III. metode laboratorijske dijagnostike helmintijaza. Ispitivanje pražnjenja crijeva

7.7. Metode za određivanje održivosti jaja i ličinki helminta

Održivost jaja helminta određena je izgled, bojenjem vitalnim bojama, uzgojem u optimalni uvjeti i postavljanje biološkog uzorka.

7.7.1. Određivanje održivosti jaja ili ličinki helminta po izgledu

Jaja helminta se mikroskopiraju prvo pri malom, a zatim pri velikom povećanju. U deformiranim i mrtvim jajima helminta, ljuska je rastrgana ili savijena prema unutra, plazma je mutna, olabavljena. U segmentiranim jajima kuglice cijepanja (blastomeri) su nejednake veličine, nepravilnog oblika i često pomaknute na jedan pol. Ponekad postoje abnormalna jaja, koja se, imaju vanjske deformacije, normalno razvijaju. U živim ličinkama valjkastih crva fina zrnatost prisutna je samo u središnjem dijelu tijela, kako umiru, širi se cijelim tijelom, pojavljuju se velike sjajne hijaline vakuole, takozvani "nizovi bisera".

Da bi se utvrdila održivost zrelih jaja ascarids, whipworms, pinworms, aktivni pokreti ličinki trebaju biti uzrokovani laganim zagrijavanjem pripravka (na temperaturu ne veću od 37 ° C). Pogodnije je promatrati održivost ascarisa i ličinki bičaša nakon što su izolirani iz ljuske jajeta pritiskom na pokrovno staklo preparata iglom za seciranje ili pincetom.

Kod invazivnih ličinki askarida često se vidi klobuk koji se ogulio na vrhu glave, a kod ličinki bičaša koji su završili razvoj u jajetu, na tom se mjestu pri velikom povećanju nalazi stilet. Mrtve ličinke helminta, bez obzira na njihovu lokaciju (u jajetu ili izvan njega), primjećuju propadanje tijela. U tom slučaju unutarnja struktura ličinke postaje kvrgava ili zrnasta, a tijelo postaje mutno i neprozirno. Vakuole se nalaze u tijelu, a prijelomi se nalaze na kutikuli.

Preživljavanje onkosfera teniida (goveđe, svinjske trakavice itd.) određeno je kretanjem embrija kada su izloženi probavni enzimi. Jaja se stavljaju na satno staklo želučana kiselina psi ili umjetni duodenalni sok. Sastav potonjeg: pankreatin - 0,5 g, natrijev bikarbonat - 0,09 g, destilirana voda - 5 ml. Satna stakla s jajima stavljaju se u termostat na 36 - 38 °C 4 sata. U ovom slučaju, živi embriji se oslobađaju membrana. I ljuske živih onkosfera otapaju se u zakiseljenom pepsinu i u alkalnoj otopini tripsina nakon 6-8 sati u termostatu na 38 °C.

Ako se jaja teniida stave u 1%-tnu otopinu natrijevog sulfida ili 20%-tnu otopinu natrijevog hipoklorita ili u 1%-tnu otopinu klorirane vode na 36 - 38°C, zreli i živi embriji se oslobađaju ljuske i ne promjena tijekom 1 dana. Nezrele i mrtve onkosfere smežuraju se ili nabubre i dramatično se povećaju, a zatim se "otapaju" unutar 10 minuta do 2 sata. Živi embriji teniida također se aktivno kreću u mješavini 1% otopine natrijevog klorida, 0,5% otopine natrijevog bikarbonata i žuči na 36 - 38 ° C.

Preživljavanje fasciolia adolescariae sakupljenih s biljaka i drugih objekata u vodenim tijelima provjerava se njihovim ispitivanjem na stakalcu u fiziološkoj otopini pod mikroskopom sa stupićem za zagrijavanje. Kada se zagrije, ličinke trematoda u cisti počinju se kretati.

Za određivanje održivosti jajašca male trakavice najjednostavnija je metoda Ionina N.S.: u živim jajima, središnji par embrionalnih kukica je ili paralelan s bočnima, ili potonji tvore kut u bazi manji od od 45° s medijanom. U mrtvim jajima, bočni parovi formiraju kut pri bazi s srednjim parom većim od 45 °, ili su kuke nasumično razbacane (izgubio se njihov raspored parova); ponekad postoji naboranje embrija, stvaranje granularnosti. Točnija metoda temelji se na pojavi kretanja onkosfere tijekom oštre promjene temperature: od 5 - 10 ° do 38 - 40 ° C.

Određivanje održivosti nezrelih jajašaca nematoda treba proučavati u vlažnoj komori (Petrijeve zdjelice), stavljajući jajašca ascarisa u 3% otopinu formalina pripremljenu u izotoničnoj otopini natrijevog klorida na temperaturi od 24 - 30 °C, jaja bičaša u 3 % otopina klorovodične kiseline na temperaturi od 30 - 35 ° C; jajašaca pinworma u izotoničnoj otopini natrijeva klorida na 37 °C. Petrijeve zdjelice treba otvoriti 1 do 2 puta tjedno radi boljeg prozračivanja i ponovno navlažiti filter papir čistom vodom.

Promatranja razvoja jaja helminta provode se najmanje 2 puta tjedno. Odsutnost znakova razvoja unutar 2-3 mjeseca ukazuje na njihovu nesposobnost za život. Znakovi razvoja jaja helminta su najprije faze drobljenja, podjela sadržaja jaja u zasebne blastomere. Tijekom prvih dana razvija se do 16 blastomera koji prelaze u drugi stadij - morula itd.

Jaja ankilostoma se uzgajaju u staklenom cilindru (50 cm visine i 7 cm u promjeru) zatvorenom čepom. Mješavina jednakih volumena sterilnog pijeska, drvenog ugljena i izmeta s jajima glista, razrijeđena vodom do polutekuće konzistencije, pažljivo se izlije na dno cilindra pomoću staklene cijevi. Tijekom 1 - 2 dana taloženja u mraku na temperaturi od 25 - 30 ° C, rabditoidne ličinke se izlegu iz jaja, a nakon 5 - 7 dana postaju već filariformne: ličinke pužu uz zidove cilindra, gdje se vidljivi su čak i golim okom.

Jaja trematoda koja se prirodno razvijaju u vodi, kao što su opisthorchis, diphyllobothriids, fasciols i druge, stave se na satno staklo, Petrijevu zdjelicu ili u drugu posudu i prelije se malim slojem obične vode. Pri uzgoju jaja fasciola treba uzeti u obzir da se brže razvijaju u mraku, dok se miracidij stvara u živim jajima na temperaturi od 22-24 ° C nakon 9-12 dana. Kod mikroskopa razvoja jaja trematoda jasno su vidljivi pokreti miracidija. Fasciola miracidium izlazi iz ljuske jajeta samo na svjetlu.

Fullebornova metoda. Ličinke ankilostoma i strongilida uzgajaju se na agaru u Petrijevoj zdjelici sa životinjskim ugljenom. Nakon držanja u termostatu na temperaturi od 25 - 30 °C tijekom 5 - 6 sati, ličinke se šire po agaru, ostavljajući iza sebe stazu bakterija.

Metoda Harade i Morija. U epruvete postavljene u stalak doda se 7 ml destilirane vode. Drvenim štapićem uzeti 0,5 g fecesa i napraviti razmaz na filtar papiru (15 x 150 mm) 5 cm od lijevog ruba (ovo se radi na listu papira koji štiti površinu laboratorijskog stola). Zatim se traka s razmazom umetne u epruvetu tako da lijevi kraj bez razmaza dopre do dna epruvete. Gornji kraj prekrijte komadom celofana i čvrsto omotajte elastičnom trakom. Na epruvetu napišite broj, naziv predmeta. U tom stanju epruvete se čuvaju 8-10 dana na temperaturi od 28 °C. Da biste proučavali ličinke, skinite i uklonite celofanski poklopac i pincetom uklonite traku filter papira. U tom slučaju treba biti oprezan jer se mali broj infektivnih ličinki može pomaknuti na gornji kraj filter papira ili na stijenku epruvete i prodrijeti ispod površine celofana.

Epruvete se stave u kupelj s vrućom vodom na 50°C na 15 minuta, nakon čega se sadržaj protrese i brzo izlije u epruvetu za taloženje ličinki od 15 ml. Nakon centrifugiranja, supernatant se ukloni, a talog se prenese na predmetno stakalce, prekrije pokrovnim stakalcem i mikroskopira pod malim povećanjem.

Za diferencijalna dijagnoza filariformne ličinke, morate koristiti podatke u tablici 3.

Tablica 3

DIFERENCIJALNA DIJAGNOSTIKA FILARIJATIH LIČINKI A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, trICHOStrONGYLUS SP.

Larve	Dimenzije	Karakteristične značajke
A. duodenale	Duljina tijela oko 660 mikrona, kapa - 720 nm	Ispruganost klobuka je manje izražena, usna izbočina je manje uočljiva, prednji kraj tijela (ali ne i klobuka) je tup, promjer crijevne cijevi je manji od bulbusa jednjaka, kaudalni kraj je tup
N. americanus	Duljina tijela oko 590 μm, kapa - 660 nm	Ovojnica je zamjetno isprugana, posebno u kaudalnom dijelu tijela, usta djeluju tamno, prednji kraj tijela (ali ne i ovojnica) je zaobljen poput uskog kraja. kokošje jaje, prednji dio crijevne cijevi promjera poput lukovice jednjaka, rep je oštro zašiljen
S. stercoralis	Duljina tijela oko 500 µm	Ličinka bez ovojnice, jednjak je oko polovine dužine tijela, rep je tup ili razgranat
Trichostrongylus sp.	Duljina tijela oko 750 mikrona	Intestinalni lumen nije ravan, već cik-cak, kaudalni kraj je zaobljen i ima oblik gumba

7.7.2. Metode bojenja jaja i ličinki helminta

Mrtva tkiva u većini slučajeva percipiraju boje brže od živih. Ove se značajke koriste u helmintologiji za određivanje održivosti jaja i ličinki helminta. Međutim, u nekim slučajevima, neke boje bolje percipiraju živa tkiva nego mrtva.

Za diferencijalno određivanje živih i mrtvih jaja i ličinki koriste se sljedeće boje i metode.

Metilen plava leukobaza često se koristi za bojenje živih i mrtvih tkiva. Živa stanica ili tkivo reducira metilensko modrilo u bezbojnu leukobazu, mrtvo tkivo nema tu sposobnost i stoga dobiva boju.

Kriterij za stanje jajeta je bojenje embrija, ali ne i ljuske. Ova sposobnost povezana je s uvjetima smrti jaja. U onim slučajevima kada vlaknasta ljuska u mrtvom jajetu ne gubi svoja polupropusna svojstva, neće proći boje, stoga mrtvi embrij neće biti obojen. Obojeni embrij uvijek ukazuje na smrt jajeta.

Za bojanje jaja Ascaris možete koristiti metilensko plavo u otopini mliječne kiseline s kaustičnim alkalijama (metilensko plavo 0,05 g, kaustična soda 0,5 g, mliječna kiselina - 15 ml). Živa jaja ne percipiraju boju; embriji mrtvih jajašaca postaju plavi. Ličinke askarisa boje se bazičnom otopinom briljantno-krezil plave boje u koncentraciji 1:10 000 na sljedeći način: kap tekućine s jajima askarisa i kap osnovne otopine boje nanese se na predmetno staklo. Preparat se prekrije pokrovnim stakalcem koje se uz lagano lupkanje disekcijskom iglom čvrsto pritisne na predmetno staklo. Pod mikroskopom se promatra broj izleženih ličinki i stupanj njihove obojenosti; nakon čega se isti lijek ponovno pregledava nakon 2 do 3 sata. Živima se smatraju samo nedeformirane ličinke koje nisu obojane 2 sata. Mrtve ličinke ili ne izlaze iz jaja, ili se mrljaju kada se ljuska slomi (djelomično ili potpuno).

Pri određivanju održivosti jaja ascaridia ptica, moguće je bojenje pripravaka s 5% otopina alkohola jod. Kada se primjenjuje na lijek, embriji mrtvih ascarid jaja za 1 - 3 sekunde. obojeni su narančasto.

Mrtva jaja opistorhisa i onkosfere goveđe trakavice boje se otopinom toluidin modrila (1:1000), a mrtve onkosfere goveđe trakavice boje se otopinom briljant-krezil modrila (1:10000). U isto vrijeme zameci i ljuske i mrtvih i živih jaja dobivaju boju. Stoga se nakon bojenja ispiru jaja i onkosfere čista voda te ih dodatno obojati safraninom (u razrjeđenju 1:10 000 alkohol 10°C). Alkohol skida boju s ljuski, a safranin boji crveno. Zbog toga živa jaja postaju crvena; jaja s mrtvim embrijima - u plavoj boji, a ljuska ostaje crvena. Uginuli embriji onkosfera goveđe trakavice brzo se, u roku od nekoliko minuta, boje jarko crveno ili ružičasto safraninom ili plavo briljantno-krezil plavim u razrjeđenju 1:4000 ili indigo karminom u razrjeđenju 1:1000 - 1. :2000. Živi embriji ne mijenjaju se pod utjecajem ovih boja ni nakon 2 - 7 sati.

Za određivanje održivosti jaja patuljaste trakavice preporučuje se korištenje sljedećih boja:

1. Brilliant creasyl blue (1:8000) - nakon 1 sata, onkosfera mrtvih jajašaca je posebno jarko obojena, što se oštro ističe na blijedoj ili bezbojnoj pozadini ostatka jajašca.

2. Safranin (1:8000 kroz 2 sata i 1:5000 kroz 3 do 5 sati).

3. 50% otopina pirogalne kiseline u razrjeđenju 1:2 - kada je izložena 1 sat na temperaturi od 29 - 30 ° C (što je niža temperatura, to je duži proces bojenja).

7.7.3. Luminescentna metoda za proučavanje jaja i ličinki helminta

Fluorescentna mikroskopija omogućuje razlikovanje živih i mrtvih objekata bez oštećenja jajašca. Za fluorescenciju se ne koriste ultraljubičaste zrake, već plavo-ljubičasti dio vidljive svjetlosti, s konvencionalnim mikroskopom i stakalcima; iluminatoru OI-18 dodan je poseban set filtara u boji.

Živa i mrtva jajašca valjkastih glista, pinworma, malenih trakavica, goveđih trakavica, trakavica i drugih helminta različito svijetle. Ovaj fenomen se opaža i tijekom primarne luminiscencije bez upotrebe boja, i kada se boje fluorokromima (akridin narančasta, korifosfin, primulin, aurolin, berlerin sulfat, tripaflavin, rivanol, kinakrin itd.).

Neobojana, živa nesegmentirana jaja valjkastih crva svijetle svijetlo zeleno sa žućkastom nijansom; u mrtvim jajima ljuska emitira zeleno svjetlo puno jače od tamnozelenog embrionalnog dijela; kod jaja valjkastih glista s ličinkom pojavljuje se samo ljuska, dok su kod mrtvih i ljuska i ličinka svijetložute boje.

Nepigmentirana i nesegmentirana živa jaja pinworma i patuljastih trakavica emitiraju zelenkasto-žuto svjetlo; u mrtvim jajima ljuska intenzivno svijetli na pozadini tamnozelene embrionalne mase.

Uz sekundarnu luminescenciju (prilikom bojenja akridin narančastom u razrjeđenju 1: 10000 i 1: 50 000 od 30 minuta do 2 sata), ljuska živih i mrtvih nematoda, trematoda i cestoda različito svijetli.

Ljuska živih i mrtvih jajašaca askarida, toksokara, pinworma, male pantljičare, štakorske trakavice, bikove trakavice, trakavice postaje narančasto-crvena. Embriji živih jajašaca askarisa, toksaskarisa, štakorske trakavice, široke trakavice i onkosfere goveđe trakavice svijetle mutno tamnozelenom ili sivozelenom bojom. Mrtvi embriji jaja ovih helminta emitiraju "goruću" narančasto-crvenu boju. Žive ličinke pinworma i toksokari (ljuske jajeta) emitiraju mutno sivo-zelenu svjetlost, kada uginu, boja se mijenja od vrha glave do "goruće" svijetlo zelene, zatim žute, narančaste i na kraju u svijetlo narančastu.

Kada se boje fluorokromima - coryphosphyllum, primulin, mrtva jaja askarida i bičaša pokazuju sjaj od lila-žute do bakreno-crvene. Jaja sposobna za život ne svijetle, već postaju tamnozelena.

Živa jaja trematoda (Paragonimus i Clonorchis) ne svijetle nakon bojenja akridin narančastom, a mrtva jaja imaju žućkastozelenu boju.

Metoda luminiscencije također se može koristiti za određivanje održivosti ličinki helminta. Dakle, fluorokromizirane otopinom akridin narančaste (1: 2000) ličinke strongilata, rhabdita sjaje: žive - zelene (s nijansom), mrtve - jarko narančasto svjetlo.

Žive miracidije koje su izašle iz ljuske emitiraju prigušeno plavkasto svjetlo s jedva primjetnim svijetložutim vjenčićem cilija, ali 10-15 minuta nakon smrti pojavljuju se kao jarko "goruće" svijetlozeleno, a zatim narančasto-crveno svjetlo.

7.7.4. biološka metoda ispitivanja

Na primjer, za određivanje održivosti jaja askarisa (askaris svinje, ljudi, toxocara, toxascaris itd.) po životinji (zamorci, miševi) potrebno je najmanje 100 - 300 jaja s razvijenom ličinkom. Jajašca ascarisa u izotoničnoj otopini natrijevog klorida pipetira se kroz usta miša ili zamorca. Nakon 6-7 dana životinja se zakolje, otvori i zasebno joj se pregledaju jetra i pluća na prisustvo ličinki askarisa. Da biste to učinili, jetra i pluća se izrežu na male komadiće škarama i pregledaju prema metodi Berman ili Supryaga (odjeljak 6.1.2).

Ako su životinje bile zaražene živim invazivnim jajima, tada se na autopsiji u jetri i plućima nalaze migratorne ličinke ascarisa.

U slučaju infekcije, jajašca Fasciole u izmetu laboratorijskih životinja mogu se otkriti kod kunića nakon 2 mjeseca, u zamorci- nakon 50 dana, kod miševa - nakon 35 - 40 dana.

Za bržu reakciju, laboratorijske životinje se nakon 20-30 dana otvaraju i ispituju jetru na prisutnost mladih fasciola.

Da bi se utvrdila održivost jaja patuljaste trakavice, također se preporuča hraniti ih prethodno neinficiranim bijelim miševima, nakon čega slijedi autopsija životinja nakon 92-96 sati i otkrivanje cisticerkoida u crijevnim resicama ili cestoda u crijevnom lumenu.

Za određivanje održivosti jaja opisthorchisa preporučuje se metoda (njemački S.M., Beer S.A., 1984.), koja se temelji na fizikalno-kemijskoj aktivaciji žlijezde za izleganje miracidija i stimulaciji motoričke aktivnosti ličinke, što dovodi do otvaranja jaja. poklopac i aktivno oslobađanje miracidija u eksperimentalnim uvjetima.

Suspenzija jaja opisthorchisa u vodi prethodno se ohladi na 10 - 12 ° C (sve naredne operacije izvode se na sobnoj temperaturi 19 - 20 ° C). U epruvetu centrifuge doda se 1 kap suspenzije koja sadrži 100-150 jaja. Epruveta se stavlja u stativ na 5-10 minuta. Za to vrijeme sva jaja imaju vremena potonuti na dno. Zatim se trakom filter papira pažljivo odsisa višak vode i u epruvetu se dodaju 2 kapi posebnog medija. Medij je pripremljen u 0,005 M Tris-HCl puferu; U pufer se dodaje 12 - 13% otopina etanola i boja (magenta, safranin, eozin, metilensko modrilo itd.). Epruveta se protrese, njen sadržaj se pipetom prenese na predmetno staklo i ostavi 10 minuta uz lagano mućkanje. Zatim dodajte 2 kapi navedenog medija. Preparat je spreman za mikroskopiranje pod konvencionalnim svjetlosnim mikroskopom pri 20x povećanju.

Tijekom tog vremena, poklopac održivih ličinki se otvara, a miracidij aktivno ulazi u naznačeni medij. Zbog prisutnosti etanola u njemu, imobiliziraju se nakon 2-5 minuta i zatim se boje bojom. Mogu se lako otkriti i izbrojati pod mikroskopom.

Početna razina znanja i vještina.

Učenik mora znati:

1. Predstavnici trematoda opisthorch, paragonim, fasciola, dicrocelia.

2. Životni ciklusi, načini infekcije trematodama, klinička slika bolesti, rok trajanja fekalija

Student mora biti sposoban:

1. Na slikama, tablicama prepoznajte jaja trematoda.

2. Formirati preventivne mjere.

3. Pripremiti nativni bris, veliki bris, Kato bris, ocijeniti svoj rad, rad s mikroskopom.

4. Odredite jaja trematoda u pripravcima, pridržavajte se pravila zaštite na radu, pridržavajte se pravila san.-epid. način rada.

Struktura lekcije:

Teorijski dio:

Ø Mikropredavanje.

Praktični dio:

Ø Priprema nativnog razmaza, velikog razmaza, Kato razmaza, procjena učinka, mikroskopija

Mikropredavanje.

Prikupljanje i dostava građe

Konačna dijagnoza helmintijaze može se postaviti samo na temelju rezultata laboratorijska istraživanja. glavna metoda laboratorijska dijagnostika helmintijaze je otkrivanje jaja ili ličinki helminta u izmetu, urinu, krvi i drugim biološkim tekućinama tijekom mikroskopskog pregleda. Materijali za istraživanje su izmet, sadržaj duodenum, krv, ispljuvak, biopsija tkiva i drugi materijali.

Prikupljanje materijala za istraživanje provodi se u čistim staklenim ili plastičnim posudama uz koje se prilaže uputnica s punim nazivom ispitanika. Tijekom masovnog pregleda dopušteno je skupljati izmet u voštane papirnate čaše, plastične vrećice.

Izmet za analizu treba dostaviti u laboratorij najkasnije jedan dan, a ako se sumnja na strongiloidijazu, odmah nakon izolacije. Ako se ovo pravilo krši, dijagnoza u vezi s uništavanjem jaja ili ličinki često postaje teška ili nemoguća.

Za identifikaciju jaja i ličinki nekih vrsta helminta koriste se posebne metode: Bormannova metoda, perianalno struganje, metoda razmazanog otiska pomoću ljepljive trake, uzgoj ličinki na filtar papiru (metoda Harada i Mori) itd.

Praktični dio:

Najčešće metode ispitivanja fecesa na prisutnost jaja helminta su metode nativnog razmaza, debelog razmaza pod celofanom i velikog razmaza.

Prilikom proučavanja jaja helminta pod mikroskopom, preporučljivo je usporediti vidljiva slika sa svojim karakteristikama u odrednici jaja helminta.

Metoda nativnog razmaza

Oprema:

stakleni predmeti;

široka kiveta;

plastični štapići;

olovka;

50% vodena otopina glicerina (pomiješajte jednake dijelove glicerina i destilirane vode);

posuda s 0,5% otopinom polideza;

mikroskop.

Napredak

1. Stakalca rasporedite u kivetu, stakalca označite brojevima.

2. Pipetom nanesite 2 kapi 50% vodene otopine glicerina na razmak 4 cm jedna od druge na stakalce.

3. Štapićem uzeti komadić izmeta, veličine glavice šibice (30-50 mg), dodati ga u kap glicerina i samljeti do jednolične suspenzije.

4. Na svakom staklu pripremaju se dva nativna razmaza koji se ne smiju međusobno spajati i ne dosezati do rubova kako ne bi zamrljali prste laboranta. Za svaki uzorak koriste se novi štapići.

5. Ne pokrivajući preparate pokrovnim stakalcima, pregledati pod mikroskopom (objektiv 8x, okular 10-15x).

6. Na kraju studije uronite preparate u posudu s 0,5% otopinom polideza.

Metoda debelog razmaza ispod celofana.

Metodu su predložili K. Kato, M. Miur 1954. Bris je sloj nerazrijeđenog izmeta na predmetnom stakalcu, pritisnut ispod sloja tankog higroskopnog celofana impregniranog glicerinom.

Riža. Priprema debelog namaza ispod celofana:

a - nativni bris; b - prešanje komadića izmeta prekrivenog celofanom s gumenim čepom; c - debeli razmaz ispod celofana (prema Yu.A. Berezantsev i E.G. Avtushenko, 1976.)

Oprema:

široka kiveta;

trake celofana 22x30 mm tretirane smjesom Kato 24 sata;

Kato mješavina (3% otopina malahit zelene -6 ml, 6% otopina fenola - 500 ml, glicerin - 500 ml, 3,5 ml smjese dovoljno je za 100 traka);

veliki gumeni čepovi;

anatomske pincete;

plastični štapići;

olovka;

mikroskop.

Napredak

1. Stakalca rasporedite u kivetu, stakalca označite brojevima.

2. Štapićem pokupite izmet veličine pola zrna graška (50-60 mg) i stavite ga na predmetno staklo u sredini.

3. Uklonite Kato-tretiranu celofansku traku iz staklenke pincetom i stavite je na uzorak stolice na predmetnom staklu.

4. Pritisnite celofan gumenim čepom tako da se izmet ravnomjerno rasporedi, a da ne teče preko rubova trake.

5. Ostavite pripravak dok ne bude bistar 60 minuta i zatim ga pregledajte pod mikroskopom (objektiv 8-40x, okular 10x).

6. Na kraju studije, lijek se spušta u posudu s 0,5% otopinom polideza.

7. Uklonite radno mjesto, Operite ruke.

Metoda velikog razmaza.

Metodu je predložio Yu.A. Berezantsev i E.G. Avtushenko 1973. Suština metode temelji se na korištenju binokularnog mikroskopa i nativnog razmaza na staklu 6x9 cm, koji omogućuje istovremeno ispitivanje do 200-300 mg izmeta.

Oprema:

staklo 6x9 cm i 7x10 cm;

plastični štapići;

50% otopina glicerina (glicerin i destilirana voda u jednakim dijelovima);

posuda s 0,5% otopinom polideza;

mikroskop;

emajlirana kiveta;

olovka.

Napredak

1. Stakalca 7x10 cm rasporedite u kivetu, stakalca označite brojevima.

2. Zatim postavite drugo stakalce veličine 6x9 cm na svako stakalce.

3. Pipetirajte 15-20 kapi 50% otopine glicerola na predmetno staklo 6x9 cm.

4. Izvadite štapić razna mjesta komadiće izmeta veličine prosječnog zrna graška (200-300 mg) i spusti u otopinu 50% glicerola na stakalcu.

5. Utrljajte štapićem komadić izmeta u glicerinu dok se ravnomjerno ne objesi tako da površina koju zauzima bude oko 33-34 cm 2. Ne pokrivajte razmaz pokrovnim stakalcima.

6. Podignite veliko pokrovno stakalce veličine 7x10 cm za rubove, zajedno s velikim mrljem na njemu (da ne zaprljate prste).

7. Pregledajte veliki razmaz pri povećanju od 34x (objektiv 2x, okular 17x) i 50x (objektiv 4x, okular 12,5x). U sumnjivim slučajevima, studije se provode pri velikom povećanju.

8. Na kraju studije, lijek se spušta u posudu s 0,5% otopinom polideza.

9. Očistite radno mjesto, operite ruke.

Ovom metodom istraživanja utvrđuju se velika jajašca helminta (okrugli crv, glista, kukasta glista, pinworms, široka trakavica, teniid, fascioli). Izgledaju malo drugačije, pa je potrebno malo iskustva da ih se brzo uoči. Veliki brisevi mogu se koristiti za testiranje jajašca šistosoma i ličinki akni. Veliki bris sadrži 6-10 puta više test materijala nego nativni bris. Njegova učinkovitost je mnogo veća.

Slične informacije.

Materijal za istraživanje: feces, urin, duodenalni sadržaj, sputum, krv, koža, perianalni dendrit, mišićno tkivo.

Mikroskopske metode istraživanja temelje se na otkrivanju jaja i ličinki helminta. Ovisno o ciljevima istraživanja, dijele se na kvalitativne i kvantitativne.

1. Metoda debelog razmaza po Katu. Princip metode je da se jaja helminta nalaze u debelom razmazu izmeta, pročišćenom glicerinom i obojenom malahitno zelenom bojom. Metoda je najučinkovitija za ascariasis, trichuriasis, diphyllobothriasis, teniidosis i, u manjoj mjeri, za ankylostomiasis i patuljastu trakavicu.

3. Metoda obogaćivanja(Kofoid - Barbera) temelji se na principu plutanja jaja u zasićenoj otopini stolna sol. Možete pronaći jaja trematoda, široke trakavice, onkosfere, taenide, neoplođena jaja okruglih crva.

4. Kalantaryan metoda- princip je isti kao u prethodnom, ali se kao flotacijska otopina koristi zasićena otopina dušikovog nitrata.

5. Postojati posebne metode pregled fecesa na prisutnost fascioliaze, strongiloidijaze, ankilostomijaze.

6. Preanalna i perianalno-rektalna metoda dijagnoza enterobiasis. Struganje se radi ujutro (prije toaleta i pražnjenja crijeva) ili navečer tijekom spavanja.

Vrlo je važno znati

Jednostavne metode

makroskopska metoda. Prilikom pregleda izmeta mogu se otkriti helminti, njihove glave, segmenti, fragmenti strobila koji se izdvajaju sami ili nakon dehelmintizacije. Ova se metoda posebno preporuča za otkrivanje enterobioze, tenijaze i teniarhinkoze.

Male količine izmeta pomiješaju se s vodom u ravnoj kupki ili Petrijevoj zdjelici i, gledajući pri dobrom svjetlu na tamnoj pozadini, po potrebi pomoću povećala, pincetom ili pipetom uklanjaju helminte i sve sumnjive bijele formacije. Prikupljeni materijal se prenosi u drugu šalicu s vodom ili na predmetno staklo u kapi razrijeđenog glicerina ili izotonične otopine natrijevog klorida za daljnje proučavanje.

Kod metode taloženja, cijeli testni dio izmeta treba pomiješati s vodom u staklenom cilindru, a zatim pažljivo ocijediti gornji sloj vode. To se ponavlja nekoliko puta. Kad tekućina postane prozirna, ocijedi se, a talog se gleda u malim obrocima u staklenoj kupki ili Petrijevoj zdjelici, kako je gore navedeno.

Mikroskopske metode su glavna metoda ispitivanja izmeta za otkrivanje jaja ili ličinki helminta. Razne metode studije su opisane u nastavku. Kako bi se povećala pouzdanost pregleda, analize se mogu ponavljati nekoliko puta dnevno ili u razmaku od 1-3 dana.

Metoda nativnog razmaza. Nativni bris je najčešća i tehnički dostupna metoda za pretragu fecesa. U nativnom razmazu mogu se naći jajašca i ličinke helminta svih vrsta. Međutim, s malim brojem jaja u izmetu, oni se ne nalaze uvijek. Stoga proučavanje fecesa samo uz pomoć nativnog razmaza nije potpuno i treba ga nadopuniti metodama obogaćivanja. Učinkovitost pregleda nativnog razmaza značajno je poboljšana gledanjem četiri preparata pripremljena iz fekalnog uzorka na dva stakalca bez pokrovnih stakala, što omogućuje pregled ukupno približno iste količine fecesa kao kod Kato metode (vidi dolje).

Mala količina (veličine glavice šibice) promiješanog izmeta tanko se razmaže drvenim štapićem po površini predmetnog stakla u kapi 50% otopine glicerina. Obično se pripremaju dva razmaza na jednom staklu. Razmaz se gleda pod malim povećanjem mikroskopa (ob. 8, app. 7). U dvojbenim slučajevima pokrije se pokrovnim stakalcem i pregleda pod velikim povećanjem (ob. 40).

Za pripremu velikog nativnog razmaza 200-300 mg fecesa (veličine velikog zrna graška) samelje se na staklu 6x9 cm u 15-20 kapi 50% vodene otopine glicerina. Gledano pod binokularnim stereoskopskim mikroskopom (sv. 4, cca. 12,5 ili sv. 2, cca. 17) u propuštenom svjetlu bez pokrovnih stakala. U sumnjivim slučajevima, možete prevesti leću na veće povećanje. U takvim razmazima jasno su vidljiva obojena velika jaja helminta, a prozirna jaja patuljaste trakavice su nešto lošija. Ova metoda nije prikladna za otkrivanje malih jaja. Istodobno, veliki volumen proučavanog materijala i veliko vidno polje s visokom dubinom polja pružaju značajnu učinkovitost ove modifikacije u usporedbi s konvencionalnim nativnim razmazom.

Debeli celofanski razmaz (Kato metoda) učinkovitiji je od pregleda nativnog razmaza, ali ga također treba kombinirati s metodama obogaćivanja. Otkrivaju se jajašca svih vrsta helminta, no da bi se otkrila jajašca male trakavice (prozirna jajašca) ili opisthorchisa (mala jajašca), laborant mora posebno paziti da ih ne promaši (slika 21).

Metoda se temelji na otkrivanju jajašaca helminta u debelom razmazu izmeta, pročišćenom glicerinom i obojenom malahitno zelenom bojom. Hidrofilni celofan se prethodno izreže na ploče 20 x 40 mm i uroni u Kato smjesu (6 ml 3% vodene otopine malahitnog zelenila, 500 ml glicerola, 500 ml 6% otopine fenola). 3-5 ml mješavine dovoljno je za 100 pločica koje su spremne za upotrebu u jednom danu i mogu se u istoj smjesi u dobro zatvorenoj posudi na sobnoj temperaturi čuvati 6 mjeseci. U nedostatku malahitnog zelenog (preporučuje se za smanjenje umora očiju laboratorijskog pomoćnika) i fenola ( dezinfekcijsko sredstvo) možete koristiti samo 50% vodenu otopinu glicerola, učinkovitost studije se ne smanjuje.

Riža. 20. Metoda pripreme debelog razmaza fecesa celofanom po Katu

100 mg izlučevine nanese se na predmetno stakalce, pokrije se celofanskom pločom tretiranom na gore navedeni način i pritisne gumenim čepom tako da se izmet ne širi ispod celofana. Mikroskopiranje pri malom ili velikom povećanju mikroskopa provodi se najkasnije 1 sat (po vrućem vremenu - 30-40 minuta) nakon pripreme razmaza. Razlog neprozirnosti pripravka može biti debeli sloj izmeta, loša obrada ploče u smjesi Kato, nedovoljno vrijeme izlaganja pripravka pod celofanom. Dugotrajno čišćenje glicerinom i prekomjerno sušenje preparata također otežavaju otkrivanje jaja.

Metoda uvijanja prema S.S. Shulman. Metoda je predložena za detekciju ličinki helminta u izmetu, prvenstveno Strongiloida. Pregledava se samo svježe izlučeni izmet, od kojeg se 2-3 g prenese u staklenu posudu, staklenim štapićem kružnim pokretima promiješa s 3-5 puta većom količinom fiziološke otopine, ne dodirujući stijenke posude. U središtu se nakupljaju jaja i ličinke helminta. Nakon miješanja, kap na kraju štapića brzo se prenese na predmetno stakalce, prekrije pokrovnim stakalcem i pregleda pod mikroskopom.

metode obogaćivanja. Metode obogaćivanja temelje se na razlici u specifičnoj težini jaja i korištenoj otopini soli, što omogućuje otkrivanje male količine jaja. Ako je specifična težina jajašca veća od specifične težine tekućine, tada su jajašca koncentrirana u sedimentu koji se ispituje pod mikroskopom. Ova metoda sedimentacije koristi se za jaja trematoda. S većom specifičnom težinom otopine, jajašca isplivaju na površinu tekućine, a zatim se film pregleda. To su flotacijske (plutajuće) metode, najučinkovitije su za otkrivanje jajašca ankilostoma, bičaša i pantljičara.

metode flotacije. Fulleborn metoda temelji se na plutanju jaja helminta u zasićenoj otopini natrijevog klorida, koja ima visoku relativnu gustoću (1,2), što omogućuje otkrivanje jajašaca s malim brojem istih. Metoda je učinkovitija od proučavanja nativnog razmaza, iako je teža. Prednosti metode su jeftinost i dostupnost. Preporuča se kombinirati proučavanje nativnog razmaza i Fülleborn metode.

Zasićena otopina se priprema otapanjem 400 g natrijevog klorida u 1 litri vode uz kuhanje. Relativna gustoća otopine je 1,18-1,22. Otopina se čuva u zatvorenoj bočici. Za analizu se 2-3 g izmeta stavi u staklenku zapremine 30-50 ml i uz miješanje štapićem doda se gotovo do vrha zasićena otopina natrijevog klorida. Traka papira brzo uklanja plutajuće velike čestice. Nakon 45-60 min. taložiti žičanom petljom, ukloniti površinski film i prenijeti ga na predmetno staklo u kapi 50% vodene otopine glicerola. Umjesto uklanjanja filma omčom, možete dodati otopinu u staklenku do vrha, pokriti predmetnim staklom, na čiju se površinu lijepe plutajuća jaja. U pripremi je nekoliko priprema. Dodatno, 2-4 preparata se gledaju iz sedimenta, uzimajući ga pipetom za oko na 2 predmetna stakla. Osim površinskog filma, također je potrebno ispitati sediment, jer jaja trematoda, taeniida, neoplođena jaja ascarisa ne plutaju u ovoj otopini. Jaja brojnih helminta ne plutaju odmah u slanoj otopini. Dakle, ako najveći broj jajašca male trakavice ispliva nakon 15-20 minuta, askaris - nakon 1,5-2 sata, bičaš - nakon 2-3 sata.

Dakle, prednosti ove metode uključuju njenu jeftinost i dostupnost, nedostatke su potreba za promatranjem preparata na površinskom filmu i sedimentu, kao i trajanje taloženja.

Metoda E. V. Kalantaryana također je metoda obogaćivanja, ali je učinkovitija i jednostavnija od Füllebornove metode. Koristi se zasićena otopina natrijeva nitrata relativne gustoće 1,38. Stoga jaja većine helminta isplivaju i nalaze se u površinskom filmu; ispitivanje sedimenta nije potrebno.

Za pripremu zasićene otopine natrijevog nitrata, 1 kg soli natrijevog nitrata (natrijevog nitrata) otopi se u 1 litri vode i kuha dok se potpuno ne otopi i na površini ne stvori film. Bez filtracije uliti u suhu bocu. U nedostatku natrijevog nitrata, može se zamijeniti amonijevim nitratom (amonijevim nitratom), otapanjem 1,7 kg na 1 litru vode. Relativna gustoća dobivene otopine je 1,3, što donekle smanjuje učinkovitost u odnosu na otopinu natrijeva nitrata.

Prednosti metode: jajašca većine helminta brzo izlaze i nalaze se u površinskom filmu, što eliminira potrebu proučavanja sedimenta. Nedostaci metode su nedostatak natrijevog nitrata, kao i činjenica da jaja trematoda, onkosfere taeniida ne plutaju i ostaju u sedimentu. Treba imati na umu da s produljenim (više od 1-2 sata) izlaganjem fecesu u otopini, jaja nekih helminta počinju bubriti i taložiti se, nestajući s površinskog filma.

metode taloženja

Metoda P. P. Goryacheva temelji se na principu taloženja jaja. Razmaz je u ovom slučaju lagan, bez grubih nečistoća, što olakšava otkrivanje malih jajašaca trematoda (opisthorchia, itd.). Specifična težina jaja opisthorcha je velika, tako da ne plutaju u slanim otopinama.

70-100 ml zasićene otopine natrijevog klorida ulije se u cilindar promjera 2-3 cm. Posebno dobro promiješajte 0,5 g fecesa u 20-25 ml vode i pažljivo procijedite kroz lijevak s dva sloja gaze u cilindar na slana otopina, izbjegavajući miješanje (tako da se formiraju dva jasno razgraničena sloja). Nakon 2-3 sata pipetom se odsisa gornji sloj s izmetom, a preostala fiziološka otopina ostavi stajati 12-20 sati ili centrifugira. Talog se pipetira na predmetno stakalce, prekrije pokrovnim stakalcem i mikroskopira.

Gorjačevljeva metoda predložena je za detekciju jajašca opistorha i pokazala se učinkovitijom od pregleda nativnog brisa i Füllebornove metode. Trenutno se za dijagnozu opisthorchiasis (clonorchiasis) metode Kato i Kalantaryan preporučuju kao prilično učinkovite i tehnički jednostavnije.

Metoda Krasilnikova. Pod utjecajem surfaktanata, koji su dio deterdženti(deterdženti), jaja helminta oslobađaju se iz fecesa i koncentriraju u sedimentu.

Prethodno se pripremi 1% otopina praška za pranje Lotus. Da biste to učinili, 10 g praha se otopi u 1 litri voda iz pipe. U nedostatku "Lotusa" možete koristiti druge praškovi za pranje, ali svaki od njih mora se uzeti onoliko koliko će se otopiti bez stvaranja taloga u 1 litri vode iz slavine. 20-30 ml otopine deterdženta ulije se u staklenu posudu kapaciteta 30-50 ml, tamo se stavi mali dio izmeta i dobro promiješa. Omjer izmeta i otopine trebao bi biti otprilike 1:20. Izmet mora biti u otopini najmanje jedan dan. Za to vrijeme na dnu se stvara talog od 2-3 sloja. Donji sloj sastoji se od grubih teških čestica, jaja helminta skupljaju se u srednjem sloju, gornji sloj su bjelkastosive pahuljice. Zatim se pipetom sakupi 2-3 kapi tekućine iz srednjeg sloja i prenese na predmetno staklo. Na jednom staklu se pripreme 2 preparata, pokriju pokrovnim stakalcem i mikroskopiraju.

Metoda Krasilnikov omogućuje vam otkrivanje jaja svih vrsta helminta koji se izlučuju s izmetom.

Eter-formalinska metoda sedimentacije i kemijsko-sedimentacijska metoda su vrlo naporne, s visokom učinkovitošću, posebno u masovnim ispitivanjima, stoga je svrsishodnije koristiti eter-octenu metodu. Omogućuje, nakon dodatne obrade sedimenta kemijskim reagensima, da se u njemu dobiju praktički samo jaja helminta, što olakšava identifikaciju malih jaja trematoda. Ova se metoda pokazala univerzalnom, otkrivajući jaja svih crijevnih helminta, ciste crijevnih protozoa, također se može koristiti za kvantifikacija intenzitet invazije.

Ulijte 7 ml 10% otopine u graduirane epruvete centrifuge. octena kiselina i dodajte 1 g fecesa do oznake od 8 ml. Fekalije se štapićem dobro izmiješaju dok se ne dobije homogena smjesa, a zatim kroz dva sloja gaze filtriraju u drugu epruvetu centrifuge (tako da u novoj epruveti filtrirane otopine opet bude 8 ml, ako je manje, onda možete dodatno isprati lijevak s zavojem s 10% otopinom octene kiseline, kroz koji se filtrira fekalna otopina). U ovu epruvetu dodajte 2 ml etera (do oznake od 10 ml), začepite i snažno protresite 30 sekundi. Smjesa se centrifugira na 3000 okretaja u minuti 1 minutu (ili 2 minute na 1500 okretaja u minuti). Koagulacijski sloj (u obliku čepa u gornjem dijelu epruvete) štapićem se odvoji od stijenki epruvete i zajedno sa supernatantom pažljivo ocijedi. Talog (obično mali, bezbojan) se pipetom nanese na stakalce, pokrije pokrovnim stakalcem i mikroskopira.

Najčešće se infekcija helmintima javlja putem kontaminirane hrane, vode, ali i kroz neoprane ruke.

Izravne i neizravne metode dijagnosticiranja helmintijaza

Do danas su razvijene mnoge metode dijagnostika helmintijaze, ali sve se mogu podijeliti u dvije velike skupine: izravni i neizravni. Izravne dijagnostičke metode uključuju one studije koje vam omogućuju izravno identificiranje helminta, njihovih fragmenata, ličinki ili jaja. Neizravne metode za dijagnosticiranje helmintijaza temelje se na identifikaciji sekundarnih promjena karakterističnih za određenu vrstu helmintijaza.

Najpopularnije izravne metode za dijagnosticiranje helmintijaza su makro- i mikrohelmintoskopske metode istraživanja.

Makrohelmintoskopske metode istraživanja

Pitanja čitatelja

18. listopada 2013., 17:25 Dobar dan. Već oko godinu dana osjećam svrbež oko anusa. Nijedan bol. Reci mi kome da se obratim i što bi to moglo biti? Hvala

Pitati pitanje

Mikrohelmintoskopske metode istraživanja

Imunološke metode istraživanja

Dijagnoza helmintijaza temelji se na otkrivanju specifičnih protutijela na određene helminte u krvnom serumu. Za imunološke studije koristi se metoda neizravne hemaglutinacije, enzimski imunološki test, imunoelektroforeza, imunoapsorpcija i druge serološke metode ispitivanja krvi.

Imunološke metode istraživanja koriste se za dijagnosticiranje alveokokoze, ehinokokoze, cisticerkoze, ascariasis, shistosomiasis i drugih helmintijaza.

Analiza žuči i duodenalnog sadržaja

Biopsija

Elektropunkturna dijagnostika

Elektropunkturna dijagnostika temelji se na analizi otpornosti kože pri iritaciji njezinim slabim djelovanjem elektro šok. Elektropunkcijska dijagnostika za sumnju na helmintijazu može se provesti na dva načina: Voll metodom ili rezonantnim testiranjem.

Instrumentalne metode istraživanja

Kod helmintijaze se također provodi ultrazvučni postupak, FEDGS i računalna dijagnostika. Ove metode omogućuju određivanje stupnja štete uzrokovane helmintima, kao i određivanje stanja pojedinih organa.