BRZA DIJAGNOSTIKA BJESNOĆE

Metode za dokazivanje antigena. U slučaju bjesnoće za ekspresnu dijagnostiku mogu se koristiti metode fluorescentnih protutijela (MFA), reakcije taloženja (RP) u agar gelu, metode enzimskog imunološkog testa (ELISA), lančane reakcije polimerazom (PCR). Za dijagnosticiranje bjesnoće kod ljudi in vivo potrebno je nekoliko testova.

Određivanje antitijela na antigene virusa bjesnoće. Dokazivanje protutijela u krvnom serumu ili cerebrospinalnoj tekućini važna je dijagnostička metoda. Serološko testiranje antitijela specifičnih za bjesnoću provodi se u krvnom serumu kako bi se utvrdilo cijepljenje prije i nakon izlaganja i odredilo vrijeme docjepljivanja kako bi se povećao imunološki odgovor.

Izolacija virusa. Za izolaciju i identifikaciju virusa koristi se metoda biotestiranja na bijelim miševima. Ispitni materijal se suspendira u fiziološkoj otopini koja sadrži antibiotike i fetalni goveđi serum. Suspenzija se daje intracerebralno bijelim miševima težine 5-6 g. Za dokazivanje razvoja infekcije miševi se svakodnevno promatraju do 30. dana nakon inokulacije. Miševi koji razviju bolest tijekom tog razdoblja odmah se eutanaziraju, a moždana tkiva se ispituju izravnim MFA.

Prednost ovog pristupa je mogućnost otkrivanja malih količina virusa bjesnoće u materijalu. Nedostatak metode je potreba za mnogo dana (7-18 dana) čekanja između inokulacije i manifestacije prvih znakova bolesti. Da bi se smanjilo razdoblje inkubacije, koriste se miševi koji sisaju. Miševi mlađi od 3 dana mogu se koristiti za ekspresnu dijagnostiku: kod miševa zaklanih nakon 3 dana virusni antigen već je detektiran u mozgu, što se može detektirati pomoću MFA.

Ova metoda izolacije virusa provodi se kao potvrdni dijagnostički test za negativne rezultate za otkrivanje antigena i Babes-Negrijevih tjelešaca te u slučaju ugriza osobe od strane životinje sumnjive na bjesnoću. Omogućuje odgovarajuću osjetljivost i specifičnost, tj. smatra se na razini dijagnostičkog značaja metode izravne imunofluorescencije. Osim toga, ova metoda je glavna za identifikaciju varijanti virusa i obećava za razvoj dijagnostičkih reagensa.

Izolacija i identifikacija virusa u kulturi stanica. Glavni nedostatak izolacije virusa tijekom infekcije laboratorijskih životinja je trajanje metode. To se može izbjeći korištenjem staničnih kultura. Obično se u te svrhe koristi kultura stanica mišjeg neuroblastoma ako je potrebno ispitati moždana tkiva. Mozak se suspendira u hranjivom mediju kulture, suspenzija se nanosi na monosloj stanične kulture i inkubira jedan do nekoliko dana.

Osjetljivost određene kulture na virus može se povećati tretiranjem DEAE dekstranom. Stanični monosloj se zatim ispere, fiksira na hladnom acetonom ili mješavinom formalina i metanola i ispita imunofluorescencijom. Ako je životinja bila zaražena virusom bjesnoće, tada se u monosloju stanične kulture otkrivaju citoplazmatske inkluzije antigena virusa bjesnoće.

Pokazalo se da se antigen virusa bjesnoće može detektirati na stanicama neuroblastoma miša Na C1 300 u kombinaciji s MFA nakon 2 dana. Osjetljivost metode usporediva je s onom izolacije virusa u miševa.

Iako virus bjesnoće ima obaveznu neuropatogenost in vivo, sposoban je zaraziti širok raspon stanica domaćina in vitro, što se može koristiti za testiranje drugih tkiva i organa na prisutnost virusa bjesnoće. Utvrđeno je da se virus bjesnoće razmnožava u BHK-21 i Vero stanicama, u primarnim stanicama kokošjih embrija ili bubrega hrčka. Dokazano je da se adsorpcija virusa i njegovo uvođenje u stanicu odvija unutar 7 sati. Nakon 24-48 sati unutar stanice stvaraju se nove virusne čestice, nakon 72 sata pupaju iz stanične membrane u međustanični prostor.

Metode istraživanja

Za ekspresna dijagnostika bjesnoće može se koristiti:

a) metoda IFA- otkrivanje antigena virusa bjesnoće u otiscima rožnice ili stražnjeg dijela vrata bolesnika koji sadrže folikule dlake;
b) metoda PCR- za otkrivanje RNK virusa u uzorcima biopsije tkiva, slini, cerebrospinalnoj ili suznoj tekućini;
c) metoda ELISA- za otkrivanje specifičnih protutijela (antigena) u bolesnika s tipičnim ili atipičnim tijekom.
d) metoda biološki testovi- za izolaciju virusa u ranoj fazi bolesti ili za otkrivanje antitijela u krvi ili likvoru u kasnijoj fazi bolesti. Za ekspresnu dijagnostiku koristi se složena metoda (biotest + MFA), koja se sastoji u inficiranju 2-dnevnih novorođenih miševa ispitivanim materijalom i pregledu njihovog mozga 3-4 dana u MFA.

Izbor metoda in vivo dijagnostike uvelike ovisi o stadiju bolesti: metoda koja se temelji na detekciji antigena u pravilu je visoko osjetljiva na kraju razdoblja inkubacije, tijekom prvih nekoliko dana bolesti, dok se antitijela koja neutraliziraju virus obično pojavljuju u cerebrospinalnoj tekućini i serumskoj krvi nakon 7-10 dana od početka bolesti.

Reakcija imunofluorescencije. Metoda se temelji na upotrebi antitijela vezanih za boju, na primjer, fluorescein izotiocijanat. RIF se široko koristi za otkrivanje virusnih antigena u materijalu pacijenata i za brzu dijagnozu.

Metoda ima najveći stupanj osjetljivosti, osnova je za brzu dijagnostiku i omogućuje otkrivanje virusnih antigena unutar nekoliko sati.

Glavne prednosti MFA su: brzina izvođenja, visoka specifičnost (100%). Vrijeme provedeno na dijagnosticiranju bolesti uz njegovu pomoć je manje od jednog dana. Koriste se izravne i neizravne verzije MFA.

Izravna imunofluorescencija ostaje preferirana metoda za dijagnosticiranje bjesnoće. Predmetna stakla koja sadrže razmaze-otiske moždanih tkiva, ili stakla s jednoslojnom tkivnom kulturom fiksiraju se u acetonu 1-4 sata. Preparati se zatim suše i tretiraju fluorescentnim poliklonskim anti-nukleokapsidnim protutijelima (imunofluorescentni reagens).

Ovaj reagens je konjugat pripremljen od specifičnih poliklonskih antitijela klase IgG na nukleokapsidni antigen virusa i fluorescein izocijanata (FITC). Specifična protutijela dobivaju se hiperimunizacijom životinja (zečeva, hrčaka ili konja) mješavinom nukleokapsidnih epitopa virusa.

Trenutno se u te svrhe sve više koriste mišja monoklonska protutijela na nukleokapsid virusa bjesnoće. Nakon 30-minutne inkubacije na 37°C, dijagnostički preparati se više puta isperu fiziološkom otopinom i destiliranom vodom.

Protutijela obilježena FITC-om fiksiraju se samo na mjestima lokalizacije virusnih nukleoproteinskih antigena. Preparati se zatim suše na zraku i ispituju svjetlosnim mikroskopom uz korištenje ksenon lampe i odgovarajućeg filtera kao izvora svjetlosti.

Na neizravna verzija antigen se prvo kombinira s neobojenim specifičnim imunološkim serumom. Zatim se formirani nefluorescentni kompleksi antigen-protutijelo izlažu imunološkom serumu obilježenom fluorokromom koji sadrži antitijela na specifične serumske proteine. Neizravna verzija MFA, uz detekciju antigena, omogućuje kvantificiranje antitijela u testnom serumu odgovarajućim razrjeđivanjem.

Formacije označene FITC-om u stanicama različitih tkiva otkrivaju se kao žuto-zeleno fluorescentno bojenje na tamnoj pozadini (u obliku okruglih ili ovalnih intracitoplazmatskih inkluzija).

Vezani imunosorbentni test. Metoda se temelji na principu sorpcije proteina na čvrstoj fazi nakon čega slijedi stvaranje kompleksa antigen-protutijelo koje se detektira otopinom supstrat-indikator. Antigen dodan u jažice specifično se veže za antitijela. Ispitni serumi nanose se na sloj antigena u potrebnim razrjeđenjima. U prisutnosti specifičnih protutijela u njima, potonji se vežu na antigen. Za otkrivanje vezanja, imunoglobulin protiv ljudskih serumskih globulina konjugiran s peroksidazom hrena nanosi se na sloj antitijela. Količina sorbirajućeg konjugata proporcionalna je količini ljudskih seruma vezanih za antigen. To se može utvrditi pomoću otopine indikatora (ortofenilendiamin + vodikov peroksid), čije komponente, kao rezultat djelovanja konjugirane peroksidaze, boje tekućinu u smeđe-žuto. Prilikom ispitivanja nejasnih slučajeva, korištenje ELISA-e uz metode RP ili RSK omogućuje vam povećanje pouzdanosti laboratorijske dijagnoze bjesnoće, zbog visoke osjetljivosti ove metode. Metoda omogućuje otkrivanje zaraznih i neispravnih čestica.

Za određivanje protutijela protiv bjesnoće tijekom cijepljenja može se koristiti indirektna ELISA metoda, pri čemu se kao antigen koristi pročišćeni virus, a za određivanje protutijela klase IgG u ljudskom serumu, Staphylococcus A-protein povezan s peroksidazom hrena. Rezultati ELISA-e usporedivi su s onima dobivenim u testovima neutralizacije virusa na miševima. Metoda omogućuje otkrivanje prisutnosti IgM na početku procesa imunizacije.

Imunoenzimske metode su vrlo obećavajuće za detekciju nukleokapsidnog antigena virusa tijekom post mortem dijagnostike u moždanim tkivima. Među njima je, primjerice, brza ELISA metoda za dijagnosticiranje bjesnoće, koja se temelji na pripremi pločica senzibiliziranih protutijelima izotipa IgG na nukleokapsid prvog serotipa, razrijeđenih u karbonatnom puferu.

Ispitni materijal se homogenizira u puferu ili mediju kulture, razbistri centrifugiranjem, doda u jažice i inkubira u pločama. Nukleokapsidni antigen fiksiran specifičnim protutijelima identificira se dodavanjem konjugata peroksidaze s antinukleokapsidnim protutijelima protiv bjesnoće različite specifičnosti vrste i kromogenog supstrata. Osjetljivost metode je 0,8-1,0 ng/ml.

Ova metoda može otkriti antigene virusa različitih serotipova. Korištenje konjugata nukleokapsid-specifičnih protutijela obilježenih biotinom povećava osjetljivost metode na 0,1-0,2 ng/ml.

Nukleokapsidni antigen se uspješno detektira ELISA-om, ali se materijal, čak ni razgrađen, ne smije fiksirati formalinom.

metoda lančane reakcije polimerazom. Za brzu dijagnozu virusa bjesnoće i identifikaciju lisavirusa najprikladnija metoda je lančana reakcija polimerazom (PCR). PCR metoda je najpouzdanija i najbrža metoda za izolaciju virionske RNA iz bilo kojeg uzorka koji sadrži virus u niskoj koncentraciji. Pomoću njega možete stvoriti mnogo kopija RNA virusa. Ova se metoda koristi za potvrdu MFA rezultata i otkrivanje virusa u slini, folikulima dlake na potiljku i glavi.

PCR se temelji na principu prirodne replikacije DNK. Suština metode je opetovano ponavljanje ciklusi sinteze (amplifikacije) sekvence DNA specifične za virus pomoću termostabilne Taq DNA polimeraze i dvaju specifičnih početnica, tzv.

Svaki ciklus se sastoji od tri faze s različitim temperaturnim uvjetima. U svakom ciklusu, broj kopija sintetizirane regije se udvostručuje. Novosintetizirani fragmenti DNA služe kao predložak za sintezu novih lanaca u sljedećem ciklusu umnožavanja, što omogućuje nakupljanje dovoljnog broja kopija odabrane regije DNA u 25-35 ciklusa za njezino određivanje, obično pomoću agaroznog gela. elektroforeza.

Osobito visoka osjetljivost PCR-a kada se koriste početnice komplementarne N-genu, kada je moguće detektirati virusnu RNK u uzorcima koji sadrže virus u titru od 10 MLD50. PCR metoda može detektirati RNK virusa čak iu raspadnutom patološkom materijalu.

Trenutno su razvijeni potvrdni (potvrdni) testovi, kao što je PCR reverzne transkriptaze (RT-PCR), koji se naširoko koriste u praksi. RT-PCR metoda je vrlo osjetljiva i najučinkovitija. RNA se ekstrahira iz tkiva organa zaraženog virusom, transkribira u cDNA, koja se zatim umnožava PCR-om. RT-PCR zahtijeva dobivene početnice za konzervativne regije genoma virusa bjesnoće. Obično se koriste geni koji kodiraju nukleoprotein ili N-protein.

PCR metoda je visoko specifična i vrlo osjetljiva. Jedan je od naj precizni testovi otkrivanje antigena bjesnoće omogućuje dijagnosticiranje bjesnoće čak i ako u materijalu postoji barem jedan virion. Test se temelji na komplementarnom kompletiranju RNA uzorka, provedenom in vitro pomoću enzima RNA polimeraze. Posljednjih godina PCR se sve više koristi za dijagnosticiranje i praćenje virusnih infekcija. Međutim, tehnika je složena, skupa i još nije dovoljno unificirana za rutinsku uporabu.

Citološke metode trenutno su ograničene dijagnostička vrijednost, ali bi se ipak trebao koristiti za brojne infekcije. Pregledavaju se obdukcijski materijali, biopsije, brisevi koji se nakon odgovarajuće obrade boje i analiziraju pod mikroskopom. Kod bjesnoće je to otkrivanje inkluzija u citoplazmi stanica (Babes-Negrijeva tjelešca).

Izolacija virusa. Izolacija virusa može biti potrebna za potvrdu rezultata antigenskih testova i daljnju karakterizaciju izolata. I iako je ova metoda jedna od najstarijih i najdugotrajnijih dijagnostičkih metoda, danas je izolacija virusa uz naknadnu identifikaciju nekom od suvremenih metoda (ELISA s monoklonskim protutijelima ili PCR) najpouzdanija dijagnostička metoda, tzv. "Zlatni standard".

Učinkovitost dijagnostičkih metoda bjesnoće može varirati ovisno o nizu čimbenika (stadij bolesti, vrijeme uzorkovanja materijala, kvaliteta dobivenih uzoraka, uvjeti skladištenja, iskustvo osoblja, kvaliteta reagensa itd.). Ako pozitivan rezultat potvrdi bjesnoću, tada negativan rezultat ne znači uvijek odsutnost bolesti. Stoga stručnjaci WHO-a za bjesnoću preporučuju korištenje nekoliko testova, posebice MFA u kombinaciji s biološkim testom na novorođenim (starim 2-3 dana) bijelim miševima.

Mjere osobne prevencije

Svi radovi s materijalom za koji se sumnja da sadrži virus bjesnoće, kao i sa životinjama za koje se sumnja da imaju bjesnoću, moraju se obavljati uz pridržavanje mjera osobne zaštite. Medicinski radnici i veterinari moraju raditi u mantilima, rukavicama, maskama.

Na kraju rada, kutije se tretiraju s 3% otopinom vodikovog peroksida.

Bočice, ampule i alati, kao i preostali materijali koji sadrže virus bjesnoće, te sav pribor nakon rada dezinficiraju se autoklavom 1 sat na 1,5 atm (kill mode).

Fondovi osobna zaštita dezinficirati kuhanjem ili autoklaviranjem. Radna površina stola i ruke dezinficiraju se dezinfekcijskom otopinom (0,5% otopina kloramina).

Bjesnoća (R) je akutna bolest toplokrvnih životinja koju karakterizira oštećenje središnjeg živčanog sustava. Osjetljive su domaće i divlje životinje svih vrsta, kao i ljudi.

Bolest je registrirana u različitim regijama svijeta. Nije bilo slučajeva širenja bolesti u Australiji, Velikoj Britaniji, Japanu. Bolest gotovo uvijek završava smrću. Postoje zapravo dokumentirani slučajevi oporavka od bjesnoće kod ljudi i pasa nakon eksperimentalne infekcije.

Virus bjesnoće (virus bjesnoće) pripada obitelji Rhabdoviridae, rodu Lyssavirus. Sada je utvrđeno da VB ima 4 serotipa, što je očito posljedica razlike u sastavu membranskih proteina. Sve varijante VB su imunobiološki povezane, ali se razlikuju po virulentnosti. WB ima svojstva GA i GAD. Postoji linearni odnos između infektivne i GA aktivnosti. Životinje imunizirane protiv bjesnoće proizvode VNA, KSA, antiHA i litička (uništavaju stanice zaražene virusom u prisutnosti komplementa) protutijela.

Dijagnoza se postavlja na temelju epidemioloških podataka, simptoma bolesti, patoloških promjena (one su manjeg značaja) i uglavnom rezultata laboratorijskih pretraga.

Laboratorijska dijagnostika sastoji se od proučavanja mozga životinja kako bi se otkrio virusni AG u IF, RDP, otkrivanje Babes-Negrijevih tjelešaca i biološki test na bijelim miševima.

NA Ruska Federacija Trenutno je proizvodnja kompleta za dijagnosticiranje B u IF i RDP organizirana u VNITIBP i KazNIVI.

Izolacija virusa. Svježi leševi malih životinja šalju se u laboratorij na istraživanje, od velikih životinja - glave ili mozga. U nekim slučajevima dopušteno je konzerviranje mozga u 50% glicerinu. Leš ili glava moraju biti pažljivo upakirani u plastičnu vrećicu, mozak - u staklenku s brušenim staklenim ili gumenim čepom, napunjenu parafinom. Materijal je pakiran u spremnik otporan na vlagu. Samo nekonzervirani mozgovi prikladni su za virološke studije. Treba imati na umu da se obdukcija, ekstrakcija mozga i druge operacije s patološkim materijalom trebaju provoditi u uvjetima sterilnosti i strogog poštivanja mjera osobne prevencije: čvrsto pričvrstiti glavu životinje, zaštititi ruke s 2 para rukavica ( kirurški i anatomski), stavite naočale za zaštitu očiju, a na nos i usta - 6-slojni zavoj od gaze.

Laboratorijska istraživanja materijala bjesnoća se provodi izvan reda; o nalazima se odmah izvješćuje poljoprivredni liječnik i glavni liječnik okruga (grada).

Indikacija i identifikacija virusa. Redoslijed istraživanja: iz svakog dijela mozga lijeve i desne strane (Amonov rog, cerebelum, cerebralni korteks i oblongata) pripremaju se 4 razmaza-otiska za IF i detekciju Babesh-Negrijevih tjelešaca; s tkivom mozga staviti RDP; s negativnim rezultatima, postavlja se biološki test.

Detekcija specifičnih inkluzijskih tijela. Brisevi otisaka boje se prema Sellersu, Muromtsevu ili drugim metodama. Nakon bojenja, preparati se promatraju pod svjetlosnim mikroskopom s imerzijskim sustavom. Prisutnost specifičnih Babesh-Negrijevih tijela smatra se pozitivnim rezultatom (kada se boje po Sellersu - jasno definirane ovalne ili duguljaste granularne formacije ružičasto-crvene boje u protoplazmi, kada se boje po Muromtsevu - svijetlo ljubičasto s tamnoplavim Babeshovim inkluzijama -Negrijeva tjelešca, češće se nalaze izvan živčanih stanica.

Najkarakterističnija značajka tijela Babesh - Negri je njihova unutarnja struktura, koja im omogućuje apsolutno precizno razlikovanje. Unutra su vidljiva sitna zrnca - bazofilna zrnca tamnoplave, čak crne boje, veličine 0,2-0,5 mikrona.

Općenito je poznata dijagnostička vrijednost otkrivanja inkluzijskih tjelešaca za dokaz infekcije WB. Međutim, u zdravih životinja, osobito u mačaka i bijelih miševa, postoje formacije čija prisutnost može uzrokovati dijagnostičke poteškoće. U nekim je slučajevima u mačjem mozgu moguće pouzdano razlikovati takve inkluzije od Babes-Negrijevih tjelešaca, a ovdje se preporuča koristiti metode identifikacije, posebice IF. Slično je i kod pasa koji su uginuli od posljedica trovanja zmijskim otrovom ili ozljedama elektro šok, mogu se pronaći inkluzijska tjelešca koja podsjećaju na Babes-Negrijeva tjelešca. Babesh-Negrijeva tjelešca otkrivaju se samo u 65-85% slučajeva bjesnoće, pa njihov izostanak nije negativan odgovor, a materijal se ispituje drugim testovima (IF, RDP, biotest).

AKO. Jedan od glavnih testova u dijagnozi B. S visokokvalificiranom izvedbom dobiva se 99-100% podudarnost s metodom biološke analize. Obično se u dijagnostičkoj praksi koristi izravna metoda IF, koja se provodi pomoću fluorescentnog Ig protiv bjesnoće. Fiksacija preparata u ohlađenom (8-10°C) acetonu provodi se najmanje 4 sata Kao negativna kontrola koriste se razmazi-otisci mozga zdravih bijelih miševa. Rezultati se uzimaju u obzir vizualno u fluorescentnom mikroskopu na temelju procjene intenziteta sjaja kompleksa AG-AT. AH VB se detektira kao svijetlo žutozelene ili zelene granule raznih oblika i vrijednosti u ćelijama (češće izvan ćelija). Dijagnoza se smatra postavljenom ako se u više vidnih polja nađe dovoljan broj (najmanje 10) tipičnih granula svijetlozelenog sjaja ili mnoštvo sitnih točkica, au kontrolnom dijelu ne bi trebalo biti takvog sjaja.

Za dokazivanje specifičnosti fluorescencije kompleksa AG-AT koristi se metoda supresije IF, koja se sastoji u sposobnosti AG bjesnoće povezanih s nefluorescentnim AT da se ne rekombiniraju s fluorescentno specifičnim AT. Da bi se to postiglo, 5% nefluorescentnog Ig protiv bjesnoće nanese se na fiksirane preparate pripremljene iz mozga koji se proučava, inkubira se 30 minuta na 37°C u vlažnoj komori, ispere fiziološkom otopinom i zatim se oboji fluorescentnim sredstvom protiv bjesnoće. Ig konvencionalnom izravnom metodom. U ovako tretiranim preparatima ne bi trebalo biti fluorescencije.

IF metoda omogućuje otkrivanje WB u stanicama rožnice očiju i postavljanje preliminarne dijagnoze in vivo: tijekom bolesti životinja, kao i 1-2 dana ili više prije njegove kliničke manifestacije. Metoda se može koristiti za proučavanje životinja sumnjivih na bolest B, kao i klinički zdravih pasa i mačaka koji su ugrizli ljude i životinje. Da bi se to postiglo, pripremaju se otisci s rožnice, poštujući sva pravila osobne sigurnosti, otvarajući palpebralnu fisuru životinje velikim i kažiprstima a lagano izbočenu očnu jabučicu pritisnemo površinom predmetnog stakla odmaknuvši se 0,5 cm od kraja. Potrebno je osigurati da životinja ne trepće trećim kapkom, jer se epitelne stanice uklanjaju sa stakla i dobiva se nekvalitetan razmaz. Iz svakog oka izrađuju se najmanje 2 preparata koji sadrže 2 otiska. Za kontrolu se na sličan način pripremaju otisci rožnice zdravih životinja. Mogu se kuhati na farmi. Otisci se suše na zraku, fiksiraju u acetonu 4 sata na 4°C, pakiraju i šalju u laboratorij. Pripreme za bojenje, kao u IF, prema općeprihvaćenoj metodi.

U pripravcima dobivenim od bolesnih životinja ili onih na kraju razdoblja inkubacije bolesti, u citoplazmi mnogih epitelnih stanica, različite oblike jarko svjetleće granule različitih veličina - od točkica poput prašine do 2 mikrona i više. U svrhu dobivanja pouzdane rezultate u svakom preparatu ispituje se 50-100 stanica, a ukupno najmanje 200-400 stanica životinje. Rezultati mikroskopije smatraju se pozitivnim ako se u otiscima rožnice životinje nađe 11% ili više stanica s karakterističnim žarištima luminiscencije. Treba imati na umu da u pripravcima zdravih životinja (kontrola) zbog autofluorescencije mogu postojati pojedinačne stanice žarišta sličnog oblika i svjetla.

Važno je napomenuti da IF omogućuje ubrzavanje odgovora na konačnu dijagnozu biološkim testom, budući da se dijagnoza B može postaviti tek 4-8 ​​dana nakon infekcije miševa ispitivanim materijalom, a trajanje inkubacije bolesti miševa može doseći 20 dana. IF može otkriti WB u tkivima submandibularne žlijezde slinovnice. Brisevi se pripremaju iz submandibularnih žlijezda slinovnica, uzimajući materijal iz najmanje 6 različitih dijelova žlijezde, budući da je distribucija virusa u njoj neravnomjerna. Često je za dobivanje otiska potreban jak pritisak, jer zbog obilja mucina na staklu ostaje malo materijala.

Pokazana je mogućnost identifikacije VB u koži IF metodom, za koju se uzimaju uzorci vlasišta, te senzornih i taktilnih folikula dlake njuške ili lateralnih senzornih papila (na obrazu psa). Uzorci se čuvaju na -20 ili -70°C. Od njih se rade kriosekcije koje se tretiraju fluorescentnim globulinom. Rezultati IF analize dobiveni identifikacijom VB u koži u visokoj su korelaciji s podacima dobivenim proučavanjem mozga iste životinje. Pokazana je bliska korelacija između detekcije AH virusa u uzorcima mozga i tkiva usana IF metodom.

RDP. Koristi se za otkrivanje AH VB u neočuvanom mozgu životinja koje su umrle od ulične bjesnoće ili miševa korištenih u biološkom testu. RDP se stavlja mikrometodom na stakalce pomoću 1-1,5% agar gela prema općeprihvaćenoj metodi. Najveći postotak pozitivnih rezultata otkriva se korištenjem sljedeće šablone: ​​A - amonov rog ( Desna strana); B - cerebralni korteks (desna strana); C - mali mozak (desna strana);
D - medula oblongata (desna strana); + (plus) - pozitivna kontrola; - (minus) - negativna kontrola; 1, 2, 3, 4 - jažice s razrjeđenjem specifičnog imunoglobulina 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, respektivno

Pincetom se iz svakog dijela mozga priprema homogena masa u obliku paste koja se stavlja u odgovarajuće jažice. Kod miševa se ispituje cijeli mozak. Iz moždanih regija lijeve strane na sličan način se priprema AG (za svaki pregled potrebna su ukupno 4 stakalca s agar gelom). Reakcija se uzima u obzir nakon 6, 24, 48 sati.Ako između jažica koje sadrže AG i imunoglobulin postoje 1 ili 2-3 linije taloženja, reakcija se smatra pozitivnom.

RDP je jednostavan za izvođenje i specifičan, ali je postotak detekcije virusnog AG u ispitivanom materijalu 45-70. U istraživanju mozga miševa dobivenog pozitivnim biološkim testom, RDP otkriva do 100% slučajeva. Odsutnost Babesh-Negrijevih tjelešaca, specifične fluorescencije i negativnog RDP-a u ispitivanom materijalu ne daju osnovu za isključivanje prisutnosti virusa. U ovom slučaju, konačna dijagnoza temelji se na rezultatima biološke analize na bijelim miševima, nakon čega slijedi identifikacija virusa.

Biotest. Općenito je prihvaćeno da je biološki test više učinkovita metoda nego otkrivanje Babeshovih tjelešaca - Negri, IF, itd. Međutim, u nekim slučajevima pokazalo se negativnim, unatoč potvrdi dijagnoze B otkrivanjem inkluzijskih tjelešaca i IF. Postotak negativnih rezultata biotesta kretao se od 1,3 do 12.

Podatak o različitoj učinkovitosti biološkog testa može se objasniti nizom čimbenika: izborom pokusne životinje, njihovim brojem u pokusu, načinom zaraze, načinom i rokom čuvanja materijala prije ulaska u laboratorij. Fenomen interferencije zaraznih čestica s neaktivnim česticama također može igrati ulogu ako se za inokulaciju koristi nedovoljno razrijeđen materijal.

u mozgu i žlijezde slinovnice lisica i tvorova koji su uginuli od bjesnoće, pronađena je tvar koja inhibira infektivnost virusa, što ne dopušta dijagnosticiranje bolesti kod ovih životinja intracerebralnom infekcijom miševa. Prisutnost inhibitorne tvari u ispitivanom materijalu ne sprječava detekciju virusne AG metodom IF; za tvorove i lisice ovo je najosjetljivija dijagnostička metoda.

Od životinja svih vrsta (zečevi, zamorci, odrasli bijeli miševi i hrčci) koje se koriste za biološki test, mnogi preferiraju miševe koji sisaju jer su osjetljiviji na različite vrste VB i manje su opasni za rad. Sirijski hrčci nisu niži od miševa u osjetljivosti, ali su manje dostupni.

RSK. Detekcija specifične AH u RSK u dijagnostici bjesnoće koristi se rjeđe od drugih metoda. AG se priprema iz mozga koji se šalje na istraživanje. Da bi se to postiglo, moždano tkivo (osobito bogato AG-om, vezanjem komplementa, komadićima talamusa i moždanog debla) triturira se u veronalnom puferu u omjeru 1:10 i ostavi na sobnoj temperaturi 1 sat, nakon čega se suspenzija otopi. inaktiviran na 56°C tijekom 5 sati.Takav tretman ubija virus i uklanja antikomplementarnost moždanog tkiva bez oštećenja specifičnog antigena. Suspenzija se centrifugira 15 min na 3500 min-1 iz supernatanta koji je materijal za ispitivanje prisutnosti AG, pripremaju se 2 puta rastuća razrjeđenja od 1:2 do 1:64 i koriste za istraživanje u CSC. .

ELISA. U ELISA-i, specifično bojenje AG u moždanim stanicama životinja koje su uginule od bjesnoće detektirano je iu svježe uzetim, pohranjenim u glicerolu, kao iu uzorcima pohranjenim bez glicerola na 20 ° C 8-18 sati. Ovaj test je prikladan za rutinsku dijagnostiku bjesnoće u životinja, za otkrivanje AG WB u parafinskim rezovima tkiva tijekom fiksacije preparata 10% otopinom formalina s pH 5,3 i naknadnog tretiranja preparata utopljenih u parafin pepsinom.

Za razliku od RN kod miševa i stanične kulture, ELISA omogućuje otkrivanje AT kod životinja unutar nekoliko sati, ELISA je najperspektivniji laboratorijska metoda detekcija AT i indikacija samog virusa. Ekspresna metoda za dijagnosticiranje bjesnoće je tehnika hvatanja i IF metoda za otkrivanje AH BB. Dokazano je da je metoda detekcije AH VB u parafiniziranim rezovima metodom peroksidaza-antiperoksidaza znatno bolja od ELISA metode. Godine 1987. stvoren je pribor za brzu enzimsku imunodijagnostiku bjesnoće (RREID), prikladan za epidemiološke i laboratorijske studije.

Identifikacija varijanti pomoću mAT-a. Uz pomoć mAbs na WB glikoproteine ​​odabrane su varijante AG među kojima su identificirane fenotipski termolabilne (avirulentne) varijante. Pri korištenju 2 skupine mAb, pokazalo se da se razrijeđeni sojevi razlikuju od kom. Fixe (Pasteur), CVS, Flury HEP, ERA i "duck" sojevi za AH determinante. Studija 7 sojeva izoliranih od pacijenata s B osobama koji su koristili mAbs omogućila je identificiranje određenih razlika između njih i soja cjepiva u odnosu na determinante AH.

Općenito je prihvaćeno da se AT razlike između divljih sojeva mogu detektirati korištenjem mAbs protiv nukleokapsida AT N, koji reagiraju s citoplazmatskim inkluzijama stanica zaraženih virusom; anti-glikoprotein (G AG), koji reagiraju s membranama inficiranih stanica, liziraju te stanice u prisutnosti komplementa i neutraliziraju virus. U vezi s mogućom varijabilnošću AH površinskog glikoproteina WB iz različitih geografskih područja, kao zaštitni AG korišten je ribonukleoprotein koji karakterizira konzervativnost strukture AG. Dakle, ne samo G protein, već i RNP VB imaju zaštitnu aktivnost.

Serodijagnostika i retrospektivna dijagnoza. Ove metode nisu tipične za bjesnoću, jer se koriste samo u svrhu ispitivanja imuniteta nakon cijepljenja. Za detekciju i titraciju postcijepnih protutijela koristi se pH koji se postavlja općeprihvaćenom metodom. Fiksni WB koristi se kao AG. RN na stanicama BHK-21 bio je osjetljiviji od neizravnog IF u otkrivanju AT u serumima cijepljenih lisica. Osim toga, predloženi su RTGA i ELISA.

RTGA. Još nije pronašao široku primjenu u dijagnostičkoj praksi zbog prisutnosti nespecifičnih inhibitora u krvnim serumima, na koje je WB vrlo osjetljiv, i što je najvažnije, GA AG, koji nisu bili podvrgnuti dovoljnom pročišćavanju, imali su nisku osjetljivost. Za pripremu HA AG WB predlaže se korištenje kom. Moskva uzgojena u kulturi stanica VNK-21 nakon tretmana saponinom nakon čega je uslijedilo pročišćavanje i koncentriranje. HA se odvaja od ostalih komponenti viriona ultracentrifugiranjem. Dobiveni pripravak imao je stupanj pročišćavanja od 99,92%, imao je visoku aktivnost GA (1:128), dobro očuvan 1 mjesec pri pH 5-9.

Prije postavljanja RTGA potrebno je provesti umjerenu dvostruku tripsinizaciju guščjih eritrocita radi njihove senzibilizacije. Kada se koristi 0,25% suspenzija tripsiniziranih eritrocita (po mogućnosti 10 7 stanica po 1 ml), osjetljivost RTGA se povećava 4 puta. Za razrjeđivanje AG i seruma koristi se otopina boratne soli (pH 9) uz dodatak 0,4% goveđeg serumskog albumina. Suspenzija eritrocita priprema se u fiziološkoj otopini s kiselim pH, kako bi se nakon spajanja sa smjesom virusa i seruma, čiji je pH 9, konačni pH postavio unutar 6,2. Nakon dodavanja suspenzije eritrocita u jažice, ploča se protrese, zatvori prozirnom folijom i stavi na led. Rezultati RTHA uzimaju se u obzir nakon 40-50 minuta, a kod eritrocita 2-dnevnih pilića ili rezus majmuna - nakon 1-1,5 sati.

Razvijen je radioimunotest koji se temelji na sposobnosti AT da se veže na obilježeni 125 1-AG WB. Označeni IgG izoliran iz hiperimunog seruma protiv bjesnoće može se koristiti za otkrivanje WB AG s RIA-om na čvrstoj fazi. Najbolji rezultati dobiveni su korištenjem otopine fosfatne soli (pH 6,0) s ionskom jakošću od 0,01 M i označenim IgG s aktivnošću od 200-250 tisuća impulsa / min.

Kompetitivni RIA na čvrstoj fazi primjenjiv je za detekciju antitijela protiv bjesnoće u serumu i supernatantima hibridoma.

Diferencijalna dijagnoza. Potrebno je isključiti bolest Aujeszkog, kod koje bolesne životinje nisu agresivne, nema izopačenosti apetita. Kod pasa je isključen živčani oblik kuge. Na bjesnoću se sumnja kod infektivnog encefalomijelitisa konja. Kompleks laboratorijskih testova omogućuje vam postavljanje točne dijagnoze bjesnoće. Predloženo nova metoda diferencijacija različitih sojeva VB, na temelju restriktivnog cijepanja produkata amplifikacije u PCR segmentu N gena.

MEĐUDRŽAVNO VIJEĆE ZA NORME. MJERITELJSTVO I CERTIFIKACIJA

MEĐUDRŽAVNO VIJEĆE ZA NORME. MJERITELJSTVO I CERTIFIKACIJA

MEĐUDRŽAVNI

STANDARD

ŽIVOTINJE

Službeno izdanje

Standardna forma

Predgovor

Ciljevi, osnovna načela i osnovni postupak za izvođenje radova na međudržavnoj standardizaciji utvrđeni su GOST 1.0 - 92 „Međudržavni sustav standardizacije. Osnove odredbi” i GOST 1.2-2009 „Međudržavni sustav standardizacije. Međudržavni standardi. pravila i preporuke za međudržavnu normizaciju. Pravila razvoja. prihvaćanje, prijava, obnavljanje i otkazivanje"

O standardu

1 RAZVIJALA Savezna država proračunska ustanova„Sveruski Državni centar kvaliteta i standardizacija lijekovi za životinje i stočnu hranu" (FGBU "VGNKI")

2 UVELA Savezna agencija za tehničku regulaciju i mjeriteljstvo Ruske Federacije

3 DONIJELO Međudržavno vijeće za normizaciju, mjeriteljstvo i certificiranje (Zapisnik od 27. lipnja 2013. br. 57-P)

Skraćeni naziv države prema MK (ISO 3166) 004-97	Oznaka države broj MK (ISO 3166) 004-97	Skraćeni naziv nacionalnog normirnog tijela
		Ministarstvo gospodarstva Republike Armenije
Bjelorusija		Državni standard Republike Bjelorusije
Kirgistan		Kyrgyzstandart
		Moldavija-Standard
		Gosstandart
Uzbekistan		Uzsgandart

4 Nalogom Savezne agencije za tehničku regulaciju i mjeriteljstvo od 30. rujna 2013. br. 1127-st, međudržavni standard GOST 26075-2013 stupio je na snagu kao nacionalni standard Ruske Federacije od 1. siječnja 2015.

5 UMJESTO GOST 26075-54

Podaci o izmjenama ove norme objavljuju se u jednom godišnje objavljenom indeksu informacija "Nacionalne norme", a tekst izmjena i dopuna - u mjesečnom izdanom indeksu informacija "Nacionalne norme". U slučaju revizije (zamjene) ili ukidanja ove norme, odgovarajuća obavijest bit će objavljena u mjesečnom indeksu informacija "Nacionalne norme". Relevantne informacije, obavijesti i tekstovi objavljuju se iu sustavu javnog informiranja - na službenim stranicama Federalne agencije za tehničko reguliranje i mjeriteljstvo na internetu.

© Standardinform, 2014

U Ruskoj Federaciji ovaj se standard ne može u potpunosti ili djelomično reproducirati. umnožavati i distribuirati kao službenu publikaciju bez dopuštenja Federalne agencije za tehničko reguliranje i mjeriteljstvo

MEĐUDRŽAVNI STANDARD

ŽIVOTINJE

Metode laboratorijske dijagnostike bjesnoće

Metode laboratorijske dijagnostike bjesnoće

Datum uvođenja - 2015 - 01 - 01

1 područje upotrebe

Ovaj se standard primjenjuje na sve vrste sisavaca i utvrđuje sljedeće metode za laboratorijsku dijagnostiku bjesnoće:

Metoda fluorescentnih antitijela (MFA);

Metoda za izolaciju virusa bjesnoće u kulturi stanica mišjeg neuroblastoma CCL-131 (ili neurinoma Gasserov čvor štakora - NGUK-1);

Biotest na bijelim miševima:

Metoda imunoenzimskog testa (ELISA);

Reakcija difuzijske precipitacije (RDP).

Bilješke

1 Ove su metode primjenjive na sve članove roda Lyssavwus.

2 Virus ulične bjesnoće pripada mikroorganizmima 2. klase patogenosti (predstavlja smrtnu opasnost za ljude i životinje).

3 Ako je potrebno, genotipizacija virusa bjesnoće pomoću gotovih ispitni sustavi koristi se metoda lančane reakcije polimerazom reverzne transkriptaze (RT-PCR).

2 Normativne reference

Ovaj standard koristi normativne reference na sljedeće standarde:

GOST ISO/IEC 17025 - 2009 Opći zahtjevi na nadležnost laboratorija za ispitivanje i umjeravanje

GOST 12.0.004 - 90 Sustav standarda zaštite na radu. Organizacija obuke o zaštiti na radu. Opće odredbe

GOST 12.1.005-68 Sustav standarda zaštite na radu. Opći sanitarni i higijenski zahtjevi za zrak u radnom prostoru

GOST 12.1.008 - 76 Sustav standarda zaštite na radu. biološka sigurnost. Opći zahtjevi

GOST 12.4.011 - 89 Sustav standarda zaštite na radu. Sredstva zaštite radnika. Opći zahtjevi i klasifikacija

GOST 17.0.0.01 - 76 Sustav standarda u području zaštite prirode i poboljšanja korištenja prirodnih resursa. Ključne točke

GOST 177-88 Vodikov peroksid. Specifikacije GOST 2603 - 79 Reagensi. Aceton. Specifikacije GOST 2768 - 84 Tehnički aceton. Specifikacije GOST 4204 - 77 Reagensi. Sumporne kiseline. Specifikacije GOST 6709 - 72 Destilirana voda. Tehnički podaci.

GOST ISO 7218 - 2011 Mikrobiologija prehrambeni proizvodi i stočne hrane. Opći zahtjevi i preporuke za mikrobiološka ispitivanja

GOST 8074 - 82 Instrumentalni mikroskopi. Vrste, osnovni parametri i veličine. Tehnički zahtjevi.

GOST 9147 - 80 Laboratorijsko posuđe i oprema od porculanskog stakla. Specifikacije GOST 9284-75 Stakalca za mikroskop. Specifikacije GOST 12026 - 76 Laboratorijski filter papir. Specifikacije GOST 13739-78 Imerzijsko ulje za mikroskopiju. Tehnički zahtjevi. Metode ispitivanja

GOST 16317-87 Električni rashladni uređaji za kućanstvo. Opće specifikacije

GOST 21241-69 Medicinske pincete. Opće specifikacije.

GOST 22967 - 90 Medicinske šprice za injekcije za višekratnu upotrebu. Opći tehnički zahtjevi i metode ispitivanja

GOST 24661 - 91 (ISO 7866 84) Šprice za jednokratnu upotrebu

GOST 25046 - 81 (ISO 7864-81) Igle za jednokratnu upotrebu. Glavne dimenzije. Tehnički zahtjevi. Metode ispitivanja

GOST 25336 - 82 Laboratorijsko stakleno posuđe i oprema. Vrste, osnovni parametri i dimenzije

GOST 29230 - 91 (ISO 835-4-81) Laboratorijsko stakleno posuđe. Pipete su diplomirale. Dio 4. Puhati pipete

Napomena - Prilikom korištenja ove norme preporučljivo je provjeriti valjanost referentnih normi u javnom informacijskom sustavu - na službenim stranicama Federalne agencije za tehničko reguliranje i mjeriteljstvo na internetu ili prema godišnjem indeksu informacija "Nacionalne norme" , koji je izlazio od 1. siječnja tekuće godine, te izdanja mjesečnog informativnog kazala "Nacionalne norme" za tekuću godinu. Ako je referentni standard zamijenjen (modificiran), onda kada koristite ovaj standard, trebali biste se voditi zamjenskim (modificiranim) standardom. Ako se referentna norma poništi bez zamjene, odredba u kojoj je navedena referenca primjenjuje se u mjeri u kojoj to referenca nije zahvaćena.

3 Pojmovi, definicije i kratice

3.1 U ovoj se normi koriste sljedeći izrazi sa svojim definicijama:

3.1.1 bjesnoća Zarazna bolest ljudi i životinja uzrokovana članovima obitelji Rhabdoviridae iz roda Lyssavirus (rabdovirus) koja rezultira smrtonosni ishod u 100% slučajeva.

3.1.2 virus bjesnoće: Patogen zarazna bolestčovjek i životinje.

3.1.3 antigen virusa bjesnoće površinske proteinske strukture virusa bjesnoće protiv kojih se proizvode antitijela.

3.1.2 metoda fluorescentnih antitijela (MFA): Metoda za otkrivanje antigena virusa bjesnoće s fluorescein eotiocijanatom obilježenim protutijelima protiv bjesnoće, uz stvaranje karakterističnih svjetlećih inkluzijskih kompleksa koji se otkrivaju u vidnom polju fluorescentnog mikroskopa. .

3.1.3 metoda izolacije virusa bjesnoće u staničnoj kulturi mišjeg neuroblastoma CCL-131 (ili neurinoma Gasserova ganglija štakora - NGUK-1): Metoda izolacije antigena virusa bjesnoće. temelji se na reprodukciji virusa u kulturi stanica i njegovoj identifikaciji metodom fluorescentnih protutijela.

3.1.3 biološki test: Metoda za izolaciju virusa bjesnoće u bijelih miševa ubrizgavanjem suspenzije patološkog materijala, nakon čega slijedi identifikacija virusa metodom fluorescentnih protutijela.

3.1.4 enzimski imunoanaliza (ELISA) metoda za otkrivanje antigena virusa bjesnoće na temelju njegove specifične interakcije s protutijelom protiv bjesnoće imobiliziranim na čvrstom nosaču, nakon čega slijedi detekcija vezanog antigena pomoću drugog protutijela označenog enzimom bojenjem produkta reakcije s kromogenom.

3.1.5 test difuzijske precipitacije (RDP): Metoda za otkrivanje virusa bjesnoće koja se temelji na sposobnosti antitijela i antigena virusa bjesnoće da difundiraju u agar gelu i nakon specifične interakcije tvore kompleks antigen-antitijelo vidljiv golom. oko u obliku oborinske linije.

3.1.6 reverzna transkriptaza lančana reakcija polimeraze (RT-PCR) Metoda za otkrivanje genoma virusa bjesnoće prevođenjem specifične sekvence RNA virusa u DNA, nakon čega slijedi ponovljeno kopiranje dobivene DNA i otkrivanje produkata reakcije, provedeno in vitro .

3.2 U ovoj se normi koriste sljedeće kratice:

FAG - fluorescentni imunoglobulin protiv bjesnoće;

ANG - globulin protiv bjesnoće;

CFG - kontrolni fluorescentni globulin;

PBS - otopina fosfatnog pufera;

NGUK-1-neurinom Gasserov čvor štakora;

FITC - fluorescein izotiocinat:

RNA - ribonukleinska kiselina:

DNA - deoksiribonukleinska kiselina:

CCN31 - kultura stanica neuroblastoma miša:

OFD - ortofenildiamin;

TMB - tetrametilbenzidin.

4 Uvjeti istraživanja i sigurnosni zahtjevi

4.1 Uvjeti istraživanja

4.1.1 Opći zahtjevi za mikrobiološku analizu i rad s mikroorganizmima I - II skupine patogenosti - prema GOST ISO 7218.

4.1.2 Opći zahtjevi za prostorije - prema GOST ISO 7218.

4.1.3 Zahtjevi za osoblje - prema GOST ISO 7218, GOST ISO / IEC 17025. (1).

Za provođenje istraživanja dopušteni su kvalificirani djelatnici s iskustvom u radu s mikroorganizmima I-II skupine patogenosti, koji su proučili metode mikrobiološkog rada. cijepljena protiv bjesnoće.

4.2 Sigurnosni zahtjevi

4.2.1 Opći sigurnosni zahtjevi za rad u skladu s GOST 12.1.008.

4.2.2 Zaštitna oprema za radnike mora biti u skladu sa zahtjevima GOST 12.4.011.

4.2.3 Zrak u radnom prostoru mora biti u skladu sa zahtjevima GOST 12.1.005.

4.2.4 Osposobljavanje osoblja za zaštitu na radu u skladu s GOST 12.0.004.

4.2.5 Zbrinjavanje materijala dobivenog za studiju, kao i korištene osobne zaštitne opreme, alata itd. provodi se kuhanjem 30 minuta ili autoklaviranjem 15 minuta pri tlaku od (0,11 ± 0,20) MPa.

5 Mjerni instrumenti, oprema, materijali, reagensi i životinje

5.1 Za istraživačku upotrebu:

Skenirajući spektrofotometar sa spektralnim rasponom valnih duljina od 190 do 1100 nm s greškom ne većom od ± 0,5 nm i rasponom mjerenja optičke gustoće (OD) od 0,1 do 3,0;

Ploče za imunološke reakcije s 96 jažica:

Termostat koji održava temperaturu od 20"-C do 50°C:

Hladnjak za kućanstvo, osiguravajući održavanje temperature od 0 ° C do 10 ° C prema GOST 16317:

laboratorijska centrifuga;

vodena kupka;

Obrnuti luminiscentni mikroskop prema GOST 8074:

Porculanski tarionici s tučkom prema GOST 9147 ili homogenizator prema GOST ISO/IEC 17025;

Slajdovi prema GOST 9284:

Staklene epruvete prema GOST 25336;

Petrijeve posude prema GOST 25336;

Kiveta prema GOST 25336;

Pipete kapaciteta 1,0; 2,0 i 10,0 cm 3 prema GOST 29230;

Automatske pipete kapaciteta od 0,05 do 0,20 cm 3 s vrhovima:

Medicinske pincete prema GOST 21241:

Inzulinske šprice s kapacitetom od 1,0 cm 3 prema GOST 22967 ili GOST 24861;

Igle za injekcije prema GOST 25046:

Kulturne čaše za osam rupa;

Kavezi za držanje miševa;

Aceton prema GOST 2603 ili GOST 2768;

Fluorescentni imunoglobulin protiv bjesnoće (FAG);

Antirabični globulin (AnG);

Kontrolni fluorescentni globulin (CFG);

Nefluorescentno uronjeno ulje prema GOST 13739;

Destilirana voda prema GOST 6709;

Otopina fosfatnog pufera molarne koncentracije 0,01 mol/dm 3 (PBS). pH 7,2 - 7,4;

- sterilna otopina natrijeva klorida 0,9% izotonična:

Kultura stanica mišjeg neuroblastoma CC31 ili nonerynoma Gasserovog čvora štakora -

Penicilin;

Streptomicin;

Medium Needle MEM s dvostrukim skupom aminokiselina i vitamina (DMEM), pH 7,2;

Otopina tripsina 0,25%;

Serum embrionalne krvi goveda za kulture stanica 10%;

Glutamin 3%;

Vodikov peroksid 3% prema GOST 177;

Skup preparata za laboratorijsku dijagnostiku bjesnoće životinja pomoću ELISA;

Otopina sumporne kiseline s molarnom koncentracijom od 2 mol / dm 3 prema GOST 4204;

Filter papir prema GOST 12026;

Žig za izradu bunara;

mertiolat;

Agar "Difko" ili sličan;

Otopina metiloranža 1% u 50% etanolu:

Antigeni pozitivni i negativni;

Serum protiv bjesnoće ili imunoglobulin;

Klinički zdravi bijeli miševi težine 6-8 g.

5.2 Dopušteno je koristiti druge mjerne instrumente s mjeriteljskim karakteristikama i opremu s tehničkim karakteristikama ne lošijim, kao i reagense i materijale kvalitete koja nije niža od gore navedenih. Dopušteno je jednokratno posuđe.

6 Uzorkovanje

6.1 Za provođenje istraživanja o prisutnosti virusa bjesnoće u laboratorij se šalje patološki materijal - svježi leš ili glava malih životinja, glava ili mozak velikih životinja.

6.2 Patološki materijal odabran za istraživanje pakira se u spremnik otporan na vlagu i isporučuje se u laboratorij u metalnim spremnicima. Smrznuti materijal se stavlja u kriokontejner.

6.3 Patološki materijal prati dokument koji sadrži sljedeće podatke; ime i adresu pošiljatelja, vrstu životinje, anamnestičke i kliničke i eliootološke podatke.

6.4 Laboratorijska ispitivanja provode se odmah po primitku patološkog materijala.

6.5 Za istraživanje se velikim životinjama uzimaju komadići tkiva iz svakog dijela mozga (Amonovi rogovi, mali mozak, moždana kora, produžena moždina) veličine 0,5 - 1,0 cm.. Mozak malih životinja, poput miševa, ispituje se kao cijelo.

Samo svježi ili svježe smrznuti uzorci moždanog tkiva prikladni su za proučavanje MFA i metodu izolacije virusa bjesnoće u kulturi stanica mišjeg neuroblastoma CCL-131 (ili NGUK-1). Uzorci životinjskog mozga koji se raspadaju (u fazi raspadanja), konzervirani glicerolom, fiksirani metilnim alkoholom, formalinom ili drugim sredstvima koja potiču pojavu nespecifične fluorescencije nisu dopušteni za istraživanje.

Za postavljanje biološkog testa dopušteno je koristiti uzorke mozga konzervirane u 30% -50% * otopini glicerola. Upotreba drugih konzervansa nije dopuštena. Za očuvanje, patološki materijal može se zamrznuti na temperaturi ne višoj od minus 10 C.

7 Metoda fluorescentnih antitijela (MFA)

7.1 Bit metode

Bit metode fluorescentnih protutijela leži u specifičnoj interakciji fluorescentnih anti-rabičnih protutijela s homolognim antigenom virusa bjesnoće. Dobiveni kompleks antigen-protutijelo obilježen s FITC. detektira se vizualno karakterističnim sjajem u vidnom polju kada se gleda pod fluorescentnim mikroskopom.

7.2 Priprema za studiju

7.2.1 Priprema uzorka

7.2.1.1 Najmanje tri preparata (otiska ili razmaza) iz svakog dijela mozga pripremaju se iz komadića tkiva odabranih prema 6.5 na pažljivo odmašćenim stakalcima. Ako stanje patološkog materijala dopušta, pripremaju se otisci, u drugim slučajevima izrađuju se razmazi.

7.2.1.2 Priprema ispisa

Komadi tkanine odabrani prema 6.5. staviti na filter papir savijen u četiri do šest slojeva. Mozak malih životinja prereže se poprečno, zahvatajući sve njegove dijelove, i stavi ga prerezanom stranom prema gore na filter papir presavijen u četiri do šest slojeva. Rezana površina dodiruje se predmetnim staklom, lagano se pritišće dok se na staklu ne dobije tanki otisak.

7.2.1.3 Priprema razmaza

Komad tkiva iz svakog dijela mozga (kod malih životinja cijeli mozak), odabran prema 6.5. utrljati u porculanskom mužaru tučkom dok ne nastane homogena masa od koje se prave razmazi na stakalcima.

7.2.1.4 Kao kontrola, uzimaju se brisevi ili otisci iz mozga zdravih bijelih miševa bez bjesnoće i necijepljenih, kako je opisano u 7.3.1.2 i 7.3.1.3.

7.2.1.5 Nakon pripreme, mrlje ili otisci se suše na zraku 20-30 minuta. fiksira se u ohlađenom acetonu na temperaturi od 4'C 4 - 12 sati ili na temperaturi od minus 20 * C 1 sat, nakon čega se izvadi iz acetona i suši na zraku 10 - 15 mJ.

7.2.2 Priprema reagensa

PEDER. Ang i KFG se otope destiliranom vodom do početnog volumena navedenog na naljepnici ampule. Rok trajanja otopljenih FA. AnH i CFG na temperaturi od (5 ± 2) C - ne više od dva tjedna.

Izravno za studiju, potrebna količina otopljenog FAG. AnG i KFG se razrjeđuju s FBI do radnog razrjeđenja naznačenog na naljepnici ampule. Radna razrjeđenja otopljenih FAG-ova. Ang i CFG se koriste na dan pripreme.

7.3 Provođenje studije

Stakalca s preparatima (razmazima ili otiscima) prema 7.2.1 stavljaju se u vlažnu komoru (Petrijeva zdjelica ili kiveta s navlaženim dnom). Zatim se jedan od tri pripremljena preparata pipetom ravnomjerno premaže FAG-om u radnoj razrijeđenosti po cijeloj površini razmaza ili otiska. Na drugi pripravak primjenjuje se radno razrjeđenje KFG-a. Zatvorite komoru s drogom. staviti u termostat na temperaturu (37 ± 1) * C i držati 30

min. Paralelno se boje kontrolni preparati. Na kraju bojenja, preparati se isperu tri puta, svaki put uranjajući ih na 10 minuta u posudu s PBS-om. isprati destiliranom vodom i sušiti na zraku 20-30 minuta.

Na treći pripravak primjenjuje se radno razrjeđenje Anga. staviti u termostat na temperaturu od (37 ± 1) * C i inkubirati 30 minuta. Zatim se preparat ispere tri puta, svaki put uranjajući na 10 minuta u posudu s PBS-om. ispirati destiliranom vodom, sušiti na zraku 20 - 30 min i bojati radnom otopinom FAG-a. kako je gore opisano.

7.4 Rukovanje rezultatima

U obojenim preparatima moždano tkivo koje nije zahvaćeno virusom bjesnoće slabo svijetli. sivkasto žuta.

Antigen virusa bjesnoće detektira se u neuronima i izvan stanica u obliku svijetlozelenih granula različitih oblika i veličina - od jedva primjetnih do promjera 15-20 mikrona. Ponekad postoji veliki broj malih svijetlozelenih čestica (veličine do 1 mikrona) okruglog i ovalnog oblika.

Dijagnoza bjesnoće smatra se utvrđenom ako se u ispitivanom preparatu u više vidnih polja mikroskopa nađu tipične žućkastozelene granule. Istodobno, u kontrolnim preparatima (u brisevima ili otiscima iz mozga zdravih bijelih miševa bez bjesnoće, obojenim FAG-om), kao i u ispitivanim preparatima, obojenim CFG-om i prethodno tretiranim AnG-om i obojenim FAG-om. takve formacije ne bi trebale postojati.

Rezultati istraživanja dostavljaju se nadležnim tijelima u skladu s procedurom koja je na snazi ​​na području države koja je donijela standard.

8 u slučaju negativnog rezultata, studije se provode na 8 ili 9.

8 Metoda izolacije virusa bjesnoće u kulturi stanica mišjeg neuroblastoma CCL-131

8.1 Bit metode

Bit metode leži u izolaciji virusa bjesnoće u kulturi stanica miša.

neuroblastom CCL-131 ili NGUK-1 s naknadnom identifikacijom metodom fluorescentnih protutijela.

Metoda je alternativa biološkom testu na bijelim miševima prema 9.

8.2 Priprema za studiju

8.2.1 Priprema uzorka

Jednaki dijelovi tkiva sterilno uzeti iz svakog dijela mozga male životinje (Amonovi rogovi, cerebelum, cerebralni korteks, produžena moždina), ili komadići tkiva iz svakog dijela mozga velike životinje, uzeti prema 6.5. usitniti škarama i samljeti u mužaru ili homogenizatoru uz postupno dodavanje sterilne 0,9% izotonične otopine natrijeva klorida dok se ne dobije 10% suspenzija. Penicilin i streptomicin se dodaju u suspenziju mozga prema US jedinicama/cm 3 odnosno 1 mg/cm 3 .

Dobivena suspenzija se temeljito promiješa i centrifugira 5-10 minuta pri brzini od 2000 okretaja u minuti. Gore navedena sedimentna tekućina se prenese u sterilnu epruvetu i čuva na temperaturi ne višoj od 4 °C do upotrebe.

8.2.2 Priprema stakalca kulture

Dnevna kultura stanica mišjeg neuroblastoma CCL-131 (ili NGUK-1) uklonjena je iz tikvice s kulturom pomoću 0,25% otopine tripsina i razrijeđena s DMEM medijem s 10% fetalnog goveđeg seruma i 3% glutamina do koncentracije 2 x 10 s stanica. /cm 3 . 0,1 cm3 dobivene stanične suspenzije doda se u staklene jažice kulture, pokrije poklopcem i stavi u vlažni CO g-inkubator sa sadržajem CO od 5% na temperaturi od (37 ± 1) ° C tijekom 18- 20 sati

8.3 Provođenje studije

0,05 cm3 suspenzije iz svakog dijela mozga doda se u dvije jažice staklene kulture prema 8.2.2. Na svakom stakalcu ostavljene su dvije jažice za pozitivnu i negativnu kontrolu. Kao pozitivna kontrola koristi se suspenzija mozga miša zaraženog sojem virusa bjesnoće - CVS. Kao negativna kontrola uvedena je suspenzija mozga klinički zdravog miša. Staklo kulture se stavlja u inkubator s vlažnim CO2 sa sadržajem CO2 od 5% na temperaturi od (37 ± 1) *C tijekom 42-48 sati.

Na kraju inkubacije, medij se ukloni iz jažica staklene kulture pomoću automatske pipete, stanice se isperu jednom s PBS (koristeći automatsku pipetu, 0,2 cm 3 otopine doda se u svaku jažicu) i osuše u laminarni protok zraka 20 - 30 minuta. Zatim se u svaku jažicu doda 0,1 cm3 acetona ohlađenog na temperaturu od minus 20°C i ostavi na sobnoj temperaturi 30 minuta.

Nakon fiksacije stanica, staklo kulture se preokrene i protrese kako bi se uklonio aceton, a zatim se suši u laminarnom protoku zraka 20-30 minuta. Skalpelom i pincetom uklonite plastičnu mlaznicu i sušite staklo još 5-10 minuta. 0,05 - 0,10 cm3 FAG-a doda se u svaku jažicu u radnoj otopini (empirijski odabranoj) pripremljenoj u FBI-u. staviti u mokru Petrijevu zdjelicu i inkubirati na (37 ± 1) C 30 min.

Na kraju bojenja stakalca se isperu tri puta, svaki put potapajući ih na 10 minuta u posudu s PBS-om. Zatim se preparati isperu destiliranom vodom i suše na zraku 20-30 minuta.

Nefluorescentno uronjeno ulje nanosi se na obojene preparate i gleda pod fluorescentnim mikroskopom.

8.4 Rukovanje rezultatima

U obojenim preparatima stanična kultura koja nije zahvaćena virusom bjesnoće slabo svijetli. sivkasto-žuta boja (negativna kontrola). Antigen virusa bjesnoće detektira se u citoplazmi stanične kulture u obliku svijetlozelenih granula različitih oblika i veličina s jasno definiranim rubovima (pozitivna kontrola).

Dijagnoza bjesnoće smatra se postavljenom ako se u preparatu za ispitivanje nađu tipična žutozelena zrnca u nekoliko vidnih polja mikroskopa.

Ako se virus bjesnoće ne otkrije u staničnoj kulturi, postavlja se negativna dijagnoza.

Rezultati izolacije virusa bjesnoće u kulturi stanica su konačni, daljnja istraživanja se ne provode.

9 Bistlerob na bijelim miševima

9.1 Bit metode

Suština metode je izolacija virusa bjesnoće intracerebralnom injekcijom patološkog materijala bijelim miševima, nakon čega slijedi identifikacija virusa metodom fluorescentnih antitijela prema 7.

9.2 Priprema uzoraka za ispitivanje - prema 6.2.1.

9.3 Provođenje studije

Pet-šest bijelih miševa inficira se im-tracerebralno 10%-tnom suspenzijom patološkog materijala u volumenu od 0,02-0,03 cm 3 . Zaraženi miševi se stavljaju u poseban kavez na koji se lijepi naljepnica s datumom infekcije, brojem miševa, načinom infekcije i brojem pregleda patološkog materijala. Životinje se promatraju najmanje 30 dana. U dnevnik se upisuje broj zdravih, bolesnih i uginulih miševa.

9.4 Rukovanje rezultatima

Pri ocjeni rezultata uzima se u obzir prisutnost kliničkih znakova kod zaraženih miševa (naborana dlaka, uzimanje hrane, poremećaj koordinacije pokreta, paraliza, tremor, prostracija). Ne uzima se u obzir smrt miševa u prva dva dana nakon infekcije. Uzorke mozga bolesnih i uginulih životinja, počevši od trećeg dana, pregledava MVP do 7.

Biotest se smatra pozitivnim ako se, počevši od trećeg dana nakon infekcije, barem jedan miš razbolio i uginuo, au uzorku mozga pomoću MFA otkrivene su specifične inkluzije virusa bjesnoće.

Negativna dijagnoza može se dati tek nakon 30 dana promatranja, pod uvjetom da su sve zaražene životinje ostale žive i zdrave.

Rezultati biološkog testa smatraju se konačnima, daljnja istraživanja se ne provode.

10 Enzimska imunološka metoda (ELISA)

10.1 Suština metode

8 ELISA se temelji na specifičnoj interakciji antigena virusa bjesnoće s antihelijom. imobiliziran na čvrstom nosaču. Vezani antigen detektira se pomoću drugog protutijela protiv bjesnoće obilježenog peroksidazom. produkt reakcije se boji nakon dodatka kromogena. Intenzitet bojenja produkta reakcije izravno je proporcionalan količini antigena.

10.2 Priprema za studiju

10.2.1 Kao ispitni materijal (antigen) koriste se uzorci moždanog tkiva uginulih, prisilno ubijenih, sumnjivih na bjesnoću ili eksperimentalno zaraženih virusom bjesnoće životinja.

10.2.2 Priprema testnog antigena

Uzorci moždanog tkiva dobiveni prema 6.5 se zdrobe, usitne u mužaru i 10% * suspenzija se pripremi u C.9% izotoničnoj otopini natrijevog klorida, zagrijava se u vodenoj kupelji na temperaturi od 60 * C 15 minuta i centrifugira. 5-10 min na 2000 o/min. Supernatant se koristi kao testni antigen.

10.2.3 Priprema reagensa

sve otopine i reagensi prije postavljanja reakcije moraju se držati najmanje 30 minuta na temperaturi od (22 ± 1) * C.

Priprema komponenti kompleta provodi se prema uputama za uporabu.

10.3 Provođenje studije

10.3.1 ELISA se provodi u sendvič verziji koristeći komponente uključene u kit za detekciju antigena patogena bjesnoće u patološkom materijalu.

Za ELISA se koriste ploče za imunološke reakcije s ravnim dnom.

Volumen sastojaka unesenih u fazama u jažice tablete je međusobno jednak i

10.3.2 Senzibilizacija ploče

6 jažica polistirenske ploče napunjeno je ANG-om u radnom razrjeđenju naznačenom na naljepnici. Ploča s ANG-om se pokrije poklopcem i inkubira u termostatu na temperaturi od (37 ± 0,5) *C 3 sata ili na temperaturi od 4 *C 18 sati. Nakon inkubacije jažice ploče se isperu. tri puta otopinom pufera za pranje. Protresite sadržaj jažica pri svakom pranju. a zaostalu otopinu skida se lupanjem po filter papiru.

10.3.3 Primjena antigena

8 redova ploče A. 8 i C dodajte pufer za pranje. Kontrolni pozitivni (jažica A1) i negativni (jažica A2) antigeni uključeni u kit, kao i ispitni uzorci (jažice AZ. A4, itd.) uvode se u jažice tablete i titriraju okomito, dobivajući razrjeđenja od 1 : 2 do 1: 8. S velikim brojem uzoraka popunite ostale redove tablete. Ploča se pokrije poklopcem i inkubira u hermostatu na temperaturi od (37 ± 0,5) *C tijekom 1 sata.Na kraju inkubacije, jažice ploče se isperu tri puta od antigena koji nisu vezani na imunoglobulin, kako je opisano u 10.3.2.

10.3.4 Primjena konjugata leroksidaze bjesnoće

Radna otopina konjugata peroksidaze protiv bjesnoće doda se u jažice ploče, zatim se pokrije poklopcem i inkubira u termostatu na temperaturi od (37 ± 0,5) C tijekom 1 sata. Zatim se jažice na ploči oprati tri puta kako je opisano u 10.3.2.

10.3.5 Rasprostiranje mješavine supstrata

Za manifestaciju reakcije, pripremljena smjesa supstrata se dodaje u jažice tablete. Reakcija se prikazuje 15 - 30 min na temperaturi od (22 ± 0,5) *C u mraku. Reakcija se zaustavlja dodavanjem otopine sumporne kiseline molarne koncentracije 2 mol/DM 3 .

10.4 Rezultati rukovanja

Računanje reakcije provodi se vizualno ili na skenirajućem spektrofotometru u skladu s uputama za uporabu kita.

Ako se OPD koristi kao kromogen u smjesi supstrata. zatim se mjerenje optičke gustoće provodi na 490 nm. ako koristite TMB. zatim na 450 km.

Reakcija dolazi u obzir samo ako nema specifičnog bojenja u jažicama s negativnom antigenskom kontrolom, dok je intenzivno bojenje u jažicama s kontrolom pozitivan antigen. Kod vizualnog brojanja uzorak se smatra pozitivnim ako barem jedno (prvo) razrjeđenje pokazuje specifično bojenje.

Kada se spektrofotometrijski uzima u obzir rezultat ELISA, izračunava se koeficijent specifičnosti K sp. koja je jednaka omjeru optičke gustoće (OD) produkta reakcije u jažicama s kontrolnim pozitivnim antigenom ili ispitnim materijalom (OD) i optičke gustoće smjese supstrata u jažicama s kontrolom negativnog antigena (OD) . Reakcija se smatra pozitivnom. ako je koeficijent specifičnosti veći od 2,1 i negativan ako je manji od 2,1.

OP1 * 0,641, OPg a 0,120, Ksp \u003d 5,34 - reakcija je pozitivna ili OP1 \u003d 0,180, OPg na 0,120 K s „ * 1,5 - reakcija je negativna.

U slučaju pozitivne reakcije dijagnoza se smatra postavljenom. Negativan rezultat mora biti potvrđen drugim metodama prema 7 - 9.

11 Reakcija difuzijske precipitacije (RDP)

11.1 Suština metode

Suština RDP metode leži u sposobnosti antitijela i virusnog antigena da difundiraju u agar gelu i specifičnom interakcijom formiraju kompleks antigen-antitijelo koji je vidljiv golim okom u obliku precipitacijske linije.

11.2 Priprema ispita

11.2.1 Priprema uzorka

Priprema uzoraka za istraživanje - prema 8.2.1.

Dopušteni su za istraživanje ustajali uzorci životinjskog mozga kontaminirani bakterijskom mikroflorom.

11.2.2 Priprema agara

Za pripremu agara pomiješajte 1,5 g Difko agara. 1 cm 3 1% otopine metiloranža u 50% etanolu. 0,01 g mertiolata. 100 cm 3 izotonične otopine natrijeva klorida. Dobivena smjesa se kuha dok se agar potpuno ne otopi, ulije u epruvete, autoklavira pod tlakom od 0,5 atm 30 minuta i čuva u hladnjaku na temperaturi od 4°C.

11.2.3 Priprema stakalca (Petrijeve zdjelice)

Reakcija se postavlja ili na stakalce ili na Petrijeve zdjelice. Kap otopljenog agara nanese se na odmašćenu čašu, ravnomjerno se rasporedi po čaši i ostavi na sobnoj temperaturi 20-30 minuta da se agar skrutne. Zatim se na staklo nanese 2,5 cm 3 rastaljenog agara, formirajući sloj debljine oko 2 mm. i ostaviti 20-30 minuta. Rupe se izrađuju u smrznutom sloju agara pomoću posebnog žiga ili metalne cijevi s tankim stijenkama promjera 4-5 mm. Stupci agara pažljivo se uklanjaju, bez oštećenja ili dopuštanja da se tanki sloj agar gela odlijepi sa stakla, pomoću pincete za oči ili drugog instrumenta.

Slično se pripremaju i Petrijeve zdjelice, u koje se dodaje 10 - 15 cm 3 rastaljenog agara da se dobije sloj debljine 2-3 mm.

11.3 Provođenje studije

Neposredno prije postavljanja reakcije pripremaju se razrjeđenja seruma protiv bjesnoće (imunoglobulina) za što se u četiri epruvete doda po 1,0 cm 3 izotonične otopine natrijeva klorida. U prvu epruvetu dodajte 1,0 cm 3 seruma protiv bjesnoće, dobivši razrjeđenje 1:2.

miješati, te 1,0 cm 3 smjese prenijeti u drugu epruvetu itd. Tako se dobiju četiri epruvete s razrjeđenjima 1:2,1:4,1:8 i 1:16.

8 pripremljenih jažica daje 0,05 - 0,07 cm 3 uzorka mozga (svaki uzorak u zasebnu jažicu), dobivenog prema 8.2.1. i razrjeđenja seruma protiv bjesnoće ili imunoglobulina (1:2; 1:4; 1:8:1:16) prema slici 1.

Slika 1 - Shema primjene materijala

Ar - Emonov rog; Pm - produžena moždina; A+ - antigen pozitivne kontrole; M - mali mozak; K - cerebralni korteks; A- - antigen negativne kontrole.

moguće je koristiti i druge sheme unošenja materijala, ali je obvezna uporaba pozitivnih i negativnih antigena.

Predmetna stakla s ispitivanim materijalom stavljaju se u Petrijeve zdjelice s navlaženim dnom ili mokri eksikator, a zatim u termostat na temperaturi od (37 ± 1) * C tijekom 48 sati (Petrijeve zdjelice pokriju se poklopcem i stave u termostat).

Reakcija se uzima u obzir nakon 6,24 i 48 sati.

11.4 Rezultati rukovanja

Reakcija se smatra pozitivnom kada se između jažica s ispitivanim materijalom i serumom protiv bjesnoće (imunoglobulinom) pojavi čak i jedna linija taloženja bilo kojeg intenziteta.

U tom slučaju između pozitivnog antigena i seruma protiv bjesnoće (imunoglobulina) treba uočiti vidljivu liniju taloženja, a između negativnog antigena i seruma protiv bjesnoće (imunoglobulina) ne smije biti precipitacijske linije.

U 8 slučajeva pozitivne reakcije dijagnoza se smatra postavljenom. Negativan rezultat mora biti potvrđen drugim metodama prema 7-10.

bibliografija

EU Vodič za dobru proizvođačku praksu za medicinske proizvode za ljudsku i veterinarsku uporabu

UDK 619:616.98:579.852.1:615371 MKS 11.220

Ključne riječi: bjesnoća, dijagnostika, metoda fluorescentnih antitijela, vezani imunosorbentni test, biološki test, reakcija difuzijske precipitacije

Potpisano za objavu 01.04.2014. Format 60x84V

Uel. pvc. l. 1.40. Tiraž 31 ekv. Zach. 1363.

Pripremljeno na temelju elektroničke verzije koju je dao razvojni programer standarda

FSUE "STANDARTINFORM"

123995 Moskva. Granat Lane, 4.

METODIČKE UPUTE
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA BJESNOĆE

1. Dijagnoza bjesnoće postavlja se na temelju kompleksa epizootoloških, kliničkih, patoanatomskih podataka i uglavnom na temelju laboratorijskih pretraga.

2. Za istraživanje se šalju u laboratorij kurirom: svježi leš ili glava psa (mačka, lisica, polarna lisica, ovca, tele itd.), Od velikih životinja - glava ili mozak (svježi ili konzervirani u 30 - 50% otopini glicerina). Za serološke studije prikladni su samo nekonzervirani mozgovi.

3. Laboratorijska dijagnostika bjesnoće sastoji se u mikroskopskom pregledu mozga (radi otkrivanja Babes-Negrijevih tjelešaca), serološkom pregledu (dokazivanje specifičnog antigena bjesnoće), kao i postavljanju biološkog testa na bijelim miševima ili kunićima. .

Redoslijed istraživanja.

4. Iz mozga primljenog za studiju, oni su najprije zasađeni na hranjive medije. Dio mozga se odmah stavlja u hladnjak i čuva u slučaju potrebe za ponovnim pregledom. Uzima se materijal iz ostatka mozga za mikroskopski pregled, serološke reakcije i biološke uzorke.

Bilješka. Obdukcija, vađenje mozga i drugi radovi provode se u sterilnim uvjetima uz strogo pridržavanje mjera osobne prevencije (snažna fiksacija glave životinje, zaštita ruku s dva para rukavica: kirurškim i anatomskim; stavljaju se zaštitne naočale zaštititi oči, a nos i usta pokriti zavojem od gaze).

I. MIKROSKOPSKA STUDIJA

5. Za mikroskopski pregled izrađuju se otisci i razmazi iz različitih dijelova mozga.

6. Za pripremu otiska komadići mozga (Amonov rog, cerebralni korteks, cerebelum, medulla oblongata) stavljaju se na filter papir presavijen u 4-6 slojeva. Presječena površina dodirne se nekoliko puta (3 - 4) uzastopce čistim predmetnim staklom, uz lagani pritisak da se na staklu ostavi tanak otisak.

7. Brisevi se rade iz istih područja mozga. Za to se komadići mozga melju u porculanskom mužaru batom ili u epruveti staklenim štapićem dok ne nastane homogena masa od koje se prave grubi razmazi na odmašćenom stakalcu.

Razmaze možete napraviti i na drugi način. Da bi se to postiglo, mali komadić mozga stavi se na rub predmetnog stakla, zgnječi drugim staklom i razmaže od jednog ruba do drugog, čime se dobije tanka jednolika mrlja na površini predmetnog stakla. stakla.

8. Dobivene mrlje ili otisci boje se na jedan od sljedećih načina:

a) bojenje po Muromtsevu. Napravljeni, još vlažni mrlje ili otisci odmah se fiksiraju u etilnom ili metilnom alkoholu ili u mješavini alkohola napola s eterom ili acetonom (kemijski čistim) 1-2 sata i zatim se isperu vodom. Spremnik za fiksiranje mora biti dobro zatvoren kako bi se spriječilo isparavanje tekućine za fiksiranje. Nakon ispiranja vodom vlažni se razmazi stavljaju 5-10 minuta u otopinu Munsonove boje razrijeđene vodom u omjeru 1:40. Zatim se boja ocijedi i odmah se razmazi uranjaju u 10% vodenu otopinu tanina na 8-10 minuta dok se ne pojavi plavičasta boja. Nakon toga se razmazi isperu vodom, osuše filtar papirom, propuste kroz mješavinu jednakih dijelova alkohola s acetonom (kemijski čistim) ili alkohola sa ksilolom i ponovno osuše filtar papirom. Obojeni razmaz trebao bi imati svijetloplavu pozadinu, dok su jezgre živčanih stanica obojene plavo, a Babesh-Negrijeva tijela blijedoljubičasta s tamnim inkluzijama;

b) Prodavači mrljaju. Na pripremljeni mokri otisak ili razmaz nanijeti 4 s mješavinu reagensa "A" (metilensko plavo - 2 g, metilni alkohol bez acetona - 100 ml) i reagensa "B" (bazični fuksin - 0,5 g, etilni alkohol bez tragova). acetona - 100 ml). Radna otopina boje sastoji se od 15 ml reagensa "A", 2 - 4 ml reagensa "B" i 25 ml metilnog alkohola. Nakon bojenja preparat se ispere tekućom vodom i osuši. U obojenom razmazu, citoplazma neurona je svijetlo plava, nukleoli su tamno plavi, eritrociti su ciglasto crveni, Babesh-Negrijeva tijela su ljubičasto-crvena s jasno vidljivom bazofilnom strukturom tijela;

c) bojenje po Mikhinu. Mrlje ili otisci se fiksiraju u mješavini alkohola i etera (jednako) 5-10 minuta, nakon čega se suše filter papirom i boje 30-40 minuta Giemsa bojom (1-2 kapi na 1 ml destilirane vode). ), brzo isperu zakiseljenim alkoholom (1 kap ledene octene kiseline na 30 ml 96 ° alkohola), a zatim vodom, osuše filter papirom i podvrgnu istraživanju. Ako je materijal bio u glicerinu, tada se prethodno dobro ispere u vodi i osuši filter papirom.

U obojenom preparatu, pod mikroskopskim pregledom, glavna pozadina trebala bi biti crvena s ljubičastom nijansom. Uz prevlast plavog tona, razmaz se ponovno ispere zakiseljenim alkoholom i ispere vodom. Piramidalne živčane stanice imaju plavkastu boju s intenzivno crnom jezgrom, a Babesh-Negrijeva tijela su ružičasto-crvena s točkastim uključcima tamnoplave;

d) bojenje po Bormann-Gainullini. Tanke mrlje ili otisci fiksiraju se 5 minuta u smjesi sljedećeg sastava: alkohol i eter (jednako) - 98 ml, ledena octena kiselina - 2 ml; nakon fiksiranja uranjaju se 5 minuta u 10%-tnu otopinu kristalne sode, zatim isperu vodom i osuše na zraku. Fiksirani razmazi se boje 2 minute bojom pripremljenom prije upotrebe (zasićena vodena otopina metilenskog modrila - 3 kapi, zasićena bazična otopina fuksina - 2 kapi, voda iz slavine - 20 ml). Otopina boje se izlije na namaz, fiksira iznad plamena plamenika, zatim se boja ostavi još jednu minutu, nakon čega se ispere vodom i osuši filter papirom. U obojenom razmazu glavna pozadina trebala bi biti jarko crvena, protoplazma živčanih stanica obojena je crvenkasto-plavo, a njihove jezgre tamnoplave, Babes-Negrijeva tjelešca obojena su jagodasto crveno s tipično zrnastom strukturom. Eritrociti izgledaju kao neobojeni krugovi.

II. SEROLOŠKE STUDIJE

9. Reakcija difuzne precipitacije u agar gelu. Reakcija se koristi za otkrivanje specifičnog antigena bjesnoće u neočuvanom mozgu životinja uginulih od ulične bjesnoće, kao i kod životinja na kojima je rađen biotest. Za reakciju možete koristiti ustajali (do 1 mjesec) mozak.

Reakcija se provodi na stakalcima obranog stakla, na koje se stavlja 2,5 ml otopljenog i ohlađenog na 60 °C agar gela, pripremljenog prema receptu: suhi agar-agar - 12 - 15 g; kemijski čisti natrijev klorid - 8,6 g; 1% otopina (filtrirana) metil naranče na 50 ° alkohola - 5 - 10 ml; mertiolat - 0,01 g; destilirana voda - 1 l.

Bilješka. Za postavljanje reakcije bolje je koristiti Difko agar-agar, potpuno se otapa, nije potrebno filtriranje medija. Druge vrste agar-agara zahtijevaju pažljivo filtriranje.

Nakon što se agar skrutne, u njemu se naprave rupe pomoću metalne ili staklene cijevi s tankim stijenkama unutarnjeg promjera 4–5 mm, raspoređujući ih prema šabloni (vidi sliku -).

Za reakciju kod velikih životinja koriste se dijelovi mozga - amonov rog, kora hemisfera, mali mozak, produžena moždina; kod štakora, gofa, zamorci, hrčci itd. - bilo koja tri dijela mozga; miševi imaju cijeli mozak.

Shema postavljanja mikroprecipitacije:
ALI - kora (lijeva polutka); NA- korteks (desna hemisfera); IZ- amonov rog (lijevo);
D- amonov rog (desno); E- mali mozak; I- medula;
1 , 2 , 3 , 4 - razrjeđenja globulina, odnosno 1:2, 1:4, 1:8, 1:16.

Pozitivan RP sa svim razrjeđenjima globulina
(moždani korteks ovaca, ulična bjesnoća)

Pozitivan RP s razrjeđenjima globulina 1:4; 1:8, 1:16
(amon pas rog, ulična bjesnoća)

Pozitivan RP s razrjeđenjima globulina 1:16,
nema oborinskih linija s razrjeđenjima 1:2, 1:4,
(produljena moždina psa, ulična bjesnoća)

Mozak se tučkom melje u porculanskom mužaru ili u samoj lubanji u “pastu” u koju se pune jažice za antigen. Preostale jažice napune se precipitirajućim globulinom protiv bjesnoće u razrjeđenju 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. Količina korištenih sastojaka je 0,02 ml.

Kontrole s pozitivnim i negativnim antigenima stavljaju se istovremeno na zasebno stakalce koristeći isti agar koristeći istu šablonu.

Nakon što se reakcijski sastojci stave u odgovarajuće jažice, stakalca se prenesu u vlažnu komoru (Petrijeve zdjelice s mokrim filter papirom ili vatom) i stave u termostat na 6 sati na temperaturu od 37-38 °C. Zatim se posude ostave na sobnoj temperaturi još 18 sati.

Računanje reakcije provodi se 3, 6 i 24 sata nakon postavljanja. Kako bi se spriječilo isušivanje agara, reakcijska stakalca stavljaju se u iste Petrijeve zdjelice koje sadrže navlaženu vatu nakon svakog gledanja.

Uz pozitivnu reakciju taloženja agara, između jažica s globulinom i antigenom mogu se formirati jedna, dvije, a vrlo rijetko tri paralelne linije taloženja. Nastale taložne linije vizualno su vidljive kada se stakla osvijetle iluminatorom odozdo prema gore pod kutom od približno 45°.

Uz negativne indikacije reakcije taloženja, postavlja se biološki test.

10. Reakcija imunofluorescencije. Temelji se na detekciji pomoću posebnih mikroskopa (ML-1, ML-2, ML-3 itd.) virusnog antigena koji je reagirao sa specifičnim serumom protiv bjesnoće obilježenim fluorescentnom bojom.

Za reakciju se rade tanki i jednakoslojni otisci na pažljivo odmašćenim staklima svježeg ili svježe smrznutog mozga. Otisci se pripremaju iz dijelova mozga (Amonov rog, moždana kora, mali mozak, produžena moždina) na isti način kao i za mikroskopski pregled. Od svakog komadića mozga pripremaju se najmanje 4 pripravka. Za kontrolu, lijekovi se na sličan način izrađuju iz mozga zdrave životinje.

Nakon sušenja na zraku, preparati se fiksiraju u acetonu 4 sata na temperaturi ne višoj od 4 °C. Spremnik za fiksiranje mora biti dobro zatvoren kako bi se spriječilo isparavanje tekućine za fiksiranje. Nakon fiksiranja acetonom, na pripravke se u radnom razrjeđenju nakapa nekoliko kapi konjugata (fluorescentni gama globulin protiv bjesnoće). Zatim se stave u vlažnu komoru (Petrijeva zdjelica ili zatvorena emajlirana kiveta s navlaženim dnom) 20 - 30 minuta na temperaturi od 25 °C.

Nakon toga se preparati isperu vodom ili otopinom fosfatnog pufera (pH 7,2 - 7,4) 1 sat, zatim isperu destiliranom vodom, osuše na zraku i podvrgnu istraživanju. Preparati se promatraju pod imerzijskim sustavom. Za uranjanje se koristi neluminiscentno ulje.

U obojenom preparatu, pod fluorescentnim mikroskopom, tkivo mozga fluorescira (sjaji) mutnom sivkasto-žutom bojom. Antigen virusa bjesnoće otkriva se u pripravcima u obliku svijetlo žućkasto-zelenih ili zelenih granula različitih oblika i veličina - od jedva primjetnih do promjera 15-20 mikrona.

U kontrolnom pripravku nisu uočena žuto-zelena intenzivno svjetlucava zrnca.

U istraživanju pomoću metode fluorescentnih protutijela, dijagnoza bjesnoće smatra se utvrđenom ako se u nekoliko vidnih polja mikroskopa pronađe dovoljan broj (najmanje 10) tipičnih granula sa svijetlim zelenkastim sjajem različitih veličina. U kontroli takvih formacija ne bi trebalo biti.

U nedostatku pozitivne fluorescencije, stavlja se biološki uzorak.

III. BIOLOŠKI UZORAK

11. Biološki test na bjesnoću postavlja se ako se mikroskopskim pregledom dobije negativan rezultat (ne otkrivaju se Babes-Negrijeva tjelešca), uz serološke reakcije (ne otkriva se specifični antigen bjesnoće), kao i kada se otkrivaju atipične inkluzije. Biološki test se provodi na bijelim miševima ili zečevima.

12. Pokusni miševi ili kunići zaraženi su 10%-tnom suspenzijom iz ispitivanog mozga u fiziološkoj otopini ili mesno-peptonskoj juhi s pH 7,2 - 7,4. Za pripremu suspenzije koriste se isti dijelovi mozga iz kojih je uzet materijal za mikroskopske i serološke studije.

Izrezani dijelovi mozga skupljaju se u sterilnu epruvetu i važu, a potom tučkom dobro usitne u tarioniku, nakon čega se doda fiziološka otopina ili mesno-peptonska juha da se dobije 10% suspenzija. Dobivena suspenzija ostavi se stajati 10 minuta i supernatant se koristi za infekciju.

Ako je patološki materijal kontaminiran, tada se supernatant izlije u drugu posudu (epruvetu) i doda mu se 500-1000 IU penicilina i streptomicina na 1 ml tekućine, nakon čega se ostavi stajati još 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim se koristi za infekciju. Suspenzija mora biti pripremljena u sterilnim uvjetima i uz strogo pridržavanje pravila osobne prevencije.

Biološki test na bijelim miševima. Za infekciju koriste se bijeli miševi težine 8-10 g. Za svaku studiju uzima se 6 miševa, od kojih su 3 zaražena u mozgu, a 3 - supkutano. Kada se inficira u mozgu, igla se uvodi u točku iza linije koja povezuje stražnje kutove i malo dalje od linije koja prolazi sredinom glave. Mjesto infekcije je obrisano alkoholom. Suspenzija se primjenjuje u dozi od 0,03 ml. Kako bi se spriječilo duboko prodiranje igle u mozak, na njen vrh se stavlja graničnik - mali komad gumene cijevi, koji je fiksiran na udaljenosti od 2-3 mm od kraja igle. U slučaju potkožne infekcije suspenzija se ubrizgava u područje vrha nosa (gornja usna) u dozi od 0,05 ml. Na mjestu ubrizgavanja stvara se mala oteklina. Zaraženi miševi se stave u staklene posude i promatraju 30 dana. Na pozitivan rezultat bioloških uzoraka u miševa, obično 7. - 15. dana nakon infekcije, razvija se klinika paralitičke bjesnoće.

U početku se primjećuje letargija, razbarušeni kaput i neka vrsta grbavosti, kao i poremećena koordinacija pokreta. Zatim dolazi do paralize stražnjih udova, a kasnije - prednjih, pretvarajući se u opću paralizu, koja završava smrću. Trajanje bolesti je 2-3 dana.

S razvojem opće paralize, miševi se žrtvuju eterskom ili kloroformskom anestezijom. Uginulim i ubijenim miševima otvara se lubanjska šupljina, mozak se inokulira na hranjive podloge, nakon čega se mozak uklanja iz kojeg se pripremaju preparati za mikroskopska i imunobiološka ispitivanja.

S odsutnošću kliničke manifestacije bjesnoće kod zaraženih miševa uništavaju se unutar 30 dana. Staklenke u kojima su držane temeljito se dezinficiraju.

Biološki test na kunićima. Za postavljanje biološkog uzorka uzimaju se 4 kunića težine najmanje 1,5 kg svaki. 2 kunića su zaražena u mozak i 2 intramuskularno u predjelu bedara. Suspenzija se primjenjuje intracerebralno u dozi od 0,2 ml, a intramuskularno u dozi od 2 ml.

Uz pozitivan rezultat biološke pretrage, kunići obolijevaju unutar 16 do 21 dana. Bolest bjesnoće javlja se kod kunića u tihom paralitičkom obliku sa koban. Uginulim zečevima mozak se uklanja i daljnja istraživanja provode na isti način kao kod zaraze miševa. Kunići se promatraju 45-50 dana. Nakon navedenog roka, kunići se uništavaju. Kavezi u kojima su držane pokusne životinje se dezinficiraju.

IV. HISTOLOŠKI PREGLED 1

1 Kao dodatna metoda koristi se histološki pregled

Za histološku pretragu uzimaju se komadići Ammonovog roga, cerebralnog korteksa, cerebeluma, medule oblongate i fiksiraju u jednom ili dva obroka acetona tako da trajanje fiksacije bude unutar 6-18 sati.

Bolje je ostaviti fiksaciju u acetonu preko noći. Zatim se patološki materijal propusti kroz dva dijela ksilena, držeći svaki po 30 minuta, i kroz dva dijela parafina - svaki po 1 sat. Gotovi rezovi se deparafiniziraju uobičajenom metodom i boje prema Lenzu ili Turevichu:

Bojanje prema Lenzu. Presjeci se boje otopinom eozina 1-3 minute (0,5 g eozina otopi se u 100 ml 60 ° etil alkohol). Eozin se brzo ispere vodom i boji Lefleurovim metilenskim modrilom 1 min, ispere vodom, pažljivo osuši filtar papirom i diferencira otopinom jedinica. koga natrija u apsolutnom alkoholu (5 kapi kaustične sode na 30 ml alkohola) do blijedoružičaste boje. Na preparat se prelije otopina octene kiseline (1 kap ledene octene kiseline na 60 ml apsolutnog alkohola) i drži do pojave slabo plave boje, brzo se ispere alkoholom i bistri ksilolom 4-5 minuta. Tijela Babesh-Negrija obojena su svijetlo crveno s plavim inkluzijama, citoplazma ganglijskih stanica je blijedo plava;

Bojanje prema Turevichu. Deparafinizirani rezovi odmah nakon prolaska kroz alkohole i destiliranu vodu boje se Weigertovim ili Ehrlichovim hematoksilinom, isperu destiliranom vodom. Zatim se boji 1% vodenom otopinom kiselog fuksina 1 minutu i temeljito ispere destiliranom vodom dok se ne pojavi blijedoružičasta nijansa. Nakon pranja tretira se mješavinom (u jednakim dijelovima) zasićene vodene otopine pikrinske kiseline (25-30 g pikrinske kiseline na 1 litru vruće destilirane vode) i 96% alkohola. Tijekom obrade opaža se ispuštanje oblaka crvene boje, a rezovi nakon 10–20 s dobivaju žutu nijansu. Sekcije se brzo isperu u vodi i lagano osuše filtar papirom. Zatim se jednako brzo propušta kroz apsolutni ili 96° alkohol, karbol-ksilol, čisti ksilol i stavlja u melem. Tijela Babesh-Negrija su trešnja crvena, jezgre stanica su crne ili plave, ovisno o tome kojim hematoksilinom su obojene. Oblik i veličina tijela Babesh-Negrija vrlo su raznoliki, nalaze se u citoplazmi i procesima živčanih stanica u obliku brojnih ili pojedinačnih kopija. Češće se Babes-Negrijeva tijela nalaze u velikim ganglijskim stanicama, a stanice koje ih sadrže nemaju izražene znakove degeneracije.

Često se nalaze i druge inkluzije, koje se zbog niza sličnih značajki ponekad pogrešno smatra Negrijevim tjelešcima. Treba imati na umu da mozgovi zdravih mačaka i bijelih miševa ponekad sadrže nespecifična acidofilna inkluzijska tjelešca. Ta se tijela mogu razlikovati od Negrijevih tijela po odsutnosti unutarnjih granula i homogenosti glavne tvari.

Bjesnoću karakteriziraju i znakovi akutnog encefalomijelitisa: pretežno oko malih vena nalaze se perivaskularni infiltrati koji se uglavnom sastoje od limfoidnih stanica koje izgledaju poput staničnih mufova.

U ganglijskim stanicama mozga može doći do kromatolize, vakuolizacije i akutnog bubrenja stanica, kao i smrti pojedinih stanica. U području oštećenih živčanih stanica proliferativna reakcija glije je prilično konstantna, poprimajući oblik prave neuronofagije, praćena zamjenom živčanih stanica elementima umnožene glije. Takvo nakupljanje proliferiranih stanica na mjestu dezintegrirane živčane stanice naziva se „čvržica bjesnoće” - ponekad se proces razvoja kvržice može pratiti na rezu (1).

METODIČKE UPUTE
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA BJESNOĆE

1. Dijagnoza bjesnoće postavlja se na temelju kompleksa epizootoloških, kliničkih, patoanatomskih podataka i uglavnom na temelju laboratorijskih pretraga.

2. Za istraživanje se šalju u laboratorij kurirom: svježi leš ili glava psa (mačka, lisica, polarna lisica, ovca, tele itd.), Od velikih životinja - glava ili mozak (svježi ili konzervirani u 30 - 50% otopini glicerina). Za serološke studije prikladni su samo nekonzervirani mozgovi.

3. Laboratorijska dijagnostika bjesnoće sastoji se u mikroskopskom pregledu mozga (radi otkrivanja Babes-Negrijevih tjelešaca), serološkom pregledu (dokazivanje specifičnog antigena bjesnoće), kao i postavljanju biološkog testa na bijelim miševima ili kunićima. .

Redoslijed istraživanja.

4. Iz mozga primljenog za studiju, oni su najprije zasađeni na hranjive medije. Dio mozga se odmah stavlja u hladnjak i čuva u slučaju potrebe za ponovnim pregledom. Uzima se materijal iz ostatka mozga za mikroskopski pregled, serološke reakcije i biološke uzorke.

Bilješka. Obdukcija, vađenje mozga i drugi radovi provode se u sterilnim uvjetima uz strogo pridržavanje mjera osobne prevencije (snažna fiksacija glave životinje, zaštita ruku s dva para rukavica: kirurškim i anatomskim; stavljaju se zaštitne naočale zaštititi oči, a nos i usta pokriti zavojem od gaze).

I. MIKROSKOPSKA STUDIJA

5. Za mikroskopski pregled izrađuju se otisci i razmazi iz različitih dijelova mozga.

6. Za pripremu otiska komadići mozga (Amonov rog, cerebralni korteks, cerebelum, medulla oblongata) stavljaju se na filter papir presavijen u 4-6 slojeva. Presječena površina dodirne se nekoliko puta (3 - 4) uzastopce čistim predmetnim staklom, uz lagani pritisak da se na staklu ostavi tanak otisak.

7. Brisevi se rade iz istih područja mozga. Za to se komadići mozga melju u porculanskom mužaru batom ili u epruveti staklenim štapićem dok ne nastane homogena masa od koje se prave grubi razmazi na odmašćenom stakalcu.

Razmaze možete napraviti i na drugi način. Da bi se to postiglo, mali komadić mozga stavi se na rub predmetnog stakla, zgnječi drugim staklom i razmaže od jednog ruba do drugog, čime se dobije tanka jednolika mrlja na površini predmetnog stakla. stakla.

8. Dobivene mrlje ili otisci boje se na jedan od sljedećih načina:

a) bojenje po Muromtsevu. Napravljeni, još vlažni mrlje ili otisci odmah se fiksiraju u etilnom ili metilnom alkoholu ili u mješavini alkohola napola s eterom ili acetonom (kemijski čistim) 1-2 sata i zatim se isperu vodom. Spremnik za fiksiranje mora biti dobro zatvoren kako bi se spriječilo isparavanje tekućine za fiksiranje. Nakon ispiranja vodom vlažni se razmazi stavljaju 5-10 minuta u otopinu Munsonove boje razrijeđene vodom u omjeru 1:40. Zatim se boja ocijedi i odmah se razmazi uranjaju u 10% vodenu otopinu tanina na 8-10 minuta dok se ne pojavi plavičasta boja. Nakon toga se razmazi isperu vodom, osuše filtar papirom, propuste kroz mješavinu jednakih dijelova alkohola s acetonom (kemijski čistim) ili alkohola sa ksilolom i ponovno osuše filtar papirom. Obojeni razmaz trebao bi imati svijetloplavu pozadinu, dok su jezgre živčanih stanica obojene plavo, a Babesh-Negrijeva tijela blijedoljubičasta s tamnim inkluzijama;

b) Prodavači mrljaju. Na pripremljeni mokri otisak ili razmaz nanijeti 4 s mješavinu reagensa "A" (metilensko plavo - 2 g, metilni alkohol bez acetona - 100 ml) i reagensa "B" (bazični fuksin - 0,5 g, etilni alkohol bez tragova). acetona - 100 ml). Radna otopina boje sastoji se od 15 ml reagensa "A", 2 - 4 ml reagensa "B" i 25 ml metilnog alkohola. Nakon bojenja preparat se ispere tekućom vodom i osuši. U obojenom razmazu, citoplazma neurona je svijetlo plava, nukleoli su tamno plavi, eritrociti su ciglasto crveni, Babesh-Negrijeva tijela su ljubičasto-crvena s jasno vidljivom bazofilnom strukturom tijela;

c) bojenje po Mikhinu. Mrlje ili otisci se fiksiraju u mješavini alkohola i etera (jednako) 5-10 minuta, nakon čega se suše filter papirom i boje 30-40 minuta Giemsa bojom (1-2 kapi na 1 ml destilirane vode). ), brzo isperu zakiseljenim alkoholom (1 kap ledene octene kiseline na 30 ml 96 ° alkohola), a zatim vodom, osuše filter papirom i podvrgnu istraživanju. Ako je materijal bio u glicerinu, tada se prethodno dobro ispere u vodi i osuši filter papirom.

U obojenom preparatu, pod mikroskopskim pregledom, glavna pozadina trebala bi biti crvena s ljubičastom nijansom. Uz prevlast plavog tona, razmaz se ponovno ispere zakiseljenim alkoholom i ispere vodom. Piramidalne živčane stanice imaju plavkastu boju s intenzivno crnom jezgrom, a Babesh-Negrijeva tijela su ružičasto-crvena s točkastim uključcima tamnoplave;

d) bojenje po Bormann-Gainullini. Tanke mrlje ili otisci fiksiraju se 5 minuta u smjesi sljedećeg sastava: alkohol i eter (jednako) - 98 ml, ledena octena kiselina - 2 ml; nakon fiksiranja uranjaju se 5 minuta u 10%-tnu otopinu kristalne sode, zatim isperu vodom i osuše na zraku. Fiksirani razmazi se boje 2 minute bojom pripremljenom prije upotrebe (zasićena vodena otopina metilenskog modrila - 3 kapi, zasićena bazična otopina fuksina - 2 kapi, voda iz slavine - 20 ml). Otopina boje se izlije na namaz, fiksira iznad plamena plamenika, zatim se boja ostavi još jednu minutu, nakon čega se ispere vodom i osuši filter papirom. U obojenom razmazu glavna pozadina trebala bi biti jarko crvena, protoplazma živčanih stanica obojena je crvenkasto-plavo, a njihove jezgre tamnoplave, Babes-Negrijeva tjelešca obojena su jagodasto crveno s tipično zrnastom strukturom. Eritrociti izgledaju kao neobojeni krugovi.

II. SEROLOŠKE STUDIJE

9. Reakcija difuzne precipitacije u agar gelu. Reakcija se koristi za otkrivanje specifičnog antigena bjesnoće u neočuvanom mozgu životinja uginulih od ulične bjesnoće, kao i kod životinja na kojima je rađen biotest. Za reakciju možete koristiti ustajali (do 1 mjesec) mozak.

Reakcija se provodi na stakalcima obranog stakla, na koje se stavlja 2,5 ml otopljenog i ohlađenog na 60 °C agar gela, pripremljenog prema receptu: suhi agar-agar - 12 - 15 g; kemijski čisti natrijev klorid - 8,6 g; 1% otopina (filtrirana) metil naranče na 50 ° alkohola - 5 - 10 ml; mertiolat - 0,01 g; destilirana voda - 1 l.

Bilješka. Za postavljanje reakcije bolje je koristiti Difko agar-agar, potpuno se otapa, nije potrebno filtriranje medija. Druge vrste agar-agara zahtijevaju pažljivo filtriranje.

Nakon što se agar skrutne, u njemu se naprave rupe pomoću metalne ili staklene cijevi s tankim stijenkama unutarnjeg promjera 4–5 mm, raspoređujući ih prema šabloni (vidi sliku -).

Za reakciju kod velikih životinja koriste se dijelovi mozga - amonov rog, kora hemisfera, mali mozak, produžena moždina; kod štakora, gofa, zamoraca, hrčaka itd. - bilo koja tri dijela mozga; miševi imaju cijeli mozak.

Shema postavljanja mikroprecipitacije:
ALI - kora (lijeva polutka); NA- kora ( desna hemisfera); IZ- amonov rog (lijevo);
D- amonov rog (desno); E- mali mozak; I- medula;
1 , 2 , 3 , 4 - razrjeđenja globulina, odnosno 1:2, 1:4, 1:8, 1:16.

Pozitivan RP sa svim razrjeđenjima globulina
(moždani korteks ovaca, ulična bjesnoća)

Pozitivan RP s razrjeđenjima globulina 1:4; 1:8, 1:16
(amon pas rog, ulična bjesnoća)

Pozitivan RP s razrjeđenjima globulina 1:16,
nema oborinskih linija s razrjeđenjima 1:2, 1:4,
(produljena moždina psa, ulična bjesnoća)

Mozak se tučkom melje u porculanskom mužaru ili u samoj lubanji u “pastu” u koju se pune jažice za antigen. Preostale jažice napune se precipitirajućim globulinom protiv bjesnoće u razrjeđenju 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. Količina korištenih sastojaka je 0,02 ml.

Kontrole s pozitivnim i negativnim antigenima stavljaju se istovremeno na zasebno stakalce koristeći isti agar koristeći istu šablonu.

Nakon što se reakcijski sastojci stave u odgovarajuće jažice, stakalca se prenesu u vlažnu komoru (Petrijeve zdjelice s mokrim filter papirom ili vatom) i stave u termostat na 6 sati na temperaturu od 37-38 °C. Zatim se posude ostave na sobnoj temperaturi još 18 sati.

Računanje reakcije provodi se 3, 6 i 24 sata nakon postavljanja. Kako bi se spriječilo isušivanje agara, reakcijska stakalca stavljaju se u iste Petrijeve zdjelice koje sadrže navlaženu vatu nakon svakog gledanja.

Uz pozitivnu reakciju taloženja agara, između jažica s globulinom i antigenom mogu se formirati jedna, dvije, a vrlo rijetko tri paralelne linije taloženja. Nastale taložne linije vizualno su vidljive kada se stakla osvijetle iluminatorom odozdo prema gore pod kutom od približno 45°.

Uz negativne indikacije reakcije taloženja, postavlja se biološki test.

10. Reakcija imunofluorescencije. Temelji se na detekciji pomoću posebnih mikroskopa (ML-1, ML-2, ML-3 itd.) virusnog antigena koji je reagirao sa specifičnim serumom protiv bjesnoće obilježenim fluorescentnom bojom.

Za reakciju se rade tanki i jednakoslojni otisci na pažljivo odmašćenim staklima svježeg ili svježe smrznutog mozga. Otisci se pripremaju iz dijelova mozga (Amonov rog, moždana kora, mali mozak, produžena moždina) na isti način kao i za mikroskopski pregled. Od svakog komadića mozga pripremaju se najmanje 4 pripravka. Za kontrolu, lijekovi se na sličan način izrađuju iz mozga zdrave životinje.

Nakon sušenja na zraku, preparati se fiksiraju u acetonu 4 sata na temperaturi ne višoj od 4 °C. Spremnik za fiksiranje mora biti dobro zatvoren kako bi se spriječilo isparavanje tekućine za fiksiranje. Nakon fiksiranja acetonom, na pripravke se u radnom razrjeđenju nakapa nekoliko kapi konjugata (fluorescentni gama globulin protiv bjesnoće). Zatim se stave u vlažnu komoru (Petrijeva zdjelica ili zatvorena emajlirana kiveta s navlaženim dnom) 20 - 30 minuta na temperaturi od 25 °C.

Nakon toga se preparati isperu vodom ili otopinom fosfatnog pufera (pH 7,2 - 7,4) 1 sat, zatim isperu destiliranom vodom, osuše na zraku i podvrgnu istraživanju. Preparati se promatraju pod imerzijskim sustavom. Za uranjanje se koristi neluminiscentno ulje.

U obojenom preparatu, pod fluorescentnim mikroskopom, tkivo mozga fluorescira (sjaji) mutnom sivkasto-žutom bojom. Antigen virusa bjesnoće otkriva se u pripravcima u obliku svijetlo žućkasto-zelenih ili zelenih granula različitih oblika i veličina - od jedva primjetnih do promjera 15-20 mikrona.

U kontrolnom pripravku nisu uočena žuto-zelena intenzivno svjetlucava zrnca.

U istraživanju pomoću metode fluorescentnih protutijela, dijagnoza bjesnoće smatra se utvrđenom ako se u nekoliko vidnih polja mikroskopa pronađe dovoljan broj (najmanje 10) tipičnih granula sa svijetlim zelenkastim sjajem različitih veličina. U kontroli takvih formacija ne bi trebalo biti.

U nedostatku pozitivne fluorescencije, stavlja se biološki uzorak.

III. BIOLOŠKI UZORAK

11. Biološki test na bjesnoću postavlja se ako se mikroskopskim pregledom dobije negativan rezultat (ne otkrivaju se Babes-Negrijeva tjelešca), uz serološke reakcije (ne otkriva se specifični antigen bjesnoće), kao i kada se otkrivaju atipične inkluzije. Biološki test se provodi na bijelim miševima ili zečevima.

12. Pokusni miševi ili kunići zaraženi su 10%-tnom suspenzijom iz ispitivanog mozga u fiziološkoj otopini ili mesno-peptonskoj juhi s pH 7,2 - 7,4. Za pripremu suspenzije koriste se isti dijelovi mozga iz kojih je uzet materijal za mikroskopske i serološke studije.

Izrezani dijelovi mozga skupljaju se u sterilnu epruvetu i važu, a potom tučkom dobro usitne u tarioniku, nakon čega se doda fiziološka otopina ili mesno-peptonska juha da se dobije 10% suspenzija. Dobivena suspenzija ostavi se stajati 10 minuta i supernatant se koristi za infekciju.

Ako je patološki materijal kontaminiran, tada se supernatant izlije u drugu posudu (epruvetu) i doda mu se 500-1000 IU penicilina i streptomicina na 1 ml tekućine, nakon čega se ostavi stajati još 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim se koristi za infekciju. Suspenzija mora biti pripremljena u sterilnim uvjetima i uz strogo pridržavanje pravila osobne prevencije.

Biološki test na bijelim miševima. Za infekciju koriste se bijeli miševi težine 8-10 g. Za svaku studiju uzima se 6 miševa, od kojih su 3 zaražena u mozgu, a 3 - supkutano. Kada se inficira u mozgu, igla se uvodi u točku iza linije koja povezuje stražnje kutove i malo dalje od linije koja prolazi sredinom glave. Mjesto infekcije je obrisano alkoholom. Suspenzija se primjenjuje u dozi od 0,03 ml. Kako bi se spriječilo duboko prodiranje igle u mozak, na njen vrh se stavlja graničnik - mali komad gumene cijevi, koji je fiksiran na udaljenosti od 2-3 mm od kraja igle. Na potkožna infekcija suspenzija se ubrizgava u područje vrha nosa (gornja usna) u dozi od 0,05 ml. Na mjestu ubrizgavanja stvara se mala oteklina. Zaraženi miševi se stave u staklene posude i promatraju 30 dana. S pozitivnim rezultatom biološkog testa kod miševa, obično 7-15 dana nakon infekcije, razvija se klinika paralitičke bjesnoće.

U početku se primjećuje letargija, razbarušeni kaput i neka vrsta grbavosti, kao i poremećena koordinacija pokreta. Zatim dolazi do paralize stražnjih udova, a kasnije - prednjih, pretvarajući se u opću paralizu, koja završava smrću. Trajanje bolesti je 2-3 dana.

S razvojem opće paralize, miševi se žrtvuju eterskom ili kloroformskom anestezijom. Uginulim i ubijenim miševima otvara se lubanjska šupljina, mozak se inokulira na hranjive podloge, nakon čega se mozak uklanja iz kojeg se pripremaju preparati za mikroskopska i imunobiološka ispitivanja.

U nedostatku kliničkih manifestacija bjesnoće u zaraženih miševa, oni se uništavaju unutar 30 dana. Staklenke u kojima su držane temeljito se dezinficiraju.

Biološki test na kunićima. Za postavljanje biološkog uzorka uzimaju se 4 kunića težine najmanje 1,5 kg svaki. 2 kunića su zaražena u mozak i 2 intramuskularno u predjelu bedara. Suspenzija se primjenjuje intracerebralno u dozi od 0,2 ml, a intramuskularno u dozi od 2 ml.

Uz pozitivan rezultat biološke pretrage, kunići obolijevaju unutar 16 do 21 dana. Bolest bjesnoće javlja se kod kunića u tihom paralitičkom obliku sa smrtnim ishodom. Uginulim zečevima mozak se uklanja i daljnja istraživanja provode na isti način kao kod zaraze miševa. Kunići se promatraju 45-50 dana. Nakon navedenog roka, kunići se uništavaju. Kavezi u kojima su držane pokusne životinje se dezinficiraju.

IV. HISTOLOŠKI PREGLED 1

1 Kao dodatna metoda koristi se histološki pregled

Za histološku pretragu uzimaju se komadići Ammonovog roga, cerebralnog korteksa, cerebeluma, medule oblongate i fiksiraju u jednom ili dva obroka acetona tako da trajanje fiksacije bude unutar 6-18 sati.

Bolje je ostaviti fiksaciju u acetonu preko noći. Zatim se patološki materijal propusti kroz dva dijela ksilena, držeći svaki po 30 minuta, i kroz dva dijela parafina - svaki po 1 sat. Gotovi rezovi se deparafiniziraju uobičajenom metodom i boje prema Lenzu ili Turevichu:

Bojanje prema Lenzu. Sekcije se boje otopinom eozina 1-3 minute (0,5 g eozina se otopi u 100 ml 60% etilnog alkohola). Eozin se brzo ispere vodom i boji Lefleurovim metilenskim modrilom 1 min, ispere vodom, pažljivo osuši filtar papirom i diferencira otopinom jedinica. koga natrija u apsolutnom alkoholu (5 kapi kaustične sode na 30 ml alkohola) do blijedoružičaste boje. Na preparat se prelije otopina octene kiseline (1 kap ledene octene kiseline na 60 ml apsolutnog alkohola) i drži do pojave slabo plave boje, brzo se ispere alkoholom i bistri ksilolom 4-5 minuta. Tijela Babesh-Negrija obojena su svijetlo crveno s plavim inkluzijama, citoplazma ganglijskih stanica je blijedo plava;

Bojanje prema Turevichu. Deparafinizirani rezovi odmah nakon prolaska kroz alkohole i destiliranu vodu boje se Weigertovim ili Ehrlichovim hematoksilinom, isperu destiliranom vodom. Zatim se boji 1% vodenom otopinom kiselog fuksina 1 minutu i temeljito ispere destiliranom vodom dok se ne pojavi blijedoružičasta nijansa. Nakon pranja tretira se mješavinom (u jednakim dijelovima) zasićene vodene otopine pikrinske kiseline (25-30 g pikrinske kiseline na 1 litru vruće destilirane vode) i 96% alkohola. Tijekom obrade opaža se ispuštanje oblaka crvene boje, a rezovi nakon 10–20 s dobivaju žutu nijansu. Sekcije se brzo isperu u vodi i lagano osuše filtar papirom. Zatim se jednako brzo propušta kroz apsolutni ili 96° alkohol, karbol-ksilol, čisti ksilol i stavlja u melem. Tijela Babesh-Negrija su trešnja crvena, jezgre stanica su crne ili plave, ovisno o tome kojim hematoksilinom su obojene. Oblik i veličina tijela Babesh-Negrija vrlo su raznoliki, nalaze se u citoplazmi i procesima živčanih stanica u obliku brojnih ili pojedinačnih kopija. Češće se Babes-Negrijeva tijela nalaze u velikim ganglijskim stanicama, a stanice koje ih sadrže nemaju izražene znakove degeneracije.

Često se nalaze i druge inkluzije, koje se zbog niza sličnih značajki ponekad pogrešno smatra Negrijevim tjelešcima. Treba imati na umu da mozgovi zdravih mačaka i bijelih miševa ponekad sadrže nespecifična acidofilna inkluzijska tjelešca. Ta se tijela mogu razlikovati od Negrijevih tijela po odsutnosti unutarnjih granula i homogenosti glavne tvari.

Bjesnoću karakteriziraju i znakovi akutnog encefalomijelitisa: pretežno oko malih vena nalaze se perivaskularni infiltrati koji se uglavnom sastoje od limfoidnih stanica koje izgledaju poput staničnih mufova.

U ganglijskim stanicama mozga može doći do kromatolize, vakuolizacije i akutnog bubrenja stanica, kao i smrti pojedinih stanica. U području oštećenih živčanih stanica proliferativna reakcija glije je prilično konstantna, poprimajući oblik prave neuronofagije, praćena zamjenom živčanih stanica elementima umnožene glije. Takvo nakupljanje proliferiranih stanica na mjestu dezintegrirane živčane stanice naziva se „čvržica bjesnoće” - ponekad se proces razvoja kvržice može pratiti na rezu (1).