas infecciosas con partículas inactivas también puede desempeñar un papel si se utiliza material insuficientemente diluido para la inoculación.

en el cerebro y glándulas salivales zorros y zorrillos que murieron de rabia, se encontró una sustancia que inhibe la infectividad del virus, lo que no permite diagnosticar la enfermedad en estos animales por infección intracerebral de ratones. La presencia de una sustancia inhibidora en el material de prueba no impide la detección de AG viral por el método IF; para mofetas y zorros, este es el método de diagnóstico más sensible.

De los animales de todas las especies (conejos, conejillos de indias, ratones blancos adultos y hámsteres) utilizados para el bioensayo, muchos prefieren los ratones lactantes porque son más sensibles a las diferentes cepas de VB y menos peligrosos para trabajar. Los hámsters sirios no son inferiores a los ratones en sensibilidad, pero son menos accesibles.

RSK. La detección de HA específicos en RSK en el diagnóstico de la rabia se usa con menos frecuencia que otros métodos. AG se prepara a partir del cerebro enviado para investigación. Para ello, se tritura tejido cerebral (especialmente rico en AG, ligantes del complemento, trozos de tálamo y tronco encefálico) en tampón veronal en una proporción de 1:10 y se deja a temperatura ambiente durante 1 hora, tras lo cual se remueve la suspensión. inactivado a 56°C durante 5 horas Este tratamiento mata el virus y elimina la anticomplementariedad del tejido cerebral sin dañar el antígeno específico. La suspensión se centrifuga durante 15 min a 3500 min-1 del sobrenadante, que es un material para probar la presencia de AG, se preparan diluciones crecientes al doble de 1:2 a 1:64 y se utilizan para investigación en el CSC .

ELISA. En ELISA, la tinción específica de AG en las células cerebrales de los animales que murieron de rabia se detecta tanto en muestras frescas almacenadas en glicerol como en muestras almacenadas sin glicerol a 20 ° C durante 8-18 horas. el diagnóstico de rutina de la rabia en animales, para detectar AG WB en cortes de tejido en parafina durante la fijación de preparaciones con solución de formalina al 10% con pH 5,3 y posterior tratamiento de preparaciones incluidas en parafina con pepsina.

A diferencia de la ROP en ratones y en cultivos celulares, ELISA puede detectar AT en animales en unas pocas horas, ELISA es el método de laboratorio más prometedor para detectar AT e indicar el virus en sí. Un método rápido para el diagnóstico de la rabia es la técnica de captura y el método IF para la detección de AH BB. Se ha demostrado que el método de detección de AH VB en cortes parafinados por el método de la peroxidasa-antiperoxidasa es significativamente superior al método ELISA. En 1987, se creó un kit de inmunodiagnóstico rápido enzimático de la rabia (RREID), adecuado para estudios epidemiológicos y de laboratorio.

Identificación de variantes mediante mAT. Con la ayuda de mAb para glicoproteínas WB, se seleccionaron variantes de AG, entre las cuales se identificaron variantes fenotípicamente termolábiles (avirulentas). Al usar 2 grupos de mAbs, se demostró que las cepas de dilución difieren de las uds. Fixe (Pasteur), CVS, Flury HEP, ERA y cepas "duck" para determinantes AH. El estudio de 7 cepas aisladas de pacientes con personas B utilizando mAbs permitió identificar ciertas diferencias entre ellas y la cepa vacunal en relación con los determinantes de AH.

En general, se acepta que las diferencias de AT entre cepas silvestres pueden detectarse usando mAbs contra AT N de nucleocápside, que reaccionan con inclusiones citoplásmicas de células infectadas por virus; anti-glicoproteínas (G AG), que reaccionan con las membranas de las células infectadas, lisan estas células en presencia del complemento y neutralizan el virus. En relación con la posible variabilidad de AH de la glicoproteína de superficie WB de diferentes áreas geográficas, se utilizó como AG protector una ribonucleoproteína caracterizada por el conservadurismo de la estructura AG. Así, no sólo la proteína G, sino también RNP VB tienen actividad protectora.

Serodiagnóstico y diagnóstico retrospectivo. Estos métodos no son típicos para la rabia, ya que se utilizan únicamente con el fin de probar la inmunidad posterior a la vacunación. Para la detección y titulación de anticuerpos posvacunales se utiliza el pH, que se establece por el método generalmente aceptado. Se utiliza un WB fijo como AG. RN en células BHK-21 fue más sensible que IF indirecta para detectar AT en los sueros de zorros vacunados. Además, se han propuesto RTGA y ELISA.

RTGA. Todavía no ha encontrado una amplia aplicación en la práctica diagnóstica debido a la presencia de inhibidores no específicos en el suero sanguíneo, a los que WB es muy sensible y, lo que es más importante, GA AG, que no se sometió a una purificación suficiente, tenía baja sensibilidad. Para la preparación de HA AG WB, se propone utilizar uds. Moscow creció en cultivo de células VNK-21 después del tratamiento con saponina seguido de purificación y concentración. HA se separa de otros componentes del virión por ultracentrifugación. La preparación resultante tenía un grado de purificación del 99,92%, presentaba una alta actividad GA (1:128), bien conservada durante 1 mes a pH 5-9.

Antes de establecer la RTGA, se debe realizar una tripsinización doble moderada de los eritrocitos de ganso para su sensibilización. Cuando se usa una suspensión al 0,25% de eritrocitos tripsinizados (preferiblemente 10 7 células por 1 ml), la sensibilidad de RTGA aumenta 4 veces. Para diluir AG y sueros, se usa una solución de sal de borato (pH 9) con la adición de albúmina de suero bovino al 0,4%. Se prepara una suspensión de eritrocitos en solución salina de pH ácido, de forma que tras combinar con una mezcla de virus y sueros cuyo pH es 9, el pH final quedaría dentro de 6,2. Después de añadir la suspensión de eritrocitos a los pocillos, se agita el panel, se sella con una película transparente y se coloca en hielo. Los resultados de RTHA se tienen en cuenta después de 40-50 minutos, y con eritrocitos de pollos o monos rhesus de 2 días, después de 1-1,5 horas.

Se ha desarrollado un radioinmunoensayo basado en la capacidad de AT para unirse a 125 1-AG WB marcado. La IgG marcada aislada de suero hiperinmune antirrábico se puede utilizar para detectar WB AG con RIA en fase sólida. Los mejores resultados se obtuvieron utilizando una solución de sal de fosfato (pH 6,0) con una fuerza iónica de 0,01 M y marcada IgG con una actividad de 200-250 mil pulsos / min.

El RIA competitivo en fase sólida es aplicable para la detección de anticuerpos antirrábicos en suero y sobrenadantes de hibridomas.

Diagnóstico diferencial. Es necesario excluir la enfermedad de Aujeszky, en la que los animales enfermos no son agresivos, no hay perversión del apetito. En perros, se excluye la forma nerviosa de la peste. La rabia se sospecha en la encefalomielitis infecciosa equina. Un complejo de pruebas de laboratorio le permite hacer un diagnóstico preciso de la rabia. Sugirió Nuevo método diferenciación de varias cepas de VB, basada en la escisión restrictiva de productos de amplificación en PCR del segmento del gen N.

CONSEJO INTERESTATAL DE NORMALIZACIÓN. METROLOGIA Y CERTIFICACION

CONSEJO INTERESTATAL DE NORMALIZACIÓN. METROLOGIA Y CERTIFICACION

INTERESTATAL

ESTÁNDAR

ANIMALES

Edición oficial

Forma estándar

Prefacio

Los objetivos, los principios básicos y el procedimiento básico para llevar a cabo el trabajo de estandarización interestatal están establecidos por GOST 1.0 - 92 “Sistema de estandarización interestatal. Fundamentos de las disposiciones” y GOST 1.2-2009 “Sistema de normalización interestatal. Normas interestatales. reglas y recomendaciones para la estandarización interestatal. Reglas de desarrollo. aceptación, solicitud, renovación y cancelación".

Sobre el estándar

1 DESARROLLADO por el Estado Federal institución presupuestaria"Todo ruso Centro Estatal calidad y estandarización medicamentos para animales y piensos" (FGBU "VGNKI")

2 PRESENTADO por la Agencia Federal de Regulación Técnica y Metrología de la Federación Rusa

3 ADOPTADO por el Consejo Interestatal de Normalización, Metrología y Certificación (Acta del 27 de junio de 2013 No. 57-P)

Nombre abreviado del país según MK (ISO 3166) 004-97	Código de país nº MK (ISO 3166) 004-97	Nombre abreviado del organismo nacional de normalización
		Ministerio de Economía de la República de Armenia
Bielorrusia		Estándar estatal de la República de Bielorrusia
Kirguistán		Estándar kirguís
		Moldavia-estándar
		Gosstandart
Uzbekistán		Uzsgandart

4 Por orden de la Agencia Federal de Regulación Técnica y Metrología del 30 de septiembre de 2013 No. 1127-st, el estándar interestatal GOST 26075-2013 entró en vigencia como el estándar nacional de la Federación Rusa a partir del 1 de enero de 2015

5 EN LUGAR DE GOST 26075-54

La información sobre los cambios a este estándar se publica en el índice de información publicado anualmente "Estándares nacionales", y el texto de los cambios y enmiendas, en el índice de información publicado mensualmente "Estándares nacionales". En caso de revisión (reemplazo) o cancelación de esta norma, se publicará el aviso correspondiente en el índice de información publicada mensualmente "Normas Nacionales". La información relevante, las notificaciones y los textos también se colocan en sistema de informacion uso general - en el sitio web oficial de la Agencia Federal de Regulación Técnica y Metrología en Internet

© Standartinform, 2014

En la Federación Rusa, este estándar no se puede reproducir total o parcialmente. reproducido y distribuido como publicación oficial sin el permiso de la Agencia Federal de Regulación Técnica y Metrología

ESTÁNDAR INTERESTATAL

ANIMALES

Métodos para el diagnóstico de laboratorio de la rabia.

Métodos de Diagnóstico de Laboratorio de la Rabia

Fecha de introducción - 2015 - 01 - 01

1 área de uso

Esta norma se aplica a todas las especies de mamíferos y establece los siguientes métodos para el diagnóstico de laboratorio de la rabia:

Método de anticuerpos fluorescentes (MFA);

Método para aislar el virus de la rabia en un cultivo celular de neuroblastoma de ratón CCL-131 (o neurinoma del nódulo de Gasser de la rata - NGUK-1);

Bioensayo en ratones blancos:

Método de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA);

Reacción de precipitación por difusión (RDP).

notas

1 Estos métodos son aplicables a todos los miembros del género Lyssavwus.

2 El virus de la rabia callejera pertenece a los microorganismos de la 2ª clase de patogenicidad (presenta un peligro mortal para humanos y animales).

3 Si es necesario, el genotipado del virus de la rabia utilizando sistemas de prueba se utiliza el método de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).

2 Referencias normativas

Esta norma utiliza referencias normativas a las siguientes normas:

GOST ISO/IEC 17025 - 2009 Requerimientos generales a la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración

GOST 12.0.004 - 90 Sistema de normas de seguridad en el trabajo. Organización de la formación en seguridad laboral. Provisiones generales

GOST 12.1.005-68 Sistema de normas de seguridad laboral. Requisitos sanitarios e higiénicos generales para el aire del área de trabajo

GOST 12.1.008 - 76 Sistema de normas de seguridad ocupacional. seguridad biológica. Requerimientos generales

GOST 12.4.011 - 89 Sistema de normas de seguridad ocupacional. Medios de protección para los trabajadores. Requisitos generales y clasificación

GOST 17.0.0.01 - 76 Sistema de estándares en el campo de la protección de la naturaleza y la mejora del uso de los recursos naturales. Puntos clave

GOST 177-88 Peróxido de hidrógeno. Especificaciones GOST 2603 - 79 Reactivos. Acetona. Especificaciones GOST 2768 - 84 Acetona técnica. Especificaciones GOST 4204 - 77 Reactivos. Ácido sulfúrico. Especificaciones GOST 6709 - 72 Agua destilada. Especificaciones.

GOST ISO 7218 - 2011 Microbiología productos alimenticios y alimentos para animales. Requisitos generales y recomendaciones para estudios microbiológicos

GOST 8074 - 82 Microscopios instrumentales. Tipos, parámetros básicos y tamaños. Requerimientos técnicos.

GOST 9147 - 80 Cristalería y equipo de laboratorio de porcelana. Especificaciones GOST 9284-75 Portaobjetos de microscopio. Especificaciones GOST 12026 - 76 Papel de filtro de laboratorio. Especificaciones GOST 13739-78 Aceite de inmersión para microscopía. Requerimientos técnicos. Métodos de prueba

GOST 16317-87 Electrodomésticos de refrigeración. Especificaciones generales

GOST 21241-69 Pinzas médicas. Especificaciones generales.

GOST 22967 - 90 jeringas de inyección médica reutilizable. Requisitos técnicos generales y métodos de ensayo

GOST 24661 - 91 (ISO 7866 84) Jeringas de inyección de un solo uso

GOST 25046 - 81 (ISO 7864-81) Agujas de inyección de un solo uso. Dimensiones principales. Requerimientos técnicos. Métodos de prueba

GOST 25336 - 82 Cristalería y equipo de laboratorio. Tipos, parámetros básicos y dimensiones.

GOST 29230 - 91 (ISO 835-4-81) Cristalería de laboratorio. Pipetas graduadas. Parte 4. Pipetas de soplado

Nota: al usar este estándar, es recomendable verificar la validez de los estándares de referencia en el sistema de información pública, en el sitio web oficial de la Agencia Federal de Regulación Técnica y Metrología en Internet o de acuerdo con el índice de información anual "Estándares nacionales". , que se publicó a partir del 1 de enero del año en curso, y lo ediciones del índice de información mensual "Estándares Nacionales" para el año en curso. Si se reemplaza (modifica) el estándar de referencia, al usar este estándar, debe guiarse por el estándar de reemplazo (modificado). Si la norma de referencia se cancela sin reemplazo, la disposición en la que se hace referencia a la misma se aplica en la medida en que esta referencia no se vea afectada.

3 Términos, definiciones y abreviaturas

3.1 Los siguientes términos se utilizan en esta norma con sus respectivas definiciones:

3.1.1 rabia enfermedad infecciosa de humanos y animales causada por miembros de la familia Rhabdoviridae del género Lyssavirus (rhabdovirus) que resulta en resultado letal en el 100% de los casos.

3.1.2 virus de la rabia: Patógeno enfermedad infecciosa hombre y animales.

3.1.3 Estructuras proteicas superficiales del antígeno del virus de la rabia contra las que se producen anticuerpos.

3.1.2 método de anticuerpos fluorescentes (MFA): método para detectar el antígeno del virus de la rabia con anticuerpos antirrábicos marcados con eotiocianato de fluoresceína, con la formación de complejos de inclusión luminosa característicos que se detectan en el campo de visión de un microscopio fluorescente .

3.1.3 método para el aislamiento del virus de la rabia en cultivo celular de neuroblastoma murino CCL-131 (o neurinoma del ganglio de Gasser de rata - NGUK-1): Método para el aislamiento del antígeno del virus de la rabia. basado en la reproducción del virus en cultivo celular y su identificación por el método de anticuerpos fluorescentes.

3.1.3 bioensayo: Método para aislar el virus de la rabia en ratones blancos inyectándoles una suspensión de material patológico, seguido de la identificación del virus por el método de anticuerpos fluorescentes.

3.1.4 método de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para detectar el antígeno del virus de la rabia en función de su interacción específica con un anticuerpo antirrábico inmovilizado en un soporte sólido, seguida de la detección del antígeno unido mediante un segundo anticuerpo marcado con enzima mediante la tinción del producto de reacción con un cromógeno.

3.1.5 prueba de precipitación por difusión (RDP): método para la detección del virus de la rabia basado en la capacidad de los anticuerpos y el antígeno viral de la rabia para difundirse en un gel de agar y, tras una interacción específica, formar un complejo antígeno-anticuerpo visible al desnudo. ojo en forma de línea de precipitación.

3.1.6 Método de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) para detectar el genoma del virus de la rabia mediante la traducción de la secuencia específica de ARN del virus en ADN, seguido de copias repetidas del ADN resultante y detección de productos de reacción, realizado in vitro .

3.2 En esta norma se utilizan las siguientes abreviaturas:

FAG - inmunoglobulina antirrábica fluorescente;

ANG - globulina antirrábica;

CFG - globulina fluorescente de control;

PBS - solución tampón de fosfato;

NGUK-1-neurinoma del nódulo de Gasser de la rata;

FITC - isotiocinato de fluoresceína:

ARN - ácido ribonucleico:

ADN - ácido desoxirribonucleico:

CCN31 - cultivo de células de neuroblastoma de ratón:

OFD - ortofenildiamina;

TMB - tetrametilbencidina.

4 Condiciones de investigación y requisitos de seguridad

4.1 Condiciones de la investigación

4.1.1 Requisitos generales para el análisis microbiológico y el trabajo con microorganismos de los grupos de patogenicidad I - II, según GOST ISO 7218.

4.1.2 Requisitos generales para locales - según GOST ISO 7218.

4.1.3 Requisitos para el personal: según GOST ISO 7218, GOST ISO / IEC 17025. (1).

Los empleados calificados con experiencia en el trabajo con microorganismos de los grupos de patogenicidad I-II, que han estudiado los métodos de trabajo microbiológico, pueden realizar investigaciones. vacunado contra la rabia.

4.2 Requisitos de seguridad

4.2.1 Requisitos generales de seguridad para el trabajo de acuerdo con GOST 12.1.008.

4.2.2 El equipo de protección para los trabajadores debe cumplir con los requisitos de GOST 12.4.011.

4.2.3 El aire del área de trabajo debe cumplir con los requisitos de GOST 12.1.005.

4.2.4 Capacitación del personal de seguridad laboral de acuerdo con GOST 12.0.004.

4.2.5 Disposición del material obtenido para el estudio, así como equipos de protección personal usados, herramientas, etc. llevado a cabo por ebullición durante 30 min o autoclave durante 15 min a una presión de (0,11 ± 0,20) MPa.

5 Instrumentos de medida, equipos, materiales, reactivos y animales

5.1 Para uso en investigación:

Espectrofotómetro de barrido con un rango espectral de longitudes de onda de 190 a 1100 nm con un error de no más de ± 0,5 nm y un rango de mediciones de densidad óptica (DO) de 0,1 a 3,0;

Placas para reacciones inmunológicas de 96 pocillos:

Termostato que mantiene la temperatura desde 20"-C hasta 50°C:

Refrigerador doméstico, que proporciona mantenimiento de temperatura de 0 ° C a 10 ° C según GOST 16317:

centrífuga de laboratorio;

baño de agua;

Microscopio luminiscente invertido según GOST 8074:

Morteros de porcelana con pistilo según GOST 9147 u homogeneizador según GOST ISO/IEC 17025;

Diapositivas según GOST 9284:

Tubos de ensayo de vidrio según GOST 25336;

placas de Petri según GOST 25336;

Cubeta según GOST 25336;

Pipetas con una capacidad de 1,0; 2,0 y 10,0 cm 3 según GOST 29230;

Pipetas automáticas de 0,05 a 0,20 cm 3 de capacidad con puntas:

Pinzas médicas según GOST 21241:

Jeringas de insulina con una capacidad de 1,0 cm 3 según GOST 22967 o GOST 24861;

Agujas de inyección según GOST 25046:

Copas de cultivo para ocho hoyos;

Jaulas para tener ratones;

Acetona según GOST 2603 o GOST 2768;

Inmunoglobulina antirrábica fluorescente (FAG);

Globulina antirrábica (AnG);

Control de globulina fluorescente (CFG);

Aceite de inmersión no fluorescente según GOST 13739;

Agua destilada según GOST 6709;

Solución tampón de fosfato con una concentración molar de 0,01 mol/dm 3 (PBS). pH 7,2 - 7,4;

- solución estéril de cloruro de sodio al 0,9% isotónica:

Cultivo celular de neuroblastoma murino CC31 o nódulo de Gasser no erinoma de la rata -

Penicilina;

Estreptomicina;

MEM de aguja mediana con doble juego de aminoácidos y vitaminas (DMEM), pH 7,2;

solución de tripsina al 0,25%;

Suero de sangre embrionaria de bovino para cultivos celulares 10%;

Glutamina 3%;

Peróxido de hidrógeno al 3% según GOST 177;

Un conjunto de preparados para el diagnóstico de laboratorio de la rabia animal por ELISA;

Una solución de ácido sulfúrico con una concentración molar de 2 mol / dm 3 según GOST 4204;

Papel de filtro según GOST 12026;

Sello para hacer pozos;

mertiolato;

Agar "Difko" o similar;

Solución de naranja de metilo al 1% en etanol al 50%:

Antígenos positivos y negativos;

Suero antirrábico o inmunoglobulina;

Ratones blancos clínicamente sanos con un peso de 6-8 g.

5.2 Se permite el uso de otros instrumentos de medida con características metrológicas y equipos con características técnicas no peores, así como reactivos y materiales de calidad no inferior a los indicados anteriormente. Se permite vajilla desechable.

6 Muestreo

6.1 Para realizar investigaciones sobre la presencia del virus de la rabia, se envía material patológico al laboratorio: un cadáver fresco o cabeza de animales pequeños, la cabeza o cerebro de animales grandes.

6.2 El material patológico seleccionado para la investigación se envasa en un recipiente a prueba de humedad y se entrega al laboratorio en recipientes metálicos. El material congelado se coloca en un criocontenedor.

6.3 El material patológico se acompaña de un documento que contiene los siguientes datos; nombre y domicilio del remitente, tipo de animal, anamnésicos y datos clínicos y elieotológicos.

6.4 Los estudios de laboratorio se realizan inmediatamente después de recibir material patológico.

6.5 Para la investigación, se toman piezas de tejido de cada parte del cerebro (cuernos de Amón, cerebelo, corteza cerebral, bulbo raquídeo) de 0,5 - 1,0 cm de tamaño de animales grandes. El cerebro de animales pequeños, como ratones, se examina como entero.

Solo las muestras de tejido cerebral frescas o recién congeladas son adecuadas para el estudio de MFA y el método de aislamiento del virus de la rabia en un cultivo celular de neuroblastoma de ratón CCL-131 (o NGUK-1). Las muestras de cerebro animal que se están descomponiendo (en la etapa de deterioro), preservadas con glicerol, fijadas con alcohol metílico, formalina u otros medios que promuevan la aparición de fluorescencia no específica no están permitidas para la investigación.

Para configurar un bioensayo, se permite utilizar muestras de cerebro conservadas en una solución de glicerol al 30% -50% *. No se permite el uso de otros conservantes. Para la conservación, el material patológico se puede congelar a una temperatura que no exceda menos 10 C.

7 Método de anticuerpos fluorescentes (MFA)

7.1 Esencia del método

La esencia del método de los anticuerpos fluorescentes radica en la interacción específica de los anticuerpos antirrábicos fluorescentes con el antígeno homólogo del virus de la rabia. El complejo antígeno-anticuerpo resultante se marcó con FITC. se detecta visualmente por un brillo característico en el campo de visión cuando se observa bajo un microscopio fluorescente.

7.2 Preparación para el estudio

7.2.1 Preparación de muestras

7.2.1.1 Se preparan al menos tres preparaciones (improntas o frotis) de cada parte del cerebro a partir de trozos de tejido seleccionados de acuerdo con 6.5 en portaobjetos de vidrio cuidadosamente desengrasados. Si la condición del material patológico lo permite, se preparan impresiones, en otros casos se hacen frotis.

7.2.1.2 Preparación de impresiones

Piezas de tela seleccionadas según 6.5. poner en papel de filtro doblado en cuatro a seis capas. El cerebro de los animales pequeños se corta transversalmente, capturando todos sus departamentos, y se coloca con el lado cortado hacia arriba sobre papel de filtro doblado en cuatro a seis capas. La superficie cortada se toca con un portaobjetos de vidrio, presionándolo ligeramente hasta obtener una fina impresión en el vidrio.

7.2.1.3 Preparación de frotis

Un trozo de tejido de cada parte del cerebro (en animales pequeños todo el cerebro), seleccionado de acuerdo con 6.5. se frota en un mortero de porcelana con un mazo hasta que se forma una masa homogénea, a partir de la cual se hacen frotis en portaobjetos de vidrio.

7.2.1.4 Como control, se toman muestras o impresiones de los cerebros de ratones blancos sanos, libres de rabia y no vacunados, como se describe en 7.3.1.2 y 7.3.1.3.

7.2.1.5 Después de la preparación, las extensiones o impresiones se secan al aire durante 20 a 30 minutos. fijado en acetona enfriada a una temperatura de 4'C durante 4 - 12 horas oa una temperatura de menos 20 * C durante 1 hora, después de lo cual se retira de la acetona y se seca al aire durante 10 - 15 mJ.

7.2.2 Preparación de reactivos

MARICÓN. Ang y KFG se disuelven con agua destilada al volumen inicial indicado en la etiqueta de la ampolla. Periodo de validez de los ácidos grasos disueltos. AnH y CFG a una temperatura de (5 ± 2) C, no más de dos semanas.

Directamente para el estudio, la cantidad necesaria de FAG disuelto. AnG y KFG se diluyen con FBI a la dilución de trabajo indicada en la etiqueta de la ampolla. Diluciones de trabajo de FAG disueltos. Ang y CFG se utilizan el día de la preparación.

7.3 Realización del estudio

Los portaobjetos con preparaciones (frotis o impresiones) según 7.2.1 se colocan en una cámara húmeda (placa de Petri o cubeta con fondo humedecido). Luego, una de las tres preparaciones preparadas se recubre con FAG en una dilución de trabajo uniformemente sobre toda la superficie del frotis o impresión usando una pipeta. La dilución de trabajo de KFG se aplica a la segunda preparación. Cierra la cámara con drogas. colocado en un termostato a una temperatura de (37 ± 1) * C y mantenido durante 30

mín. Las preparaciones de control se tiñen en paralelo. Al final de la tinción, las preparaciones se lavan tres veces, sumergiéndolas cada vez durante 10 min en un recipiente con PBS. enjuague con agua destilada y seque al aire durante 20-30 minutos.

La dilución de trabajo de Ang se aplica a la tercera preparación. colocado en un termostato a una temperatura de (37 ± 1) * C e incubado durante 30 minutos. Luego se lava la preparación tres veces, sumergiendo cada vez durante 10 min en un recipiente con PBS. enjuagado con agua destilada, secado al aire durante 20 - 30 min y teñido con dilución de trabajo de FAG. como se describió anteriormente.

7.4 Manejo de resultados

En las preparaciones teñidas, el tejido cerebral no afectado por el virus de la rabia brilla tenuemente. amarillo grisáceo.

El antígeno del virus de la rabia se detecta en las neuronas y en el exterior de las células en forma de gránulos de color verde brillante de varias formas y tamaños, desde apenas perceptibles hasta con un diámetro de 15 a 20 micrones. A veces hay una gran cantidad de pequeñas partículas de color verde brillante (hasta 1 micrón de tamaño) de forma redonda y ovalada.

El diagnóstico de rabia se considera establecido si se encuentran gránulos de color verde amarillento típicos en la preparación estudiada en varios campos de visión del microscopio. Al mismo tiempo, en preparados de control (en frotis o improntas de cerebro de ratones blancos sanos sin rabia, teñidos con FAG), así como en los preparados estudiados, teñidos con CFG y pretratados con AnG y teñidos con FAG. tales formaciones no deberían existir.

Los resultados del estudio se comunican a las autoridades competentes de acuerdo con el procedimiento vigente en el territorio del estado que adoptó la norma.

8 caso de un resultado negativo, los estudios se realizan en 8 o 9.

8 Método para el aislamiento del virus de la rabia en cultivo celular de neuroblastoma de ratón CCL-131

8.1 Esencia del método

La esencia del método radica en el aislamiento del virus de la rabia en cultivo de células de ratón.

neuroblastoma CCL-131 o NGUK-1 con su posterior identificación por el método de anticuerpos fluorescentes.

El método es una alternativa al bioensayo en ratones blancos según 9.

8.2 Preparación para el estudio

8.2.1 Preparación de muestras

Partes iguales de tejido extraído estérilmente de cada parte del cerebro de un animal pequeño (cuernos de Amón, cerebelo, corteza cerebral, bulbo raquídeo), o trozos de tejido de cada parte del cerebro de un animal grande, tomados según 6.5. triturado con tijera y molido en mortero u homogeneizador, añadiendo gradualmente una solución isotónica de cloruro de sodio al 0,9% estéril hasta obtener una suspensión al 10%. Se añaden penicilina y estreptomicina a la suspensión de cerebro según unidades US/cm 3 y 1 mg/cm 3 respectivamente.

La suspensión resultante se mezcla a fondo y se centrifuga durante 5-10 minutos a una velocidad de 2000 rpm. El líquido sedimentario anterior se transfiere a un tubo de ensayo estéril y se almacena a una temperatura que no exceda los 4 °C hasta su uso.

8.2.2 Preparación de portaobjetos de cultivo

Se extrae un cultivo diario de células de neuroblastoma de ratón CCL-131 (o NGUK-1) del matraz de cultivo utilizando una solución de tripsina al 0,25 % y se diluye con medio DMEM con suero bovino fetal al 10 % y glutamina al 3 % hasta una concentración de 2 * 10 s de células /cm 3 . Se añade 0,1 cm 3 de la suspensión celular resultante a los pocillos de vidrio de cultivo, se tapan con una tapa y se colocan en una incubadora húmeda de CO g con un contenido de CO del 5 % a una temperatura de (37 ± 1) °C durante 18- 20 horas

8.3 Realización del estudio

Se añaden 0,05 cm 3 de suspensión de cada parte del cerebro a dos pocillos de vidrio de cultivo según 8.2.2. Se dejan dos pocillos en cada portaobjetos para un control positivo y otro negativo. Una suspensión del cerebro de un ratón infectado con el virus de la rabia - cepa CVS se usa como control positivo. Se introduce una suspensión del cerebro de un ratón clínicamente sano como control negativo. El cultivo de vidrio se coloca en una incubadora de CO2 húmedo con un contenido de CO2 del 5 % a una temperatura de (37 ± 1) *C durante 42 a 48 horas.

Al final de la incubación, se retira el medio de los pocillos del vaso de cultivo con una pipeta automática, las células se lavan una vez con PBS (con una pipeta automática, se añaden 0,2 cm 3 de solución a cada pocillo) y se secan en un flujo de aire laminar durante 20 - 30 minutos. A continuación, se añade a cada pocillo 0,1 cm 3 de acetona enfriada a una temperatura de -20*C y se deja a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Después de la fijación de las células, el vidrio de cultivo se invierte y se agita para eliminar la acetona, y luego se seca en un flujo de aire laminar durante 20 a 30 min. Con un bisturí y unas pinzas, retire la boquilla de plástico y seque el vaso durante otros 5-10 minutos. Se añaden 0,05 - 0,10 cm 3 de FAG a cada pocillo en una dilución de trabajo (seleccionada empíricamente) preparada en el FBI. se colocó en una placa de Petri húmeda y se incubó a (37 ± 1) C durante 30 min.

Al final de la tinción, los portaobjetos se lavan tres veces, sumergiéndolos durante 10 min cada vez en un recipiente con PBS. Luego, las preparaciones se enjuagan con agua destilada y se secan al aire durante 20-30 minutos.

Se aplica aceite de inmersión no fluorescente a las preparaciones teñidas y se observa bajo un microscopio fluorescente.

8.4 Manejo de resultados

En las preparaciones teñidas, un cultivo celular no afectado por el virus de la rabia brilla tenuemente. color amarillo grisáceo (control negativo). El antígeno del virus de la rabia se detecta en el citoplasma del cultivo celular en forma de gránulos de color verde brillante de varias formas y tamaños con bordes bien definidos (control positivo).

El diagnóstico de rabia se considera establecido si se encuentran gránulos típicos de color amarillo verdoso en la preparación de la prueba en varios campos de visión del microscopio.

Si el virus de la rabia no se detecta en el cultivo celular, se realiza un diagnóstico negativo.

Los resultados del aislamiento del virus de la rabia en cultivo celular son definitivos, no se realizan más estudios.

9 Bistlerob en ratones blancos

9.1 Esencia del método

La esencia del método radica en el aislamiento del virus de la rabia por inyección intracerebral de material patológico en ratones blancos, seguido de la identificación del virus por el método de anticuerpos fluorescentes según 7.

9.2 Preparación de muestras para examen - según 6.2.1.

9.3 Realización del estudio

Cinco - seis ratones blancos se infectan con una suspensión al 10% de material patológico intracerebral en un volumen de 0,02 - 0,03 cm3. Los ratones infectados se colocan en una jaula separada, en la que se adjunta una etiqueta que indica la fecha de infección, el número de ratones, el método de infección y el número de examen del material patológico. Los animales se observan durante al menos 30 días. El número de ratones sanos, enfermos y muertos se registra en el diario.

9.4 Manejo de resultados

A la hora de evaluar los resultados, se tiene en cuenta la presencia de signos clínicos en los ratones infectados (pelaje alborotado, ingesta de alimentos, alteración de la coordinación de movimientos, parálisis, temblores, postración). No se tiene en cuenta la muerte de ratones en los dos primeros días después de la infección. Las muestras de cerebro de animales enfermos y muertos, a partir del tercer día, son examinadas por MFA por 7.

Un bioensayo se considera positivo si, a partir del tercer día después de la infección, al menos un ratón enfermó y murió, y se detectaron inclusiones específicas del virus de la rabia en la muestra de cerebro usando MFA.

Solo se puede dar un diagnóstico negativo después de 30 días de observación, siempre que todos los animales infectados permanezcan vivos y saludables.

Los resultados del bioensayo se consideran definitivos, no se realizan más investigaciones.

10 Método de inmunoensayo enzimático (ELISA)

10.1 Esencia del método

8 ELISA se basa en la interacción específica del antígeno del virus de la rabia con el antihelio. inmovilizado en un soporte sólido. El antígeno unido se detecta utilizando un segundo anticuerpo antirrábico marcado con peroxidasa. cuyo producto de reacción se colorea con la adición de un cromógeno. La intensidad de tinción del producto de reacción es directamente proporcional a la cantidad de antígeno.

10.2 Preparación para el estudio

10.2.1 Como material de prueba (antígeno), se utilizan muestras de tejido cerebral de animales muertos, sacrificados a la fuerza, sospechosos de rabia o infectados experimentalmente con el virus de la rabia.

10.2.2 Preparación del antígeno de prueba

Las muestras de tejido cerebral obtenidas de acuerdo con 6.5 se trituran, se muelen en un mortero y se preparan suspensiones al 10% * en una solución isotónica de cloruro de sodio al 9%, se calientan en un baño de agua a una temperatura de 60 * C durante 15 minutos y se centrifugan durante 5-10 minutos a 2000 rpm. El sobrenadante se utiliza como antígeno de prueba.

10.2.3 Preparación de reactivos

todas las soluciones y reactivos antes de configurar la reacción deben mantenerse durante al menos 30 minutos a una temperatura de (22 ± 1) * C.

La preparación de los componentes del kit se realiza de acuerdo con las instrucciones de uso.

10.3 Realización del estudio

10.3.1 El ELISA se realiza en versión sándwich utilizando los componentes incluidos en el kit para la detección del antígeno patógeno de la rabia en material patológico.

Para ELISA, se utilizan placas para reacciones inmunológicas con fondo plano.

El volumen de ingredientes introducidos por etapas en los pocillos de la tableta es igual entre sí y es

10.3.2 Sensibilización de la placa

Se cargan 6 pocillos de una placa de poliestireno con ANG a la dilución de trabajo indicada en la etiqueta. La placa con ANG se cubre con una tapa y se incuba en un termostato a una temperatura de (37 ± 0,5)*C durante 3 horas o a una temperatura de 4*C durante 18 horas.Después de la incubación, se lavan los pocillos de la placa. tres veces con solución tampón de lavado. Sacuda el contenido de los pozos con cada lavado. y la solución restante se elimina golpeando ligeramente sobre papel de filtro.

10.3.3 Aplicación de antígenos

8 filas de placa A. 8 y C añadir tampón de lavado. Los antígenos control positivo (pocillo A1) y negativo (pocillo A2) incluidos en el kit, así como las muestras de ensayo (pocillos AZ. A4, etc.) se introducen en los pocillos de la tableta y se titulan verticalmente, obteniendo diluciones de 1 : 2 a 1: 8. Cuando en numeros grandes las muestras se llenan en otras filas de la tableta. La placa se cubre con una tapa y se incuba en un termostato a una temperatura de (37 ± 0,5) * C durante 1 hora. Al final de la incubación, los pocillos de la placa se lavan tres veces de antígenos no unidos a inmunoglobulina, como se describe en 10.3.2.

10.3.4 Aplicación del conjugado de leroxidasa de la rabia

La dilución de trabajo del conjugado de peroxidasa antirrábica se agrega a los pocillos de la placa, luego se tapa con una tapa y se incuba en un termostato a una temperatura de (37 ± 0,5) C durante 1 hora. Luego, los pocillos de la placa se lavado tres veces como se describe en 10.3.2.

10.3.5 Extender la mezcla de sustrato

Para la manifestación de la reacción, la mezcla de sustrato preparada se agrega a los pocillos de la tableta. La reacción se muestra durante 15 - 30 min a una temperatura de (22 ± 0,5) *C en la oscuridad. La reacción se detiene añadiendo una solución de ácido sulfúrico con una concentración molar de 2 mol/DM 3 .

10.4 Manejo de resultados

La contabilidad de la reacción se lleva a cabo visualmente o en un espectrofotómetro de barrido de acuerdo con las instrucciones de uso del kit.

Si se utiliza OPD como cromógeno en la mezcla de sustrato. luego se realiza la medida de la densidad óptica a 490 nm. si usa TMB. luego a 450 km.

La reacción se considera sólo si no hay tinción específica en los pocillos con control de antígeno negativo, mientras que la tinción intensiva en los pocillos con control de antígeno antígeno positivo. Al contar visualmente, la muestra se considera positiva si al menos una (primera) dilución muestra una tinción específica.

Cuando se tiene en cuenta espectrofotométricamente el resultado de ELISA, se realiza el cálculo del coeficiente de especificidad K sp. que es igual a la relación entre la densidad óptica (OD) del producto de reacción en los pocillos con el antígeno de control positivo o material de prueba (OD) y la densidad óptica de la mezcla de sustrato en los pocillos con el antígeno de control negativo (OD) . La reacción se considera positiva. si el coeficiente de especificidad es superior a 2,1 y negativo si es inferior a 2,1.

OP1 * 0.641, OPg a 0.120, Ksp \u003d 5.34 - la reacción es positiva u OP1 \u003d 0.180, OPg a 0.120 K con „ * 1.5 - la reacción es negativa.

En el caso de una reacción positiva, el diagnóstico se considera establecido. Un resultado negativo debe ser confirmado por otros métodos de acuerdo con 7 - 9.

11 Reacción de precipitación por difusión (RDP)

11.1 Esencia del método

La esencia del método RDP radica en la capacidad de los anticuerpos y un antígeno viral para difundirse en un gel de agar y, tras una interacción específica, formar un complejo antígeno-anticuerpo, que es visible a simple vista en forma de línea de precipitación.

11.2 Preparación para el examen

11.2.1 Preparación de muestras

Preparación de muestras para investigación - según 8.2.1.

Las muestras de cerebro animal rancias contaminadas con microflora bacteriana están permitidas para la investigación.

11.2.2 Preparación de agar

Para preparar el agar, mezcle 1,5 g de agar Difko. 1 cm3 Solución al 1% de naranja de metilo en etanol al 50%. 0,01 g de mertiolato. 100 cm3 de solución isotónica de cloruro de sodio. La mezcla resultante se hierve hasta que el agar se derrita por completo, se vierte en tubos de ensayo, se esteriliza en autoclave a una presión de 0,5 atm durante 30 min y se almacena en un refrigerador a una temperatura de 4°C.

11.2.3 Preparación de portaobjetos (placas de Petri)

La reacción se coloca en portaobjetos de vidrio o en placas de Petri. Se aplica una gota de agar fundido a un vaso desgrasado, se distribuye uniformemente sobre el vaso y se deja a temperatura ambiente durante 20-30 minutos para solidificar el agar. Luego se aplican 2,5 cm 3 de agar fundido sobre el vidrio, formando una capa de unos 2 mm de espesor. y dejar durante 20-30 minutos. Los agujeros se hacen en una capa congelada de agar con un sello especial o un tubo de metal de paredes delgadas con un diámetro de 4 a 5 mm. Las columnas de agar se retiran con cuidado, sin dañar ni permitir que una fina capa de gel de agar se desprenda del vidrio, utilizando pinzas oculares u otro instrumento.

Las placas de Petri se preparan de manera similar, añadiéndoles 10 - 15 cm 3 de agar fundido para obtener una capa de 2-3 mm de espesor.

11.3 Realización del estudio

Inmediatamente antes de iniciar la reacción, se preparan diluciones de suero antirrábico (inmunoglobulina), para lo cual se agrega 1,0 cm 3 de solución isotónica de cloruro de sodio a cuatro tubos de ensayo. Agregar 1,0 cm 3 de suero antirrábico al primer tubo de ensayo, obteniendo una dilución de 1:2.

mezclar, y transferir 1,0 cm 3 de la mezcla a un segundo tubo de ensayo, etc. Así, se obtienen cuatro tubos de ensayo con diluciones de 1:2,1:4,1:8 y 1:16.

8 pocillos preparados aportan 0,05 - 0,07 cm 3 de una muestra de cerebro (cada muestra en un pocillo separado), obtenida según 8.2.1. y diluciones de suero antirrábico o inmunoglobulina (1:2; 1:4; 1:8:1:16) según figura 1.

Figura 1 - Esquema de aplicación de materiales

Ar - Cuerno de Emmon; Pm - bulbo raquídeo; A+ - antígeno de control positivo; M - cerebelo; K - corteza cerebral; A- - antígeno de control negativo.

es posible utilizar otros esquemas de introducción de material, pero es obligatorio el uso de antígenos positivos y negativos.

Los portaobjetos con el material de prueba se colocan en placas de Petri con el fondo húmedo o en un desecador húmedo, y luego en un termostato a una temperatura de (37 ± 1) * C durante 48 horas (las placas de Petri se cubren con una tapa y se colocan en un termostato).

La reacción se tiene en cuenta después de 6,24 y 48 horas.

11.4 Manejo de resultados

La reacción se considera positiva cuando aparece una sola línea de precipitación de cualquier intensidad entre los pocillos que contienen el material de prueba y el suero antirrábico (inmunoglobulina).

En este caso, debe observarse una línea de precipitación notable entre el antígeno positivo y el suero antirrábico (inmunoglobulina), y no debe haber una línea de precipitación entre el antígeno negativo y el suero antirrábico (inmunoglobulina).

En 8 casos de una reacción positiva, el diagnóstico se considera establecido. Un resultado negativo debe ser confirmado por otros métodos de acuerdo con 7-10.

bibliografía

Guía de la UE de Buenas Prácticas de Fabricación de Medicamentos de Uso Humano y Veterinario

UDC 619:616.98:579.852.1:615371 MKS 11.220

Palabras clave: rabia, diagnóstico, método de anticuerpos fluorescentes, ensayo inmunoabsorbente ligado, bioensayo, reacción de precipitación por difusión

Firmado para su publicación el 01/04/2014. Formato 60x84V

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INSTRUCCIONES METODOLÓGICAS
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE LA RABIA

1. El diagnóstico de la rabia se realiza sobre la base de un conjunto de datos epizootológicos, clínicos, anatomopatológicos y principalmente sobre la base de pruebas de laboratorio.

2. Para la investigación, se envían al laboratorio por mensajería: un cadáver fresco o la cabeza de un perro (gato, zorro, zorro ártico, oveja, ternero, etc.), de animales grandes: una cabeza o cerebro (fresco o enlatado en solución de glicerina al 30 - 50 %). Solo los cerebros sin conservantes son adecuados para estudios serológicos.

3. El diagnóstico de laboratorio de la rabia consiste en el examen microscópico del cerebro (para detectar cuerpos de Babes-Negri), el examen serológico (detección de un antígeno específico de la rabia), así como en la realización de una prueba biológica en ratones o conejos blancos. .

Orden de investigación.

4. Del cerebro recibido para el estudio, primero se siembran en medios nutritivos. Parte del cerebro se coloca inmediatamente en el refrigerador y se almacena en caso de que sea necesario volver a examinarlo. Se toma material del resto del cerebro para examen microscópico, reacciones serológicas y muestras biológicas.

Nota. La autopsia, la extracción del cerebro y otros trabajos se realizan en condiciones estériles con estricta observancia de las medidas de prevención personal (fijación fuerte de la cabeza del animal, protección de las manos con dos pares de guantes: quirúrgicos y anatómicos; se colocan gafas protectoras proteger los ojos, y la nariz y la boca se cubren con una venda de gasa).

I. ESTUDIOS MICROSCÓPICOS

5. Para el examen microscópico, se hacen impresiones y frotis de diferentes partes del cerebro.

6. Para preparar una impresión, se colocan trozos del cerebro (cuerno de Amón, corteza cerebral, cerebelo, bulbo raquídeo) en papel de filtro doblado en 4-6 capas. La superficie cortada se toca varias veces (3 - 4) seguidas con un portaobjetos de vidrio limpio, presionando ligeramente para dejar una fina impresión en el vidrio.

7. Los frotis se hacen de las mismas áreas del cerebro. Para ello, se muelen trozos de cerebro en un mortero de porcelana con mano de mortero o en un tubo de ensayo con varilla de vidrio hasta formar una masa homogénea, a partir de la cual se hacen frotis rugosos sobre un portaobjetos de vidrio desengrasado.

Puedes hacer frotis de otra manera. Para ello, se coloca un pequeño trozo de cerebro en el borde de un portaobjetos de vidrio, se tritura con otro vidrio y se unta de un borde al otro, como resultado se obtiene un frotis fino y uniforme en la superficie del portaobjetos. vidrio.

8. Los frotis o impresiones resultantes se tiñen de una de las siguientes maneras:

a) tinción según Muromtsev. Los frotis o impresiones realizados, aún húmedos, se fijan inmediatamente en alcohol etílico o metílico o en una mezcla de alcohol por la mitad con éter o acetona (químicamente pura) durante 1-2 horas y luego se lavan con agua. El recipiente del fijador debe estar bien cerrado para evitar que el líquido fijador se evapore. Después de lavar con agua, los frotis húmedos se colocan durante 5 a 10 minutos en una solución de pintura de Munson, diluida con agua 1:40. Luego se escurre la pintura e inmediatamente se sumergen las manchas en una solución acuosa de tanino al 10% durante 8-10 minutos hasta que aparece un color azulado. Después de eso, los frotis se lavan con agua, se secan con papel de filtro, se pasan por una mezcla de partes iguales de alcohol con acetona (químicamente pura) o alcohol con xileno y se secan nuevamente con papel de filtro. El frotis teñido debe tener un fondo azul claro, mientras que los núcleos de las células nerviosas se tiñen de azul y los cuerpos de Babesh-Negri son de color púrpura pálido con inclusiones oscuras;

b) Mancha del vendedor. En la impresión o frotis húmedo preparado, aplique durante 4 - s una mezcla de reactivo "A" (azul de metileno - 2 g, alcohol metílico sin acetona - 100 ml) y reactivo "B" (fucsina básica - 0,5 g, alcohol etílico sin trazas de acetona - 100 ml). La solución de trabajo del tinte consta de 15 ml de reactivo "A", 2 - 4 ml de reactivo "B" y 25 ml de alcohol metílico. Después de la tinción, la preparación se lava con agua corriente y se seca. En el frotis teñido, el citoplasma de las neuronas es de color azul brillante, los nucleolos son de color azul oscuro, los eritrocitos son de color rojo ladrillo, los cuerpos de Babesh-Negri son de color rojo púrpura con una estructura basófila claramente visible de los cuerpos;

c) tinción según Mikhin. Los frotis o huellas se fijan en una mezcla de alcohol y éter (en partes iguales) durante 5-10 minutos, después de lo cual se secan con papel filtro y se tiñen durante 30-40 minutos con pintura Giemsa (1-2 gotas por 1 ml de agua destilada). ), se lavó rápidamente con alcohol acidificado (1 gota de ácido acético glacial por 30 ml de alcohol de 96°), y luego con agua, se secó con papel filtro y se sometió a investigación. Si el material estaba en glicerina, se enjuaga bien con agua y se seca con papel de filtro.

En una preparación teñida, bajo examen microscópico, el fondo principal debe ser rojo con un tinte púrpura. Con predominio de un tono azul, la mancha se lava nuevamente con alcohol acidificado y se lava con agua. Las células nerviosas piramidales tienen un color azulado con un núcleo de color negro intenso, y los cuerpos de Babesh-Negri son de color rojo rosado con inclusiones punteadas de color azul oscuro;

d) tinción según Bormann-Gainullina. Los frotis o impresiones delgadas se fijan durante 5 minutos en una mezcla de la siguiente composición: alcohol y éter (igualmente) - 98 ml, ácido acético glacial - 2 ml; después de la fijación, se sumergen durante 5 minutos en una solución de sosa cristalina al 10%, luego se lavan con agua y se secan al aire. Los frotis fijados se tiñen durante 2 minutos con la pintura preparada antes de su uso (solución acuosa saturada de azul de metileno - 3 gotas, solución básica saturada de fucsina - 2 gotas, agua del grifo- 20 ml). La solución de pintura se vierte sobre una mancha, se fija sobre la llama de un quemador, luego la pintura se deja durante otro minuto, luego se lava con agua y se seca con papel de filtro. En un frotis teñido, el fondo principal debe ser rojo brillante, el protoplasma de las células nerviosas se tiñe de azul rojizo y sus núcleos son azul oscuro, los cuerpos de Babes-Negri se tiñen de rojo fresa con una estructura típicamente granular. Los eritrocitos se ven como círculos sin teñir.

II. ESTUDIOS SEROLÓGICOS

9. Reacción de precipitación difusa en gel de agar. La reacción se utiliza para detectar un antígeno específico de la rabia en el cerebro no preservado de animales que murieron de rabia callejera, así como en animales en los que se realizó un bioensayo. Para la reacción, puede usar un cerebro rancio (hasta 1 mes).

La reacción se lleva a cabo en portaobjetos de vidrio desnatados, en los que se colocan 2,5 ml de gel de agar derretido y enfriado a 60 ° C, preparado según la receta: agar-agar seco - 12 - 15 g; cloruro de sodio químicamente puro - 8,6 g; Solución al 1% (filtrada) de naranja de metilo en alcohol de 50 ° - 5 - 10 ml; mertiolato - 0,01 g; agua destilada - 1 l.

Nota. Para configurar la reacción, es mejor usar agar-agar Difko, se disuelve completamente, no se requiere filtración del medio. Otras variedades de agar-agar requieren una filtración cuidadosa.

Después de que el agar se haya solidificado, se hacen agujeros con un tubo de vidrio o metal de paredes delgadas con un diámetro interior de 4–5 mm, colocándolos de acuerdo con la plantilla (ver Fig. -).

Para la reacción en animales grandes, se utilizan partes del cerebro: el cuerno de amonio, la corteza de los hemisferios, el cerebelo, el bulbo raquídeo; en ratas, tuzas, conejillos de indias, hámsteres, etc. - cualquiera de las tres partes del cerebro; los ratones tienen todo el cerebro.

Esquema de configuración de microprecipitación:
PERO - corteza (hemisferio izquierdo); A- corteza (hemisferio derecho); DE- cuerno de amón (izquierda);
D- cuerno de amón (derecha); mi- cerebelo; Y- médula;
1 , 2 , 3 , 4 - diluciones de globulina, respectivamente 1:2, 1:4, 1:8, 1:16.

PR positivo con todas las diluciones de globulina
(corteza cerebral de ovejas, rabia callejera)

PR positivo con diluciones de globulina 1:4; 1:8, 1:16
(cuerno de perro ammon, rabia callejera)

PR positivo con diluciones de globulina 1:16,
no hay líneas de precipitación con diluciones de 1:2, 1:4,
(médula oblongata del perro, rabia callejera)

El cerebro se muele en un mortero de porcelana con un mazo o en el propio cráneo hasta formar una “pasta”, que se llena con pocillos para el antígeno. Los pocillos restantes se llenan con precipitación de globulina antirrábica a una dilución de 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. El volumen de ingredientes utilizados es de 0,02 ml.

Los controles con antígenos positivos y negativos se colocan simultáneamente en un portaobjetos separado usando el mismo agar usando la misma plantilla.

Después de colocar los ingredientes de la reacción en los pocillos apropiados, los portaobjetos de vidrio se transfieren a una cámara húmeda (placas de Petri con papel de filtro húmedo o algodón) y se colocan en un termostato durante 6 horas a una temperatura de 37-38 °C. A continuación, las placas se dejan a temperatura ambiente durante otras 18 horas.

La contabilidad de la reacción se lleva a cabo 3, 6 y 24 horas después de su fraguado. Para evitar que el agar se seque, los portaobjetos de reacción se colocan en las mismas placas de Petri que contienen algodón humedecido después de cada visualización.

Con una reacción de precipitación en agar positiva, se pueden formar una, dos y muy raramente tres líneas de precipitación paralelas entre los pocillos con globulina y antígeno. Las líneas de precipitación resultantes son visualmente visibles cuando los vasos se iluminan con un iluminador de abajo hacia arriba en un ángulo de aproximadamente 45°.

Con indicaciones negativas de la reacción de precipitación, se realiza un bioensayo.

10. Reacción de inmunofluorescencia. Se basa en la detección mediante microscopios especiales (ML-1, ML-2, ML-3, etc.) de un antígeno viral que ha reaccionado con un suero antirrábico específico marcado con un colorante fluorescente.

Para la reacción, se hacen impresiones delgadas y de capas iguales en vasos cuidadosamente desengrasados ​​de cerebro fresco o recién congelado. Las impresiones se preparan a partir de piezas del cerebro (cuerno de Amón, corteza cerebral, cerebelo, bulbo raquídeo) de la misma manera que para el examen microscópico. Se preparan al menos 4 preparaciones de cada trozo de cerebro. Para el control, las drogas se fabrican de manera similar a partir del cerebro de un animal sano.

Después del secado al aire, las preparaciones se fijan en acetona durante 4 horas a una temperatura que no exceda los 4 °C. El recipiente del fijador debe estar bien cerrado para evitar que el líquido fijador se evapore. Después de la fijación con acetona, se aplican algunas gotas del conjugado (gammaglobulina antirrábica fluorescente) a las preparaciones en la dilución de trabajo. Luego se colocan en cámara húmeda (placa Petri o cubeta esmaltada cerrada con fondo humedecido) durante 20 - 30 minutos a una temperatura de 25 °C.

Después de eso, las preparaciones se lavan con agua o solución tampón de fosfato (pH 7,2 - 7,4) durante 1 hora, luego se enjuagan con agua destilada, se secan al aire y se someten a investigación. Las preparaciones se ven bajo el sistema de inmersión. El aceite no luminiscente se utiliza para la inmersión.

En una preparación teñida, bajo microscopía fluorescente, el tejido cerebral emite fluorescencia (brilla) con un color amarillo grisáceo opaco. El antígeno del virus de la rabia se detecta en preparaciones en forma de gránulos de color verde amarillento o verde brillante de varias formas y tamaños, desde apenas perceptibles hasta tener 15-20 micrones de diámetro.

En la preparación de control no se observan gránulos de color amarillo verdoso intensamente luminosos.

En el estudio que utiliza el método de anticuerpos fluorescentes, el diagnóstico de rabia se considera establecido si se encuentra una cantidad suficiente (al menos 10) de gránulos típicos con un brillo verdoso brillante de varios tamaños en varios campos de visión del microscopio. En el control de tales formaciones no debe ser.

En ausencia de fluorescencia positiva, se coloca una muestra biológica.

tercero MUESTRA BIOLÓGICA

11. Se realiza una prueba biológica para la rabia si se obtiene un resultado negativo durante el examen microscópico (no se detectan cuerpos de Babes-Negri), con reacciones serológicas (no se detecta el antígeno específico de la rabia), así como cuando se detectan inclusiones atípicas. La prueba biológica se realiza en ratones o conejos blancos.

12. Se infectan ratones o conejos experimentales con una suspensión al 10 % del cerebro de prueba en caldo salino o de peptona de carne con un pH de 7,2 - 7,4. Para preparar la suspensión, se utilizan las mismas partes del cerebro, de donde se tomó el material para estudios microscópicos y serológicos.

Las partes extirpadas del cerebro se recogen en un tubo de ensayo estéril y se pesan, y luego se muelen completamente en un mortero con una maja, después de lo cual se agrega solución salina fisiológica o caldo de peptona de carne para obtener una suspensión al 10%. La suspensión resultante se deja reposar durante 10 minutos y el sobrenadante se usa para la infección.

Si el material patológico estaba contaminado, el sobrenadante se vierte en otro recipiente (tubo de ensayo) y se le agregan 500-1000 UI de penicilina y estreptomicina por 1 ml de líquido, después de lo cual se deja reposar durante otros 30 minutos a temperatura ambiente y luego se utiliza para la infección. La suspensión debe prepararse en condiciones estériles y con estricto apego a las normas de prevención personal.

Ensayo biológico en ratones blancos. Para la infección, se usan ratones blancos que pesan 8-10 G. Para cada estudio, se toman 6 ratones, de los cuales 3 están infectados en el cerebro y 3, por vía subcutánea. Cuando se infecta en el cerebro, la aguja se inserta en un punto detrás de la línea que conecta las esquinas traseras y ligeramente alejada de la línea que corre en el medio de la cabeza. El sitio de la infección se limpia con alcohol. La suspensión se administra a una dosis de 0,03 ml. Para evitar una penetración profunda de la aguja en el cerebro, se coloca un limitador en la punta: una pequeña pieza de tubo de goma que se fija a una distancia de 2-3 mm del extremo de la aguja. En caso de infección subcutánea, la suspensión se inyecta en la región de la punta de la nariz (en labio superior) a una dosis de 0,05 ml. Se forma una pequeña hinchazón en el lugar de la inyección. Los ratones infectados se colocan en frascos de vidrio y se observan durante 30 días. A un resultado positivo muestras biológicas en ratones, generalmente en el día 7 - 15 después de la infección, se desarrolla una clínica de rabia paralítica.

Inicialmente, se notan letargo, pelaje despeinado y una especie de joroba, así como alteración de la coordinación de movimientos. Luego viene la parálisis de las extremidades posteriores y, más tarde, la parte delantera, que se convierte en parálisis general y termina en la muerte. La duración de la enfermedad es de 2-3 días.

Con el desarrollo de parálisis general, los ratones se sacrifican usando anestesia con éter o cloroformo. En ratones muertos y sacrificados, se abre la cavidad craneal, se inocula el cerebro en medios nutritivos, después de lo cual se extrae el cerebro, a partir del cual se preparan preparaciones para estudios microscópicos e inmunobiológicos.

con ausencia manifestaciones clínicas la rabia en ratones infectados se destruyen dentro de los 30 días. Los frascos en los que se guardaron se desinfectan minuciosamente.

Prueba biológica en conejos. Para preparar una muestra biológica se toman 4 conejos de al menos 1,5 kg cada uno. 2 conejos están infectados en el cerebro y 2 por vía intramuscular en el área del muslo. La suspensión se administra por vía intracerebral a una dosis de 0,2 ml y por vía intramuscular a una dosis de 2 ml.

Con un resultado positivo de la prueba biológica, los conejos se enferman dentro de los 16 a 21 días. La enfermedad de la rabia ocurre en conejos en una forma paralítica silenciosa con fatal. En conejos muertos, se extrae el cerebro y se realizan más investigaciones de la misma manera que cuando se infectan ratones. Los conejos se observan durante 45-50 días. Después del período especificado, los conejos se destruyen. Las jaulas en las que se mantuvieron los animales de experimentación se desinfectan.

IV. EXAMEN HISTOLÓGICO 1

1 El examen histológico se utiliza como un método adicional.

Para el examen histológico, se toman trozos de cuerno de Amón, corteza cerebral, cerebelo, bulbo raquídeo y se fijan en una o dos porciones de acetona de modo que la duración de la fijación sea de 6 a 18 horas.

Es mejor dejar la fijación en acetona durante la noche. Luego, el material patológico se pasa a través de dos porciones de xileno, manteniéndolas durante 30 minutos cada una, ya través de dos porciones de parafina, de 1 hora cada una. Las secciones preparadas se desparafinan por el método habitual y se tiñen según Lenz o Turevich:

Coloración según Lenz. Las secciones se tiñen con una solución de eosina durante 1-3 minutos (0,5 g de eosina se disuelven en 100 ml de 60 ° alcohol etílico). La eosina se lava rápidamente con agua y se tiñe con azul de metileno de Lefleur durante 1 min, se lava con agua, se seca cuidadosamente con papel de filtro y se diferencia con una solución de unidades. quien sodio en alcohol absoluto (5 gotas de sosa cáustica por 30 ml de alcohol) a un color rosa pálido. Se vierte sobre la preparación una solución de ácido acético (1 gota de ácido acético glacial por 60 ml de alcohol absoluto) y se mantiene hasta que aparece un color azul pálido, se lava rápidamente con alcohol y se clarifica con xileno durante 4-5 minutos. Los cuerpos de Babesh-Negri están teñidos de rojo brillante con inclusiones azules, el citoplasma de las células ganglionares es azul pálido;

Coloración según Turevich. Las secciones desparafinadas inmediatamente después de pasar por alcoholes y agua destilada se tiñen con hematoxilina de Weigert o Ehrlich y se lavan con agua destilada. Luego se tiñe con una solución acuosa al 1% de fucsina ácida durante 1 min y se lava abundantemente con agua destilada hasta que aparece un tono rosa pálido. Después del lavado, se trata con una mezcla (a partes iguales) de una solución acuosa saturada de ácido pícrico (25-30 g de ácido pícrico por 1 litro de agua destilada caliente) y alcohol al 96%. Durante el procesamiento, se observa la descarga de nubes de pintura roja y las secciones adquieren un tinte amarillo después de 10 a 20 s. Las secciones se enjuagan rápidamente con agua y se secan ligeramente con papel de filtro. Luego, con la misma rapidez, se pasa por alcohol absoluto o de 96°, carbol-xileno, xileno puro y se coloca en un bálsamo. Los cuerpos de Babesh-Negri son de color rojo cereza, los núcleos de las células son negros o azules, según la hematoxilina con la que se tiñen. La forma y el tamaño de los cuerpos de Babesh-Negri son muy diversos, están ubicados en el citoplasma y los procesos de las células nerviosas en forma de copias numerosas o individuales. Más a menudo, los cuerpos de Babes-Negri se encuentran en células ganglionares grandes y las células que los contienen no tienen signos pronunciados de degeneración.

A menudo se encuentran otras inclusiones que, debido a una serie de características similares, a veces se confunden con cuerpos de Negri. Debe tenerse en cuenta que los cerebros de gatos sanos y ratones blancos a veces contienen cuerpos de inclusión acidófilos inespecíficos. Estos cuerpos pueden diferenciarse de los cuerpos de Negri por la ausencia de gránulos internos y la homogeneidad de la sustancia principal.

La rabia también se caracteriza por signos de encefalomielitis aguda: predominantemente alrededor de las venas pequeñas, se encuentran infiltrados perivasculares, que consisten principalmente en células linfoides que parecen manguitos celulares.

En las células ganglionares del cerebro, puede haber cromatólisis, vacuolización e inflamación aguda de las células, así como la muerte de células individuales. En el área de las células nerviosas dañadas, la reacción proliferativa de la glía es bastante constante, tomando la forma de una verdadera neuronofagia, seguida por el reemplazo de las células nerviosas con elementos de la glía multiplicada. Tal acumulación de células proliferantes en el sitio de la caries neurona se llama el "nódulo de la rabia" - en el corte, a veces es posible rastrear el desarrollo del nódulo (1).

INSTRUCCIONES METODOLÓGICAS
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE LA RABIA

1. El diagnóstico de la rabia se realiza sobre la base de un conjunto de datos epizootológicos, clínicos, anatomopatológicos y principalmente sobre la base de pruebas de laboratorio.

2. Para la investigación, se envían al laboratorio por mensajería: un cadáver fresco o la cabeza de un perro (gato, zorro, zorro ártico, oveja, ternero, etc.), de animales grandes: una cabeza o cerebro (fresco o enlatado en solución de glicerina al 30 - 50 %). Solo los cerebros sin conservantes son adecuados para estudios serológicos.

3. El diagnóstico de laboratorio de la rabia consiste en el examen microscópico del cerebro (para detectar cuerpos de Babes-Negri), el examen serológico (detección de un antígeno específico de la rabia), así como en la realización de una prueba biológica en ratones o conejos blancos. .

Orden de investigación.

4. Del cerebro recibido para el estudio, primero se siembran en medios nutritivos. Parte del cerebro se coloca inmediatamente en el refrigerador y se almacena en caso de que sea necesario volver a examinarlo. Se toma material del resto del cerebro para examen microscópico, reacciones serológicas y muestras biológicas.

Nota. La autopsia, la extracción del cerebro y otros trabajos se realizan en condiciones estériles con estricta observancia de las medidas de prevención personal (fijación fuerte de la cabeza del animal, protección de las manos con dos pares de guantes: quirúrgicos y anatómicos; se colocan gafas protectoras proteger los ojos, y la nariz y la boca se cubren con una venda de gasa).

I. ESTUDIOS MICROSCÓPICOS

5. Para el examen microscópico, se hacen impresiones y frotis de diferentes partes del cerebro.

6. Para preparar una impresión, se colocan trozos del cerebro (cuerno de Amón, corteza cerebral, cerebelo, bulbo raquídeo) en papel de filtro doblado en 4-6 capas. La superficie cortada se toca varias veces (3 - 4) seguidas con un portaobjetos de vidrio limpio, presionando ligeramente para dejar una fina impresión en el vidrio.

7. Los frotis se hacen de las mismas áreas del cerebro. Para ello, se muelen trozos de cerebro en un mortero de porcelana con mano de mortero o en un tubo de ensayo con varilla de vidrio hasta formar una masa homogénea, a partir de la cual se hacen frotis rugosos sobre un portaobjetos de vidrio desengrasado.

Puedes hacer frotis de otra manera. Para ello, se coloca un pequeño trozo de cerebro en el borde de un portaobjetos de vidrio, se tritura con otro vidrio y se unta de un borde al otro, como resultado se obtiene un frotis fino y uniforme en la superficie del portaobjetos. vidrio.

8. Los frotis o impresiones resultantes se tiñen de una de las siguientes maneras:

a) tinción según Muromtsev. Los frotis o impresiones realizados, aún húmedos, se fijan inmediatamente en alcohol etílico o metílico o en una mezcla de alcohol por la mitad con éter o acetona (químicamente pura) durante 1-2 horas y luego se lavan con agua. El recipiente del fijador debe estar bien cerrado para evitar que el líquido fijador se evapore. Después de lavar con agua, los frotis húmedos se colocan durante 5 a 10 minutos en una solución de pintura de Munson, diluida con agua 1:40. Luego se escurre la pintura e inmediatamente se sumergen las manchas en una solución acuosa de tanino al 10% durante 8-10 minutos hasta que aparece un color azulado. Después de eso, los frotis se lavan con agua, se secan con papel de filtro, se pasan por una mezcla de partes iguales de alcohol con acetona (químicamente pura) o alcohol con xileno y se secan nuevamente con papel de filtro. El frotis teñido debe tener un fondo azul claro, mientras que los núcleos de las células nerviosas se tiñen de azul y los cuerpos de Babesh-Negri son de color púrpura pálido con inclusiones oscuras;

b) Mancha del vendedor. En la impresión o frotis húmedo preparado, aplique durante 4 - s una mezcla de reactivo "A" (azul de metileno - 2 g, alcohol metílico sin acetona - 100 ml) y reactivo "B" (fucsina básica - 0,5 g, alcohol etílico sin trazas de acetona - 100 ml). La solución de trabajo del tinte consta de 15 ml de reactivo "A", 2 - 4 ml de reactivo "B" y 25 ml de alcohol metílico. Después de la tinción, la preparación se lava con agua corriente y se seca. En el frotis teñido, el citoplasma de las neuronas es de color azul brillante, los nucleolos son de color azul oscuro, los eritrocitos son de color rojo ladrillo, los cuerpos de Babesh-Negri son de color rojo púrpura con una estructura basófila claramente visible de los cuerpos;

c) tinción según Mikhin. Los frotis o huellas se fijan en una mezcla de alcohol y éter (en partes iguales) durante 5-10 minutos, después de lo cual se secan con papel filtro y se tiñen durante 30-40 minutos con pintura Giemsa (1-2 gotas por 1 ml de agua destilada). ), se lavó rápidamente con alcohol acidificado (1 gota de ácido acético glacial por 30 ml de alcohol de 96°), y luego con agua, se secó con papel filtro y se sometió a investigación. Si el material estaba en glicerina, se enjuaga bien con agua y se seca con papel de filtro.

En una preparación teñida, bajo examen microscópico, el fondo principal debe ser rojo con un tinte púrpura. Con predominio de un tono azul, la mancha se lava nuevamente con alcohol acidificado y se lava con agua. Las células nerviosas piramidales tienen un color azulado con un núcleo de color negro intenso, y los cuerpos de Babesh-Negri son de color rojo rosado con inclusiones punteadas de color azul oscuro;

d) tinción según Bormann-Gainullina. Los frotis o impresiones delgadas se fijan durante 5 minutos en una mezcla de la siguiente composición: alcohol y éter (igualmente) - 98 ml, ácido acético glacial - 2 ml; después de la fijación, se sumergen durante 5 minutos en una solución de sosa cristalina al 10%, luego se lavan con agua y se secan al aire. Los frotis fijados se tiñen durante 2 minutos con la pintura preparada antes de su uso (solución acuosa saturada de azul de metileno - 3 gotas, solución básica saturada de fucsina - 2 gotas, agua corriente - 20 ml). La solución de pintura se vierte sobre una mancha, se fija sobre la llama de un quemador, luego la pintura se deja durante otro minuto, luego se lava con agua y se seca con papel de filtro. En un frotis teñido, el fondo principal debe ser rojo brillante, el protoplasma de las células nerviosas se tiñe de azul rojizo y sus núcleos son azul oscuro, los cuerpos de Babes-Negri se tiñen de rojo fresa con una estructura típicamente granular. Los eritrocitos se ven como círculos sin teñir.

II. ESTUDIOS SEROLÓGICOS

9. Reacción de precipitación difusa en gel de agar. La reacción se utiliza para detectar un antígeno específico de la rabia en el cerebro no preservado de animales que murieron de rabia callejera, así como en animales en los que se realizó un bioensayo. Para la reacción, puede usar un cerebro rancio (hasta 1 mes).

La reacción se lleva a cabo en portaobjetos de vidrio desnatados, en los que se colocan 2,5 ml de gel de agar derretido y enfriado a 60 ° C, preparado según la receta: agar-agar seco - 12 - 15 g; cloruro de sodio químicamente puro - 8,6 g; Solución al 1% (filtrada) de naranja de metilo en alcohol de 50 ° - 5 - 10 ml; mertiolato - 0,01 g; agua destilada - 1 l.

Nota. Para configurar la reacción, es mejor usar agar-agar Difko, se disuelve completamente, no se requiere filtración del medio. Otras variedades de agar-agar requieren una filtración cuidadosa.

Después de que el agar se haya solidificado, se hacen agujeros con un tubo de vidrio o metal de paredes delgadas con un diámetro interior de 4–5 mm, colocándolos de acuerdo con la plantilla (ver Fig. -).

Para la reacción en animales grandes, se utilizan partes del cerebro: el cuerno de amonio, la corteza de los hemisferios, el cerebelo, el bulbo raquídeo; en ratas, tuzas, conejillos de Indias, hámsteres, etc. - cualquiera de las tres partes del cerebro; los ratones tienen todo el cerebro.

Esquema de configuración de microprecipitación:
PERO - corteza (hemisferio izquierdo); A- ladrar ( hemisferio derecho); DE- cuerno de amón (izquierda);
D- cuerno de amón (derecha); mi- cerebelo; Y- médula;
1 , 2 , 3 , 4 - diluciones de globulina, respectivamente 1:2, 1:4, 1:8, 1:16.

PR positivo con todas las diluciones de globulina
(corteza cerebral de ovejas, rabia callejera)

PR positivo con diluciones de globulina 1:4; 1:8, 1:16
(cuerno de perro ammon, rabia callejera)

PR positivo con diluciones de globulina 1:16,
no hay líneas de precipitación con diluciones de 1:2, 1:4,
(médula oblongata del perro, rabia callejera)

El cerebro se muele en un mortero de porcelana con un mazo o en el propio cráneo hasta formar una “pasta”, que se llena con pocillos para el antígeno. Los pocillos restantes se llenan con precipitación de globulina antirrábica a una dilución de 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. El volumen de ingredientes utilizados es de 0,02 ml.

Los controles con antígenos positivos y negativos se colocan simultáneamente en un portaobjetos separado usando el mismo agar usando la misma plantilla.

Después de colocar los ingredientes de la reacción en los pocillos apropiados, los portaobjetos de vidrio se transfieren a una cámara húmeda (placas de Petri con papel de filtro húmedo o algodón) y se colocan en un termostato durante 6 horas a una temperatura de 37-38 °C. A continuación, las placas se dejan a temperatura ambiente durante otras 18 horas.

La contabilidad de la reacción se lleva a cabo 3, 6 y 24 horas después de su fraguado. Para evitar que el agar se seque, los portaobjetos de reacción se colocan en las mismas placas de Petri que contienen algodón humedecido después de cada visualización.

Con una reacción de precipitación en agar positiva, se pueden formar una, dos y muy raramente tres líneas de precipitación paralelas entre los pocillos con globulina y antígeno. Las líneas de precipitación resultantes son visualmente visibles cuando los vasos se iluminan con un iluminador de abajo hacia arriba en un ángulo de aproximadamente 45°.

Con indicaciones negativas de la reacción de precipitación, se realiza un bioensayo.

10. Reacción de inmunofluorescencia. Se basa en la detección mediante microscopios especiales (ML-1, ML-2, ML-3, etc.) de un antígeno viral que ha reaccionado con un suero antirrábico específico marcado con un colorante fluorescente.

Para la reacción, se hacen impresiones delgadas y de capas iguales en vasos cuidadosamente desengrasados ​​de cerebro fresco o recién congelado. Las impresiones se preparan a partir de piezas del cerebro (cuerno de Amón, corteza cerebral, cerebelo, bulbo raquídeo) de la misma manera que para el examen microscópico. Se preparan al menos 4 preparaciones de cada trozo de cerebro. Para el control, las drogas se fabrican de manera similar a partir del cerebro de un animal sano.

Después del secado al aire, las preparaciones se fijan en acetona durante 4 horas a una temperatura que no exceda los 4 °C. El recipiente del fijador debe estar bien cerrado para evitar que el líquido fijador se evapore. Después de la fijación con acetona, se aplican algunas gotas del conjugado (gammaglobulina antirrábica fluorescente) a las preparaciones en la dilución de trabajo. Luego se colocan en cámara húmeda (placa Petri o cubeta esmaltada cerrada con fondo humedecido) durante 20 - 30 minutos a una temperatura de 25 °C.

Después de eso, las preparaciones se lavan con agua o solución tampón de fosfato (pH 7,2 - 7,4) durante 1 hora, luego se enjuagan con agua destilada, se secan al aire y se someten a investigación. Las preparaciones se ven bajo el sistema de inmersión. El aceite no luminiscente se utiliza para la inmersión.

En una preparación teñida, bajo microscopía fluorescente, el tejido cerebral emite fluorescencia (brilla) con un color amarillo grisáceo opaco. El antígeno del virus de la rabia se detecta en preparaciones en forma de gránulos de color verde amarillento o verde brillante de varias formas y tamaños, desde apenas perceptibles hasta tener 15-20 micrones de diámetro.

En la preparación de control no se observan gránulos de color amarillo verdoso intensamente luminosos.

En el estudio que utiliza el método de anticuerpos fluorescentes, el diagnóstico de rabia se considera establecido si se encuentra una cantidad suficiente (al menos 10) de gránulos típicos con un brillo verdoso brillante de varios tamaños en varios campos de visión del microscopio. En el control de tales formaciones no debe ser.

En ausencia de fluorescencia positiva, se coloca una muestra biológica.

tercero MUESTRA BIOLÓGICA

11. Se realiza una prueba biológica para la rabia si se obtiene un resultado negativo durante el examen microscópico (no se detectan cuerpos de Babes-Negri), con reacciones serológicas (no se detecta el antígeno específico de la rabia), así como cuando se detectan inclusiones atípicas. La prueba biológica se realiza en ratones o conejos blancos.

12. Se infectan ratones o conejos experimentales con una suspensión al 10 % del cerebro de prueba en caldo salino o de peptona de carne con un pH de 7,2 - 7,4. Para preparar la suspensión, se utilizan las mismas partes del cerebro, de donde se tomó el material para estudios microscópicos y serológicos.

Las partes extirpadas del cerebro se recogen en un tubo de ensayo estéril y se pesan, y luego se muelen completamente en un mortero con una maja, después de lo cual se agrega solución salina fisiológica o caldo de peptona de carne para obtener una suspensión al 10%. La suspensión resultante se deja reposar durante 10 minutos y el sobrenadante se usa para la infección.

Si el material patológico estaba contaminado, el sobrenadante se vierte en otro recipiente (tubo de ensayo) y se le agregan 500-1000 UI de penicilina y estreptomicina por 1 ml de líquido, después de lo cual se deja reposar durante otros 30 minutos a temperatura ambiente y luego se utiliza para la infección. La suspensión debe prepararse en condiciones estériles y con estricto apego a las normas de prevención personal.

Ensayo biológico en ratones blancos. Para la infección, se usan ratones blancos que pesan 8-10 G. Para cada estudio, se toman 6 ratones, de los cuales 3 están infectados en el cerebro y 3, por vía subcutánea. Cuando se infecta en el cerebro, la aguja se inserta en un punto detrás de la línea que conecta las esquinas traseras y ligeramente alejada de la línea que corre en el medio de la cabeza. El sitio de la infección se limpia con alcohol. La suspensión se administra a una dosis de 0,03 ml. Para evitar una penetración profunda de la aguja en el cerebro, se coloca un limitador en la punta: una pequeña pieza de tubo de goma que se fija a una distancia de 2-3 mm del extremo de la aguja. A infección subcutánea la suspensión se inyecta en la zona de la punta de la nariz (labio superior) a una dosis de 0,05 ml. Se forma una pequeña hinchazón en el lugar de la inyección. Los ratones infectados se colocan en frascos de vidrio y se observan durante 30 días. Con un resultado positivo de una prueba biológica en ratones, generalmente entre los días 7 y 15 después de la infección, se desarrolla una clínica de rabia paralítica.

Inicialmente, se notan letargo, pelaje despeinado y una especie de joroba, así como alteración de la coordinación de movimientos. Luego viene la parálisis de las extremidades posteriores y, más tarde, la parte delantera, que se convierte en parálisis general y termina en la muerte. La duración de la enfermedad es de 2-3 días.

Con el desarrollo de parálisis general, los ratones se sacrifican usando anestesia con éter o cloroformo. En ratones muertos y sacrificados, se abre la cavidad craneal, se inocula el cerebro en medios nutritivos, después de lo cual se extrae el cerebro, a partir del cual se preparan preparaciones para estudios microscópicos e inmunobiológicos.

En ausencia de manifestaciones clínicas de rabia en ratones infectados, se destruyen dentro de los 30 días. Los frascos en los que se guardaron se desinfectan minuciosamente.

Prueba biológica en conejos. Para preparar una muestra biológica se toman 4 conejos de al menos 1,5 kg cada uno. 2 conejos están infectados en el cerebro y 2 por vía intramuscular en el área del muslo. La suspensión se administra por vía intracerebral a una dosis de 0,2 ml y por vía intramuscular a una dosis de 2 ml.

Con un resultado positivo de la prueba biológica, los conejos se enferman dentro de los 16 a 21 días. La enfermedad de la rabia ocurre en conejos en forma paralítica silenciosa con un desenlace fatal. En conejos muertos, se extrae el cerebro y se realizan más investigaciones de la misma manera que cuando se infectan ratones. Los conejos se observan durante 45-50 días. Después del período especificado, los conejos se destruyen. Las jaulas en las que se mantuvieron los animales de experimentación se desinfectan.

IV. EXAMEN HISTOLÓGICO 1

1 El examen histológico se utiliza como un método adicional.

Para el examen histológico, se toman trozos de cuerno de Amón, corteza cerebral, cerebelo, bulbo raquídeo y se fijan en una o dos porciones de acetona de modo que la duración de la fijación sea de 6 a 18 horas.

Es mejor dejar la fijación en acetona durante la noche. Luego, el material patológico se pasa a través de dos porciones de xileno, manteniéndolas durante 30 minutos cada una, ya través de dos porciones de parafina, de 1 hora cada una. Las secciones preparadas se desparafinan por el método habitual y se tiñen según Lenz o Turevich:

Coloración según Lenz. Las secciones se tiñen con una solución de eosina durante 1-3 minutos (0,5 g de eosina se disuelven en 100 ml de alcohol etílico al 60%). La eosina se lava rápidamente con agua y se tiñe con azul de metileno de Lefleur durante 1 min, se lava con agua, se seca cuidadosamente con papel de filtro y se diferencia con una solución de unidades. quien sodio en alcohol absoluto (5 gotas de sosa cáustica por 30 ml de alcohol) a un color rosa pálido. Se vierte sobre la preparación una solución de ácido acético (1 gota de ácido acético glacial por 60 ml de alcohol absoluto) y se mantiene hasta que aparece un color azul pálido, se lava rápidamente con alcohol y se clarifica con xileno durante 4-5 minutos. Los cuerpos de Babesh-Negri están teñidos de rojo brillante con inclusiones azules, el citoplasma de las células ganglionares es azul pálido;

Coloración según Turevich. Las secciones desparafinadas inmediatamente después de pasar por alcoholes y agua destilada se tiñen con hematoxilina de Weigert o Ehrlich y se lavan con agua destilada. Luego se tiñe con una solución acuosa al 1% de fucsina ácida durante 1 min y se lava abundantemente con agua destilada hasta que aparece un tono rosa pálido. Después del lavado, se trata con una mezcla (a partes iguales) de una solución acuosa saturada de ácido pícrico (25-30 g de ácido pícrico por 1 litro de agua destilada caliente) y alcohol al 96%. Durante el procesamiento, se observa la descarga de nubes de pintura roja y las secciones adquieren un tinte amarillo después de 10 a 20 s. Las secciones se enjuagan rápidamente con agua y se secan ligeramente con papel de filtro. Luego, con la misma rapidez, se pasa por alcohol absoluto o de 96°, carbol-xileno, xileno puro y se coloca en un bálsamo. Los cuerpos de Babesh-Negri son de color rojo cereza, los núcleos de las células son negros o azules, según la hematoxilina con la que se tiñen. La forma y el tamaño de los cuerpos de Babesh-Negri son muy diversos, están ubicados en el citoplasma y los procesos de las células nerviosas en forma de copias numerosas o individuales. Más a menudo, los cuerpos de Babes-Negri se encuentran en células ganglionares grandes y las células que los contienen no tienen signos pronunciados de degeneración.

A menudo se encuentran otras inclusiones que, debido a una serie de características similares, a veces se confunden con cuerpos de Negri. Debe tenerse en cuenta que los cerebros de gatos sanos y ratones blancos a veces contienen cuerpos de inclusión acidófilos inespecíficos. Estos cuerpos pueden diferenciarse de los cuerpos de Negri por la ausencia de gránulos internos y la homogeneidad de la sustancia principal.

La rabia también se caracteriza por signos de encefalomielitis aguda: predominantemente alrededor de las venas pequeñas, se encuentran infiltrados perivasculares, que consisten principalmente en células linfoides que parecen manguitos celulares.

En las células ganglionares del cerebro, puede haber cromatólisis, vacuolización e inflamación aguda de las células, así como la muerte de células individuales. En el área de las células nerviosas dañadas, la reacción proliferativa de la glía es bastante constante, tomando la forma de una verdadera neuronofagia, seguida por el reemplazo de las células nerviosas con elementos de la glía multiplicada. Tal acumulación de células proliferantes en el sitio de una célula nerviosa desintegrada se denomina "nódulo de la rabia"; a veces, el proceso de desarrollo del nódulo se puede rastrear en una sección (1).