การวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้าอย่างรวดเร็ว

วิธีการตรวจหาแอนติเจน. ในกรณีของโรคพิษสุนัขบ้าสำหรับการวินิจฉัยด่วน สามารถใช้วิธีแอนติบอดีเรืองแสง (MFA), ปฏิกิริยาตกตะกอน (RP) ในเจลวุ้น, วิธีของเอนไซม์อิมมูโนแอสเซย์ (ELISA), ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) จำเป็นต้องมีการทดสอบหลายครั้งเพื่อวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้าในมนุษย์ในร่างกาย

การหาแอนติบอดีต่อแอนติเจนของไวรัสพิษสุนัขบ้า. การตรวจหาแอนติบอดีในเลือดหรือน้ำไขสันหลังเป็นวิธีการวินิจฉัยที่สำคัญ การทดสอบทางซีรัมวิทยาของแอนติบอดีจำเพาะโรคพิษสุนัขบ้าจะดำเนินการในซีรัมในเลือดเพื่อกำหนดการฉีดวัคซีนก่อนและหลังการสัมผัส และกำหนดระยะเวลาของการฉีดวัคซีนเสริมเพื่อเพิ่มการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน

การแยกไวรัส. สำหรับการแยกและระบุไวรัส ใช้วิธีการวิเคราะห์ทางชีวภาพในหนูขาว วัสดุทดสอบถูกระงับในสารละลายทางสรีรวิทยาที่มียาปฏิชีวนะและซีรัมของวัวในครรภ์ สารแขวนลอยจะถูกฉีดเข้าสมองให้กับหนูขาวที่มีน้ำหนัก 5-6 กรัม เพื่อพิสูจน์การพัฒนาของการติดเชื้อ จะสังเกตหนูทุกวันจนถึงวันที่ 30 หลังการฉีดวัคซีน หนูที่เป็นโรคในช่วงเวลานี้จะถูกทำการุณยฆาตทันทีและเนื้อเยื่อสมองจะถูกตรวจสอบโดย MFA โดยตรง

ข้อดีของวิธีนี้คือความสามารถในการตรวจหาไวรัสพิษสุนัขบ้าในปริมาณเล็กน้อยในวัสดุ ข้อเสียของวิธีนี้คือต้องใช้เวลาหลายวัน (7-18 วัน) ในการรอระหว่างการฉีดวัคซีนและการแสดงสัญญาณแรกของโรค เพื่อลดระยะฟักตัวจะใช้หนูดูดนม หนูที่อายุน้อยกว่า 3 วันสามารถใช้สำหรับการวินิจฉัยด่วน: ในหนูที่ถูกฆ่าหลังจาก 3 วัน แอนติเจนของไวรัสถูกตรวจพบในสมองแล้ว ซึ่ง MFA สามารถตรวจพบได้

วิธีการแยกไวรัสนี้เป็นวิธีการทดสอบวินิจฉัยยืนยันสำหรับผลลัพธ์เชิงลบสำหรับการตรวจหาแอนติเจนและร่างกาย Babes-Negri และในกรณีที่สัตว์ที่สงสัยว่าเป็นโรคพิษสุนัขบ้ากัด โดยให้ความไวและความจำเพาะที่เหมาะสม กล่าวคือ ถือว่ามีความสำคัญในการวินิจฉัยของวิธีอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์โดยตรง นอกจากนี้ วิธีนี้เป็นวิธีหลักในการระบุสายพันธุ์ของไวรัสและมีแนวโน้มว่าจะพัฒนารีเอเจนต์ในการวินิจฉัย

การแยกและการระบุไวรัสในการเพาะเลี้ยงเซลล์. ข้อเสียเปรียบหลักของการแยกไวรัสระหว่างการติดเชื้อของสัตว์ทดลองคือระยะเวลาของวิธีการ สิ่งนี้สามารถหลีกเลี่ยงได้โดยใช้การเพาะเลี้ยงเซลล์ โดยปกติ การเพาะเลี้ยงเซลล์นิวโรบลาสโตมาของหนูจะใช้เพื่อจุดประสงค์เหล่านี้ หากจำเป็นต้องตรวจเนื้อเยื่อสมอง สมองถูกระงับในอาหารเลี้ยงเชื้อ สารแขวนลอยถูกนำไปใช้กับ monolayer ของการเพาะเลี้ยงเซลล์และฟักเป็นเวลาหนึ่งถึงหลายวัน

ความไวของวัฒนธรรมที่กำหนดต่อไวรัสสามารถเพิ่มขึ้นได้โดยการรักษาด้วย DEAE dextran จากนั้นโมโนเลเยอร์ของเซลล์จะถูกล้าง ตรึงไว้ในที่เย็นด้วยอะซิโตนหรือส่วนผสมของฟอร์มาลินและเมทานอล และตรวจสอบโดยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ หากสัตว์นั้นติดเชื้อไวรัสพิษสุนัขบ้า การรวมไซโตพลาสซึมของแอนติเจนของไวรัสพิษสุนัขบ้าจะถูกตรวจพบในโมโนเลเยอร์ของการเพาะเลี้ยงเซลล์

แสดงให้เห็นว่าแอนติเจนของไวรัสพิษสุนัขบ้าสามารถตรวจพบได้ในเซลล์นิวโรบลาสโตมาของหนูเมาส์ Na C1 300 ร่วมกับ MFA หลังจาก 2 วัน ความไวของวิธีการนี้เทียบได้กับการแยกไวรัสในหนูทดลอง

แม้ว่าไวรัสโรคพิษสุนัขบ้าจะมีผลผูกพันต่อการเกิดโรคในระบบประสาทในร่างกาย แต่ก็สามารถแพร่เชื้อไปยังเซลล์เจ้าบ้านได้หลากหลายในหลอดทดลอง ซึ่งสามารถใช้ในการทดสอบเนื้อเยื่อและอวัยวะอื่นๆ เพื่อหาว่ามีไวรัสโรคพิษสุนัขบ้าหรือไม่ พบว่าไวรัสพิษสุนัขบ้าทวีคูณในเซลล์ BHK-21 และ Vero ในเซลล์ปฐมภูมิของตัวอ่อนไก่หรือไตหนูแฮมสเตอร์ แสดงให้เห็นว่าการดูดซับไวรัสและการนำไวรัสเข้าสู่เซลล์เกิดขึ้นภายใน 7 ชั่วโมง หลังจาก 24-48 ชั่วโมง อนุภาคไวรัสใหม่จะก่อตัวขึ้นภายในเซลล์ หลังจาก 72 ชั่วโมง พวกมันจะแตกหน่อจากเยื่อหุ้มเซลล์ไปยังช่องว่างระหว่างเซลล์

วิธีการวิจัย

สำหรับ ตรวจวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้าสามารถใช้ได้:

ก) วิธีการ IFA- เพื่อตรวจหาแอนติเจนของไวรัสพิษสุนัขบ้าในรอยประทับของกระจกตาหรือหลังคอของผู้ป่วยที่มีรูขุมขน
b) วิธีการ PCR- เพื่อตรวจหา RNA ของไวรัสในตัวอย่างเนื้อเยื่อเนื้อเยื่อ น้ำลาย น้ำไขสันหลังหรือน้ำตา
ค) วิธีการ ELISA- เพื่อตรวจหาแอนติบอดีจำเพาะ (แอนติเจน) ในผู้ป่วยที่มีอาการปกติหรือผิดปกติ
ง) วิธีการ การตรวจทางชีวภาพ- เพื่อแยกเชื้อไวรัสในระยะแรกของโรคหรือเพื่อตรวจหาแอนติบอดีในเลือดหรือน้ำไขสันหลังอักเสบในระยะหลังของโรค สำหรับการวินิจฉัยด่วนจะใช้วิธีการที่ซับซ้อน (bioassay + MFA) ซึ่งประกอบด้วยหนูแรกเกิดอายุ 2 วันติดเชื้อด้วยวัสดุทดสอบและตรวจสมองในวันที่ 3-4 ใน MFA

การเลือกวิธีการวินิจฉัย ในร่างกาย ส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับระยะของโรค: วิธีการตามการตรวจหาแอนติเจนตามกฎแล้วจะมีความไวสูงเมื่อสิ้นสุดระยะฟักตัวในช่วงสองสามวันแรกของโรค ในขณะที่แอนติบอดีต่อไวรัสมักจะปรากฏในน้ำไขสันหลังและเลือดในซีรัมหลังจาก 7-10 วันนับจากเริ่มมีอาการ

ปฏิกิริยาอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์. วิธีการนี้ขึ้นอยู่กับการใช้แอนติบอดีที่จับกับสีย้อม เช่น ฟลูออเรสซิน ไอโซไทโอไซยาเนต RIF ใช้กันอย่างแพร่หลายในการตรวจจับแอนติเจนของไวรัสในวัสดุของผู้ป่วยและเพื่อการวินิจฉัยที่รวดเร็ว

วิธีการนี้มีระดับความไวสูงสุดซึ่งเป็นพื้นฐานสำหรับการวินิจฉัยด่วนและช่วยให้สามารถตรวจหาแอนติเจนของไวรัสได้ภายในเวลาไม่กี่ชั่วโมง

ข้อได้เปรียบหลักของ MFA ได้แก่ ความเร็วในการดำเนินการ ความจำเพาะสูง (100%) เวลาที่ใช้ในการวินิจฉัยโรคด้วยความช่วยเหลือนั้นน้อยกว่าหนึ่งวัน ใช้ MFA ทั้งทางตรงและทางอ้อม

อิมมูโนฟลูออเรสเซนโดยตรงยังคงเป็นวิธีที่นิยมใช้ในการวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้า สไลด์ที่มีรอยเปื้อนของเนื้อเยื่อสมองหรือแว่นตาที่มีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อชั้นเดียวจะได้รับการแก้ไขในอะซิโตนเป็นเวลา 1-4 ชั่วโมง จากนั้น สารเตรียมจะถูกทำให้แห้งและบำบัดด้วยแอนติบอดีต้านนิวคลีโอแคปซิดเรืองแสง (รีเอเจนต์อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์)

รีเอเจนต์นี้คือคอนจูเกตที่เตรียมจากโพลีโคลนอลแอนติบอดีคลาส IgG จำเพาะกับแอนติเจนของนิวคลีโอแคปซิดของไวรัสและฟลูออเรสซิน ไอโซไซยาเนต (FITC) แอนติบอดีจำเพาะได้มาจากการสร้างภูมิต้านทานมากเกินไปของสัตว์ (กระต่าย หนูแฮมสเตอร์ หรือม้า) ที่มีส่วนผสมของไวรัสนิวคลีโอแคปซิดเอพิโทป

ในปัจจุบัน โมโนโคลนอลแอนติบอดีของหนูเมาส์กับนิวคลีโอแคปซิดของไวรัสพิษสุนัขบ้าถูกใช้มากขึ้นเพื่อจุดประสงค์เหล่านี้ หลังจากการฟักไข่ 30 นาทีที่ 37°C การเตรียมการวินิจฉัยจะถูกล้างซ้ำๆ ด้วยน้ำเกลือและน้ำกลั่น

แอนติบอดีที่ติดฉลากด้วย FITC ถูกตรึงที่บริเวณตำแหน่งของแอนติเจนของไวรัสนิวคลีโอโปรตีนเท่านั้น การเตรียมการนั้นจะถูกทำให้แห้งในอากาศ และตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงโดยใช้หลอดซีนอนและตัวกรองที่เหมาะสมเป็นแหล่งกำเนิดแสง

ที่ รุ่นทางอ้อมแอนติเจนจะถูกรวมเข้ากับซีรั่มภูมิคุ้มกันที่ไม่จำเพาะก่อน จากนั้น สารเชิงซ้อนของแอนติเจนและแอนติบอดีที่ไม่ใช่ฟลูออเรสเซนต์ที่ก่อตัวขึ้นจะได้รับซีรั่มภูมิคุ้มกันที่ติดฉลากฟลูออโรโครมซึ่งมีแอนติบอดีต่อโปรตีนในซีรัมจำเพาะ MFA เวอร์ชันทางอ้อมพร้อมกับการตรวจหาแอนติเจน ทำให้สามารถหาปริมาณแอนติบอดีในซีรัมทดสอบได้โดยการเจือจางอย่างเหมาะสม

การก่อตัวที่ติดฉลาก FITC ในเซลล์ของเนื้อเยื่อต่าง ๆ ถูกตรวจพบว่าเป็นการย้อมสีเรืองแสงสีเขียวอมเหลืองบนพื้นหลังสีเข้ม (ในรูปแบบของการรวม intracytoplasmic ทรงกลมหรือรูปไข่)

การทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยง. วิธีการนี้ขึ้นอยู่กับหลักการของการดูดซับโปรตีนในเฟสของแข็ง ตามด้วยการก่อตัวของสารเชิงซ้อนของแอนติเจน-แอนติบอดีที่ตรวจพบโดยสารละลายสารตั้งต้น-ตัวบ่งชี้ แอนติเจนที่เติมลงในบ่อน้ำจับกับแอนติบอดีโดยเฉพาะ ซีรั่มทดสอบถูกนำไปใช้กับชั้นแอนติเจนในการเจือจางที่ต้องการ เมื่อมีแอนติบอดีจำเพาะในตัวพวกมัน แอนติเจนจะจับกับแอนติเจน ในการตรวจจับการผูกมัด อิมมูโนโกลบูลินกับโกลบูลินในซีรัมของมนุษย์ที่คอนจูเกตด้วยเปอร์ออกซิเดสจากพืชชนิดหนึ่งจะถูกนำไปใช้กับชั้นแอนติบอดี ปริมาณของคอนจูเกตการดูดซับเป็นสัดส่วนกับปริมาณซีรั่มของมนุษย์ที่จับกับแอนติเจน สิ่งนี้สามารถกำหนดได้โดยใช้สารละลายตัวบ่งชี้ (orthophenylylenediamine + ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์) ซึ่งเป็นส่วนประกอบซึ่งเป็นผลมาจากการกระทำของคอนจูเกตเปอร์ออกซิเดสทำให้ของเหลวเป็นสีน้ำตาลเหลือง เมื่อตรวจสอบกรณีที่ไม่ชัดเจน การใช้ ELISA นอกเหนือจากวิธี RP หรือ RSK ช่วยเพิ่มความน่าเชื่อถือในการวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการของโรคพิษสุนัขบ้า เนื่องจากวิธีนี้มีความไวสูง วิธีนี้ช่วยให้สามารถตรวจจับอนุภาคที่ติดเชื้อและมีข้อบกพร่องได้

ในการตรวจสอบแอนติบอดีต้านโรคพิษสุนัขบ้าระหว่างการฉีดวัคซีน สามารถใช้วิธี ELISA ทางอ้อมได้ โดยใช้ไวรัสบริสุทธิ์เป็นแอนติเจน และตรวจหาแอนติบอดีคลาส IgG ในซีรัมของมนุษย์ Staphylococcus A-protein ที่สัมพันธ์กับฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดส ผลลัพธ์ของ ELISA เปรียบได้กับผลลัพธ์ที่ได้จากการทดสอบการทำให้เป็นกลางของไวรัสในหนูทดลอง วิธีการนี้ช่วยในการตรวจหา IgM ที่จุดเริ่มต้นของกระบวนการสร้างภูมิคุ้มกัน

วิธีอิมมูโนเอ็นไซม์มีแนวโน้มที่ดีในการตรวจหาแอนติเจนของนิวคลีโอแคปซิดของไวรัสในระหว่างการวินิจฉัยชันสูตรพลิกศพในเนื้อเยื่อสมอง ตัวอย่างเช่น ใช้วิธี ELISA อย่างรวดเร็วในการวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้า โดยพิจารณาจากการเตรียมเพลตที่ไวแสงด้วยแอนติบอดีของไอโซไทป์ IgG ต่อนิวคลีโอแคปซิดของซีโรไทป์แรกที่เจือจางในบัฟเฟอร์คาร์บอเนต

วัสดุทดสอบถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในบัฟเฟอร์หรืออาหารเลี้ยงเชื้อ การทำให้กระจ่างโดยการหมุนเหวี่ยง เติมลงในหลุมและบ่มในจาน แอนติเจนของนิวคลีโอแคปซิดที่ถูกตรึงด้วยแอนติบอดีจำเพาะจะถูกระบุโดยการเพิ่มคอนจูเกตเปอร์ออกซิเดสด้วยแอนติบอดีต้านโรคพิษสุนัขบ้าแอนตินิวคลีโอแคปซิดของความจำเพาะของสปีชีส์ที่แตกต่างกันและสารตั้งต้นของโครโมโซม ความไวของวิธีการคือ 0.8–1.0 ng / ml

วิธีนี้สามารถตรวจหาแอนติเจนของไวรัสในซีโรไทป์ต่างๆ การใช้คอนจูเกตของแอนติบอดีจำเพาะ nucleocapsid ที่ติดฉลากด้วยไบโอตินจะเพิ่มความไวของวิธีการเป็น 0.1–0.2 ng/ml

ELISA ตรวจพบแอนติเจนของ nucleocapsid ได้สำเร็จ แต่วัสดุแม้จะสลายตัวแล้วไม่ควรได้รับการแก้ไขด้วยฟอร์มาลิน

วิธีปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส. สำหรับการวินิจฉัยไวรัสพิษสุนัขบ้าอย่างรวดเร็วและการระบุ lyssaviruses วิธีที่สะดวกที่สุดคือปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) วิธี PCR เป็นวิธีที่น่าเชื่อถือและเร็วที่สุดในการแยก virion RNA ออกจากตัวอย่างใดๆ ที่มีไวรัสที่ความเข้มข้นต่ำ ด้วยสิ่งนี้ คุณสามารถสร้างสำเนาของไวรัส RNA ได้มากมาย วิธีนี้ใช้เพื่อยืนยันผล MFA และตรวจหาไวรัสในน้ำลาย รูขุมขนหลังคอและศีรษะ

PCR ขึ้นอยู่กับหลักการของการจำลองดีเอ็นเอตามธรรมชาติ สาระสำคัญของวิธีการคือ ทำซ้ำๆวัฏจักรของการสังเคราะห์ (การขยาย) ของลำดับ DNA ที่จำเพาะต่อไวรัสโดยใช้ Taq DNA polymerase ที่ทนความร้อนได้และไพรเมอร์จำเพาะสองตัว ที่เรียกว่าไพรเมอร์

แต่ละรอบประกอบด้วยสามขั้นตอนที่มีสภาวะอุณหภูมิต่างกัน ในแต่ละรอบ จำนวนสำเนาของภูมิภาคที่สังเคราะห์ขึ้นเป็นสองเท่า ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่นี้ทำหน้าที่เป็นแม่แบบสำหรับการสังเคราะห์เส้นใยใหม่ในรอบการขยายถัดไป ซึ่งทำให้สามารถสะสมสำเนาของขอบเขต DNA ที่เลือกในจำนวนที่เพียงพอในรอบ 25–35 รอบสำหรับการพิจารณา โดยปกติแล้วจะใช้เจลอะกาโรส อิเล็กโตรโฟรีซิส

PCR มีความไวสูงโดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อใช้ไพรเมอร์ร่วมกับยีน N เมื่อสามารถตรวจหา RNA ของไวรัสในตัวอย่างที่มีไวรัสในระดับ 10 MLD50 วิธี PCR สามารถตรวจจับไวรัส RNA ได้แม้ในวัสดุทางพยาธิวิทยาที่ย่อยสลาย

ในปัจจุบัน การทดสอบยืนยัน (ยืนยัน) เช่น reverse transcriptase PCR (RT-PCR) ได้รับการพัฒนาและใช้กันอย่างแพร่หลายในทางปฏิบัติ วิธี RT-PCR มีความไวสูงและมีประสิทธิภาพสูงสุด RNA ถูกสกัดจากเนื้อเยื่อของอวัยวะที่ติดไวรัส ถ่ายทอดเป็น cDNA ซึ่งจะถูกขยายโดย PCR RT-PCR ต้องการไพรเมอร์ที่ได้รับสำหรับพื้นที่อนุรักษ์ของจีโนมไวรัสพิษสุนัขบ้า โดยปกติ ยีนที่เข้ารหัสนิวคลีโอโปรตีนหรือโปรตีน N จะถูกใช้

วิธี PCR มีความเฉพาะเจาะจงและละเอียดอ่อนมาก เป็นหนึ่งในที่สุด การทดสอบที่แม่นยำการตรวจหาแอนติเจนจากโรคพิษสุนัขบ้าทำให้สามารถวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้าได้แม้ว่าจะมี virion อย่างน้อยหนึ่งตัวในวัสดุก็ตาม การทดสอบนี้อาศัยความสมบูรณ์ของเทมเพลต RNA ที่สมบูรณ์ ซึ่งดำเนินการในหลอดทดลองโดยใช้เอนไซม์ RNA polymerase ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา PCR มีการใช้มากขึ้นในการวินิจฉัยและตรวจสอบการติดเชื้อไวรัส อย่างไรก็ตาม เทคนิคนี้ซับซ้อน มีราคาแพง และยังไม่เพียงพอต่อการใช้งานตามปกติ

วิธีการทางเซลล์วิทยาในปัจจุบันมีจำกัด ค่าการวินิจฉัยแต่ยังคงควรใช้สำหรับการติดเชื้อจำนวนมาก มีการตรวจสอบวัสดุการชันสูตรพลิกศพ การตรวจชิ้นเนื้อ รอยเปื้อน ซึ่งหลังจากผ่านกระบวนการที่เหมาะสมแล้ว จะมีการย้อมสีและวิเคราะห์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ในโรคพิษสุนัขบ้า เป็นการตรวจหาสิ่งเจือปนในไซโตพลาสซึมของเซลล์ (ร่างกาย Babes-Negri)

การแยกไวรัส. อาจจำเป็นต้องแยกไวรัสเพื่อยืนยันผลการทดสอบแอนติเจนและเพื่อระบุลักษณะเฉพาะเพิ่มเติม และถึงแม้ว่าวิธีนี้จะเป็นวิธีการวินิจฉัยที่เก่าแก่และใช้เวลานานที่สุดวิธีหนึ่ง แต่ในปัจจุบันการแยกไวรัสด้วยการระบุภายหลังโดยใช้วิธีการที่ทันสมัยวิธีใดวิธีหนึ่ง (ELISA ที่มีโมโนโคลนอลแอนติบอดีหรือ PCR) เป็นวิธีการวินิจฉัยที่น่าเชื่อถือที่สุด วิธีที่เรียกว่า "มาตรฐานทองคำ".

ประสิทธิผลของวิธีการวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้าอาจแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับปัจจัยหลายประการ (ระยะของโรค ระยะเวลาในการสุ่มตัวอย่างวัสดุ คุณภาพของตัวอย่างที่ได้รับ สภาพการเก็บรักษา ประสบการณ์ของพนักงาน คุณภาพของน้ำยา ฯลฯ) หากผลบวกยืนยันโรคพิษสุนัขบ้า ผลลบไม่ได้บ่งชี้ว่าไม่มีโรคเสมอไป ดังนั้น สำหรับโรคพิษสุนัขบ้า ผู้เชี่ยวชาญของ WHO แนะนำให้ใช้การทดสอบหลายอย่าง โดยเฉพาะอย่างยิ่ง MFA ร่วมกับการตรวจทางชีวภาพในหนูขาวแรกเกิด (อายุ 2-3 วัน)

มาตรการป้องกันส่วนบุคคล

งานทั้งหมดกับวัสดุที่สงสัยว่ามีไวรัสพิษสุนัขบ้า เช่นเดียวกับสัตว์ที่สงสัยว่าเป็นโรคพิษสุนัขบ้า จะต้องดำเนินการตามมาตรการความปลอดภัยส่วนบุคคล เจ้าหน้าที่การแพทย์และสัตวแพทย์ต้องสวมชุดคลุม ถุงมือ หน้ากาก

เมื่อสิ้นสุดการทำงาน กล่องจะได้รับการบำบัดด้วยสารละลายไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 3%

ขวดยา หลอดและเครื่องมือ ตลอดจนวัสดุที่เหลือที่มีไวรัสพิษสุนัขบ้า และเครื่องใช้หลังเลิกงานทั้งหมดจะถูกฆ่าเชื้อโดยการนึ่งฆ่าเชื้อด้วยไอน้ำเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 1.5 atm (โหมดฆ่า)

กองทุน การคุ้มครองส่วนบุคคลฆ่าเชื้อโดยการต้มหรือนึ่งฆ่าเชื้อ พื้นผิวการทำงานของโต๊ะและมือถูกฆ่าเชื้อด้วยน้ำยาฆ่าเชื้อ (สารละลายคลอรามีน 0.5%)

โรคพิษสุนัขบ้า (R) เป็นโรคเฉียบพลันของสัตว์เลือดอุ่น โดดเด่นด้วยความเสียหายต่อระบบประสาทส่วนกลาง สัตว์ในประเทศและสัตว์ป่าทุกชนิดรวมทั้งมนุษย์มีความอ่อนไหว

โรคนี้มีการลงทะเบียนในภูมิภาคต่างๆของโลก ไม่มีกรณีของการแพร่กระจายของโรคในออสเตรเลีย บริเตนใหญ่ ญี่ปุ่น โรคนี้มักจบลงด้วยความตาย มีการบันทึกกรณีการฟื้นตัวจากโรคพิษสุนัขบ้าในคนและสุนัขหลังการทดลองติดเชื้อ

ไวรัสโรคพิษสุนัขบ้า (ไวรัสโรคพิษสุนัขบ้า) เป็นของครอบครัว Rhabdoviridae สกุล Lyssavirus ตอนนี้ได้มีการพิสูจน์แล้วว่า VB มี 4 ซีโรไทป์ ซึ่งเห็นได้ชัดเนื่องจากความแตกต่างในองค์ประกอบของโปรตีนเมมเบรน VB ทุกสายพันธุ์มีความเกี่ยวข้องทางภูมิคุ้มกัน แต่มีความรุนแรงต่างกัน WB มีคุณสมบัติ GA และ GAD มีความสัมพันธ์เชิงเส้นตรงระหว่างกิจกรรมการติดเชื้อและ GA สัตว์ที่สร้างภูมิคุ้มกันโรคพิษสุนัขบ้าจะผลิตแอนติบอดี VNA, KSA, antiHA และ lytic (ทำลายเซลล์ที่ติดเชื้อไวรัสต่อหน้าส่วนประกอบ)

การวินิจฉัยจะทำบนพื้นฐานของข้อมูลทางระบาดวิทยา อาการของโรค การเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยา (มีความสำคัญน้อยกว่า) และผลการทดสอบในห้องปฏิบัติการเป็นหลัก

การวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการ ประกอบด้วยการศึกษาสมองของสัตว์เพื่อตรวจหาไวรัสเอจีใน IF, RDP, การตรวจหาร่างกายของ Babes-Negri และการทดสอบทางชีวภาพในหนูขาว

ที่ สหพันธรัฐรัสเซียปัจจุบันมีการจัดการผลิตชุดอุปกรณ์สำหรับการวินิจฉัย B ใน IF และ RDP ที่ VNITIBP และ KazNIVI

การแยกตัวของไวรัสศพสดของสัตว์เล็กถูกส่งไปยังห้องปฏิบัติการเพื่อทำการวิจัยตั้งแต่สัตว์ใหญ่ - ศีรษะหรือสมอง ในบางกรณี อนุญาตให้ใช้สมองกระป๋องในกลีเซอรีน 50% ศพหรือหัวจะต้องบรรจุอย่างระมัดระวังในถุงพลาสติกสมอง - ในขวดที่มีแก้วพื้นหรือจุกยางที่บรรจุด้วยพาราฟิน วัสดุถูกบรรจุในภาชนะกันความชื้น เฉพาะสมองที่ไม่ได้รับการรักษาเท่านั้นที่เหมาะสำหรับการศึกษาทางไวรัสวิทยา ต้องจำไว้ว่าการชันสูตรพลิกศพการสกัดสมองและการดำเนินการอื่น ๆ ด้วยวัสดุทางพยาธิวิทยาควรดำเนินการภายใต้สภาวะปลอดเชื้อและการปฏิบัติตามมาตรการป้องกันส่วนบุคคลอย่างเข้มงวด: ยึดหัวสัตว์อย่างแน่นหนาปกป้องมือด้วยถุงมือ 2 คู่ ( ศัลยกรรมและกายวิภาค) สวมแว่นตาเพื่อปกป้องดวงตา และบนจมูกและปาก - ผ้าพันแผลผ้ากอซ 6 ชั้น

การวิจัยในห้องปฏิบัติการวัสดุโรคพิษสุนัขบ้าเกิดขึ้นทันที โดยจะรายงานผลให้หมอฟาร์มและนายแพทย์อำเภอ (เมือง) ทราบทันที

การระบุและการระบุไวรัส. ลำดับของการวิจัย: จากแต่ละส่วนของสมองด้านซ้ายและด้านขวา (เขาของ Ammon, cerebellum, cerebral cortex และ oblongata), 4 smear-imprints ที่เตรียมไว้สำหรับ IF และการตรวจจับร่างกาย Babesh-Negri ด้วยเนื้อเยื่อสมองใส่ RDP; ด้วยผลลัพธ์ที่เป็นลบ จะทำการวิเคราะห์ทางชีวภาพ

การตรวจจับวัตถุเจือปนเฉพาะ. รอยเปื้อนรอยเปื้อนตามผู้ขาย, Muromtsev หรือวิธีอื่นๆ หลังจากการย้อมสี การเตรียมการจะถูกดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงพร้อมระบบจุ่ม การปรากฏตัวของร่างกาย Babesh-Negri ที่เฉพาะเจาะจงถือเป็นผลบวก (เมื่อย้อมตามผู้ขาย - กำหนดรูปวงรีหรือรูปสี่เหลี่ยมผืนผ้าเม็ดละเอียดอย่างชัดเจนของสีชมพู - แดงในโปรโตพลาสซึมเมื่อย้อมตาม Muromtsev - สีม่วงอ่อนพร้อมการรวมสีน้ำเงินเข้มของ Babesh -ร่างกายของเนกรีมักอยู่นอกเซลล์ประสาท

ลักษณะเด่นที่สุดของร่างกายของ Babesh - Negri คือโครงสร้างภายในซึ่งช่วยให้แยกแยะได้อย่างแม่นยำ มองเห็นเมล็ดพืชขนาดเล็กภายใน - เม็ดหินบะซอลต์สีน้ำเงินเข้ม แม้กระทั่งสีดำ ขนาด 0.2-0.5 ไมครอน

โดยทั่วไปแล้วค่าการวินิจฉัยของการตรวจหาวัตถุรวมสำหรับหลักฐานการติดเชื้อ WB นั้นเป็นที่ยอมรับกันโดยทั่วไป อย่างไรก็ตาม ในสัตว์ที่มีสุขภาพดี โดยเฉพาะอย่างยิ่งในแมวและหนูขาว มีการก่อตัว ซึ่งอาจทำให้เกิดปัญหาในการวินิจฉัยได้ ในบางกรณี ในสมองของแมว มีความเป็นไปได้ที่จะแยกความแตกต่างจากร่างกายของ Babes-Negri ได้อย่างมั่นใจ และแนะนำให้ใช้วิธีการระบุตัวตนโดยเฉพาะ IF ในทำนองเดียวกันในสุนัขที่เสียชีวิตจากพิษงูหรือความเสียหาย ไฟฟ้าช็อตเราสามารถพบวัตถุเจือปนที่คล้ายกับร่างของเบบส์-เนกรี ร่างกายของ Babesh-Negri ตรวจพบได้เฉพาะใน 65-85% ของผู้ป่วยโรคพิษสุนัขบ้า ดังนั้นจึงไม่ใช่คำตอบเชิงลบ และวัสดุจะถูกตรวจสอบในการทดสอบอื่นๆ (IF, RDP, bioassay)

ถ้า.หนึ่งในการทดสอบหลักในการวินิจฉัยโรค B. ด้วยประสิทธิภาพที่มีคุณภาพสูงทำให้ได้ความบังเอิญ 99-100% กับวิธีการวิเคราะห์ทางชีวภาพ โดยปกติในการวินิจฉัยโรคจะใช้วิธีการโดยตรงของ IF ซึ่งดำเนินการโดยใช้ Ig เรืองแสงป้องกันโรคพิษสุนัขบ้า การตรึงของเตรียมในอะซิโตนแช่เย็น (8-10 องศาเซลเซียส) จะดำเนินการอย่างน้อย 4 ชั่วโมง รอยเปื้อนของสมองของหนูขาวที่มีสุขภาพดีถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ ผลลัพธ์จะถูกนำมาพิจารณาด้วยสายตาในกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงโดยพิจารณาจากการประเมินความเข้มของการเรืองแสงของสารเชิงซ้อน AG-AT ตรวจพบ AH VB เป็นเม็ดสีเหลืองสีเขียวหรือสีเขียวสดใส รูปทรงต่างๆและค่าในเซลล์ (บ่อยกว่าเซลล์ภายนอก) การวินิจฉัยจะถือว่าเป็นที่ยอมรับหากพบเม็ดทั่วไปจำนวนเพียงพอ (อย่างน้อย 10) ที่มีแสงสีเขียวสดใสหรือมีจุดเล็ก ๆ จำนวนมากในหลาย ๆ ด้าน ในการควบคุมไม่ควรมีแสงดังกล่าว

เพื่อพิสูจน์ความจำเพาะของการเรืองแสงของสารเชิงซ้อน AG-AT จะใช้วิธีการปราบปราม IF ซึ่งประกอบด้วยความสามารถของโรคพิษสุนัขบ้า AG ที่เกี่ยวข้องกับ AT ที่ไม่ใช่ฟลูออเรสเซนต์ที่จะไม่รวมกันอีกครั้งกับ AT จำเพาะเรืองแสง ในการทำเช่นนี้ Ig ที่ต้านโรคพิษสุนัขบ้า 5% ถูกนำไปใช้กับการเตรียมแบบตายตัวซึ่งเตรียมจากสมองที่กำลังศึกษา ฟักเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 37°C ในห้องที่มีความชื้น ล้างด้วยน้ำเกลือ แล้วย้อมด้วยสารต้านโรคพิษสุนัขบ้าเรืองแสง Ig โดยวิธีการตรงแบบธรรมดา ไม่ควรมีการเรืองแสงในการเตรียมการด้วยวิธีนี้

วิธี IF ทำให้สามารถตรวจจับ WB ในเซลล์ของกระจกตาและทำการวินิจฉัยเบื้องต้น ในร่างกาย: ในระหว่างการเจ็บป่วยของสัตว์เช่นเดียวกับ 1-2 วันก่อนอาการทางคลินิก วิธีนี้สามารถใช้ในการศึกษาสัตว์ที่สงสัยว่าเป็นโรคบี รวมทั้งสุนัขและแมวที่มีสุขภาพแข็งแรงดีที่กัดคนและสัตว์ ในการทำเช่นนี้มีการเตรียมรอยประทับจากกระจกตาโดยปฏิบัติตามกฎความปลอดภัยส่วนบุคคลทั้งหมดโดยเปิดรอยแยก palpebral ของสัตว์ที่มีขนาดใหญ่และ นิ้วชี้และกดลูกตาที่ยื่นออกมาเล็กน้อยกับพื้นผิวของสไลด์แก้วโดยถอยห่างจากปลาย 0.5 ซม. มันเป็นสิ่งจำเป็นเพื่อให้แน่ใจว่าสัตว์จะไม่กระพริบตาด้วยเปลือกตาที่สามเนื่องจากเซลล์เยื่อบุผิวจะถูกลบออกจากแก้วและได้สเมียร์คุณภาพต่ำ ตาแต่ละข้างเตรียมการจัดเตรียมอย่างน้อย 2 ชิ้นที่มี 2 ภาพพิมพ์ สำหรับการควบคุมการพิมพ์กระจกตาจากสัตว์ที่มีสุขภาพดีนั้นเตรียมในลักษณะเดียวกัน พวกเขาสามารถปรุงในฟาร์ม ภาพพิมพ์จะถูกทำให้แห้งด้วยอากาศ ตรึงในอะซิโตนเป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4°C บรรจุและส่งไปยังห้องปฏิบัติการ การเตรียมคราบเช่นเดียวกับใน IF ตามวิธีการที่ยอมรับโดยทั่วไป

ในการเตรียมที่ได้รับจากสัตว์ป่วยหรือเมื่อสิ้นสุดระยะฟักตัวของโรคในไซโตพลาสซึมของเซลล์เยื่อบุผิวจำนวนมาก รูปทรงต่างๆเม็ดเล็กๆ ส่องสว่างขนาดต่างๆ - ตั้งแต่จุดคล้ายฝุ่นจนถึง 2 ไมครอน และอื่นๆ เพื่อให้ได้มา ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้ในการเตรียมการแต่ละครั้งจะทำการตรวจสอบเซลล์ 50-100 เซลล์และรวมอย่างน้อย 200-400 เซลล์จากสัตว์ ผลลัพธ์ของกล้องจุลทรรศน์ถือเป็นบวกหากพบเซลล์ 11% ขึ้นไปที่มีลักษณะเฉพาะของการเรืองแสงในรอยประทับของกระจกตาของสัตว์ โปรดทราบว่าในการเตรียมอาหารจากสัตว์ที่มีสุขภาพดี (กลุ่มควบคุม) เนื่องจากการเรืองแสงอัตโนมัติ อาจมีเซลล์เดี่ยวที่มีจุดโฟกัสคล้ายคลึงกันในรูปร่างและการเรืองแสง

สิ่งสำคัญคือต้องสังเกตว่า IF ทำให้สามารถเร่งการตอบสนองต่อการวินิจฉัยขั้นสุดท้ายด้วยการตรวจทางชีวภาพ เนื่องจากการวินิจฉัยโรค B สามารถเกิดขึ้นได้เฉพาะในวันที่ 4-8 หลังจากการติดเชื้อของหนูด้วยวัสดุทดสอบ และ ระยะฟักตัวโรคของหนูสามารถถึง 20 วัน IF สามารถตรวจพบ WB ในเนื้อเยื่อของต่อมน้ำลายใต้ผิวหนัง รอยเปื้อนจัดทำขึ้นจากต่อมน้ำลายใต้ผิวหนังโดยใช้วัสดุจากต่อมน้ำอย่างน้อย 6 ส่วนเนื่องจากการแพร่กระจายของไวรัสในนั้นไม่สม่ำเสมอ บ่อยครั้งเพื่อให้ได้รอยประทับ คุณต้องออกแรงกด เพราะเนื่องจากมีเมือกอยู่มาก วัสดุเหลืออยู่เพียงเล็กน้อยบนกระจก

แสดงความเป็นไปได้ในการระบุ VB ในผิวหนังโดยวิธี IF เพื่อจุดประสงค์นี้ จะมีการเก็บตัวอย่างหนังศีรษะ รวมทั้งรูขุมขนที่รับความรู้สึกและสัมผัสของปากกระบอกปืนหรือปุ่มประสาทสัมผัสด้านข้าง (บนแก้มของสุนัข) ตัวอย่างจะถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 หรือ -70 องศาเซลเซียส Cryosections ทำจากพวกมันซึ่งรับการรักษาด้วยโกลบูลินเรืองแสง ผลของการวิเคราะห์ IF ที่ได้จากการระบุ VB ในผิวหนังมีความสัมพันธ์ในระดับสูงกับข้อมูลที่ได้จากการศึกษาสมองของสัตว์ชนิดเดียวกัน มีการแสดงความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดระหว่างการตรวจหาไวรัส AH ในตัวอย่างสมองและเนื้อเยื่อริมฝีปากโดยวิธี IF

รพ.ใช้เพื่อตรวจหา AH VB ในสมองที่ไม่ได้รับการรักษาของสัตว์ที่เสียชีวิตจากโรคพิษสุนัขบ้าข้างถนน หรือหนูที่ใช้ในการทดสอบทางชีวภาพ RDP ถูกวางโดยไมโครเมธอดบนสไลด์แก้วโดยใช้เจลวุ้น 1-1.5% ตามวิธีที่ยอมรับโดยทั่วไป ตรวจพบเปอร์เซ็นต์สูงสุดของผลบวกเมื่อใช้ลายฉลุต่อไปนี้: A - แอมมอนฮอร์น ( ด้านขวา); B - เปลือกสมอง (ด้านขวา); C - cerebellum (ด้านขวา);
D - ไขกระดูก oblongata (ด้านขวา); + (บวก) - การควบคุมในเชิงบวก; - (ลบ) - การควบคุมเชิงลบ; 1, 2, 3, 4 - หลุมที่มีการเจือจางของอิมมูโนโกลบูลินจำเพาะ 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 ตามลำดับ

ใช้แหนบเตรียมมวลเหมือนแป้งที่เป็นเนื้อเดียวกันจากแต่ละส่วนของสมองซึ่งวางอยู่ในหลุมที่สอดคล้องกัน จากหนูทดสอบสมองทั้งหมด จากบริเวณสมองด้านซ้าย AG ถูกเตรียมในลักษณะเดียวกัน (สำหรับการตรวจแต่ละครั้ง ต้องใช้สไลด์แก้วทั้งหมด 4 แผ่นพร้อมเจลวุ้น) ปฏิกิริยาจะถูกนำมาพิจารณาหลังจาก 6, 24, 48 ชั่วโมง หากมีเส้นหยาดน้ำฟ้า 1 หรือ 2-3 เส้นระหว่างหลุมที่มี AG และอิมมูโนโกลบูลิน ปฏิกิริยาจะถือเป็นบวก

RDP นั้นใช้งานง่ายและเฉพาะเจาะจง แต่เปอร์เซ็นต์ของการตรวจพบไวรัส AG ในวัสดุทดสอบคือ 45-70 ในการศึกษาสมองของหนูที่ได้รับจากการตรวจทางชีวภาพในเชิงบวก RDP เปิดเผยกรณีมากถึง 100% การไม่มีร่างกายของ Babesh-Negri การเรืองแสงจำเพาะและ RDP เชิงลบในวัสดุทดสอบไม่ได้ให้เหตุผลในการยกเว้นการปรากฏตัวของไวรัส ในกรณีนี้ การวินิจฉัยขั้นสุดท้ายจะขึ้นอยู่กับผลการตรวจทางชีวภาพในหนูขาว ตามด้วยการระบุไวรัส

การตรวจทางชีวภาพเป็นที่ยอมรับกันโดยทั่วไปว่าการตรวจทางชีวภาพมีมากกว่า วิธีที่มีประสิทธิภาพกว่าการตรวจจับร่างกายของ Babesh - Negri, IF, ฯลฯ อย่างไรก็ตามในบางกรณีมันก็กลายเป็นลบแม้จะได้รับการยืนยันการวินิจฉัยของ B โดยการตรวจจับการรวมตัวและ IF เปอร์เซ็นต์ของผลการตรวจทางชีวภาพเชิงลบอยู่ในช่วง 1.3 ถึง 12

ข้อมูลเกี่ยวกับประสิทธิภาพที่แตกต่างกันของการวิเคราะห์ทางชีวภาพสามารถอธิบายได้จากปัจจัยหลายประการ: การเลือกสัตว์ทดลอง จำนวนในการทดลอง วิธีการติดเชื้อ วิธีและระยะเวลาในการจัดเก็บวัสดุก่อนเข้าห้องปฏิบัติการ ปรากฏการณ์ของการแทรกแซงของอนุภาคติดเชื้อที่มีอนุภาคที่ไม่ใช้งานอาจมีบทบาทเช่นกัน หากใช้วัสดุที่เจือจางไม่เพียงพอสำหรับการฉีดวัคซีน

ในสมองและ ต่อมน้ำลายสุนัขจิ้งจอกและสกั๊งค์ที่เสียชีวิตจากโรคพิษสุนัขบ้า พบว่ามีสารยับยั้งการติดเชื้อไวรัสซึ่งไม่อนุญาตให้วินิจฉัยโรคในสัตว์เหล่านี้โดยการติดเชื้อในสมองของหนู การมีสารยับยั้งในวัสดุทดสอบไม่ได้ป้องกันการตรวจหา viral AG โดยวิธี IF สำหรับสกั๊งค์และสุนัขจิ้งจอก นี่เป็นวิธีการวินิจฉัยที่ละเอียดอ่อนที่สุด

ในบรรดาสัตว์ทุกชนิด (กระต่าย หนูตะเภา หนูขาวที่โตเต็มวัย และหนูแฮมสเตอร์) ที่ใช้สำหรับการตรวจทางชีวภาพ หลายคนชอบหนูที่ดูดนมเพราะพวกมันไวต่อ VB หลายสายพันธ์มากกว่าและอันตรายน้อยกว่าที่จะใช้งานด้วย แฮมสเตอร์ซีเรียไม่ได้ด้อยกว่าหนูที่อ่อนไหว แต่เข้าถึงได้น้อยกว่า

อาร์เอสเคการตรวจหา AH จำเพาะใน RSK ในการวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้านั้นใช้น้อยกว่าวิธีอื่น AG จัดทำขึ้นจากสมองที่ส่งไปวิจัย เมื่อต้องการทำเช่นนี้ เนื้อเยื่อสมอง (โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่อุดมไปด้วย AG, การผูกมัด, ชิ้นส่วนของฐานดอกและก้านสมอง) จะถูกตัดแต่งในบัฟเฟอร์ veronal ในอัตราส่วน 1:10 และทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากนั้นให้ระงับ ปิดใช้งานที่อุณหภูมิ 56°C เป็นเวลา 5 ชั่วโมง การรักษาดังกล่าวจะฆ่าเชื้อไวรัสและขจัดการต่อต้านการเติมเต็มของเนื้อเยื่อสมองโดยไม่ทำลายแอนติเจนจำเพาะ สารแขวนลอยถูกหมุนเหวี่ยงเป็นเวลา 15 นาที ที่ 3500 นาที-1 จากส่วนลอยเหนือตะกอน ซึ่งเป็นวัสดุสำหรับการทดสอบการมีอยู่ของ AG โดยเตรียมการเจือจางที่เพิ่มขึ้น 2 เท่าจาก 1:2 เป็น 1:64 และใช้สำหรับการวิจัยใน CSC .

เอลิซ่า.ใน ELISA ตรวจพบการย้อมสีเฉพาะของ AG ในเซลล์สมองของสัตว์ที่เสียชีวิตจากโรคพิษสุนัขบ้าทั้งในที่ถ่ายสด ๆ เก็บไว้ในกลีเซอรอลและในตัวอย่างที่เก็บไว้โดยไม่มีกลีเซอรอลที่อุณหภูมิ 20 ° C เป็นเวลา 8-18 ชั่วโมง การทดสอบนี้เหมาะสำหรับ การวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้าในสัตว์เป็นประจำ เพื่อตรวจหา AG WB ในส่วนพาราฟินเนื้อเยื่อระหว่างการตรึงการเตรียมด้วยสารละลายฟอร์มาลิน 10% ที่มีค่า pH 5.3 และการบำบัดด้วยยาเตรียมที่ฝังอยู่ในพาราฟินด้วยเปปซิน

ELISA แตกต่างจาก RN ในหนูและในการเพาะเซลล์ ทำให้สามารถตรวจจับ AT ในสัตว์ได้ภายในเวลาไม่กี่ชั่วโมง ELISA มีแนวโน้มดีที่สุด วิธีห้องปฏิบัติการการตรวจจับ AT และการบ่งชี้ของไวรัสเอง วิธีด่วนในการวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้าคือเทคนิคการจับและวิธี IF เพื่อตรวจหา AH BB ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าวิธีการตรวจหา AH VB ในส่วนที่เป็นพาราฟินโดยวิธีเปอร์ออกซิเดส-แอนติเปอร์ออกซิเดสนั้นเหนือกว่าวิธี ELISA อย่างมีนัยสำคัญ ในปี 1987 ได้มีการสร้างชุด Rapid Enzyme Immunodiagnosis of Rabies (RREID) ขึ้น ซึ่งเหมาะสำหรับการศึกษาทางระบาดวิทยาและในห้องปฏิบัติการ

การระบุตัวแปรโดยใช้ MAT ด้วยความช่วยเหลือของ mAbs ถึง WB ไกลโคโปรตีน แวเรียนต์ AG ถูกเลือก ในบรรดาแวเรียนต์ที่มีการระบุแวเรียนต์ที่มีอุณหภูมิแบบฟีโนไทป์ (แบบมีไวรัส) เมื่อใช้ mAb 2 กลุ่ม พบว่าสายพันธุ์การเจือจางแตกต่างจากชิ้น สายพันธุ์ Fixe (Pasteur), CVS, Flury HEP, ERA และ "duck" สำหรับตัวกำหนด AH การศึกษา 7 สายพันธุ์ที่แยกได้จากผู้ป่วยกลุ่มบีที่ใช้ mAbs ทำให้สามารถระบุความแตกต่างบางประการระหว่างสายพันธุ์เหล่านี้กับสายพันธุ์วัคซีนที่สัมพันธ์กับปัจจัยกำหนด AH

เป็นที่ยอมรับกันโดยทั่วไปว่าความแตกต่างของ AT ระหว่างสายพันธุ์ธรรมชาติสามารถตรวจพบได้โดยใช้ mAbs กับนิวคลีโอแคปซิด AT N ซึ่งทำปฏิกิริยากับการรวมเซลล์ที่ติดไวรัสในไซโตพลาสซึม สารต้านไกลโคโปรตีน (G AG) ซึ่งทำปฏิกิริยากับเยื่อหุ้มเซลล์ที่ติดเชื้อ สลายเซลล์เหล่านี้ต่อหน้าส่วนประกอบและทำให้ไวรัสเป็นกลาง ในการเชื่อมต่อกับความแปรปรวน AH ที่เป็นไปได้ของพื้นผิวไกลโคโปรตีน WB จากพื้นที่ทางภูมิศาสตร์ที่แตกต่างกัน ไรโบนิวคลีโอโปรตีนที่มีลักษณะเฉพาะโดยการอนุรักษ์ของโครงสร้าง AG ถูกใช้เป็น AG ป้องกัน ดังนั้นไม่เพียง แต่โปรตีน G เท่านั้น แต่ยังมี RNP VB ที่มีฤทธิ์ป้องกัน

Serodiagnosis และการวินิจฉัยย้อนหลัง. วิธีการเหล่านี้ไม่เป็นเรื่องปกติสำหรับโรคพิษสุนัขบ้า เนื่องจากใช้เพื่อวัตถุประสงค์ในการทดสอบภูมิคุ้มกันหลังการฉีดวัคซีนเท่านั้น สำหรับการตรวจหาและการไทเทรตแอนติบอดีหลังการฉีดวัคซีน จะใช้ค่า pH ซึ่งกำหนดโดยวิธีการที่ยอมรับกันโดยทั่วไป WB คงที่ใช้เป็น AG RN บนเซลล์ BHK-21 มีความไวมากกว่า IF ทางอ้อมในการตรวจจับ AT ในกลุ่มสุนัขจิ้งจอกที่ได้รับการฉีดวัคซีน นอกจากนี้ยังมีการเสนอ RTGA และ ELISA

อาร์ทีจีเอยังไม่พบการประยุกต์ใช้อย่างกว้างขวางในการวินิจฉัยเนื่องจากมีสารยับยั้งที่ไม่เฉพาะเจาะจงในเลือดซีรั่ม ซึ่ง WB มีความไวสูง และที่สำคัญที่สุด GA AG ซึ่งไม่ได้รับการทำให้บริสุทธิ์เพียงพอ มีความไวต่ำ สำหรับการเตรียม HA AG WB ขอแนะนำให้ใช้ชิ้น มอสโกเติบโตในการเพาะเลี้ยงเซลล์ VNK-21 หลังการรักษาด้วยซาโปนิน ตามด้วยการทำให้บริสุทธิ์และความเข้มข้น HA ถูกแยกออกจากส่วนประกอบอื่น ๆ ของ virion โดยการปั่นเหวี่ยงด้วยความร้อนสูง การเตรียมที่เป็นผลลัพธ์มีระดับการทำให้บริสุทธิ์ 99.92% มีกิจกรรม GA สูง (1:128) เก็บรักษาไว้อย่างดีเป็นเวลา 1 เดือนที่ pH 5-9

ก่อนตั้งค่า RTGA ควรทำทริปซิไนเซชั่นระดับปานกลางของเม็ดเลือดแดงห่าน 2 เท่าเพื่อให้เกิดอาการแพ้ เมื่อใช้สารแขวนลอยของเม็ดเลือดแดง trypsinized 0.25% (ควร 10 7 เซลล์ต่อ 1 มล.) ความไวของ RTGA จะเพิ่มขึ้น 4 เท่า ในการเจือจาง AG และซีรั่ม จะใช้สารละลายบอเรต-เกลือ (pH 9) โดยเติมอัลบูมินในซีรัมโบวีน 0.4% สารแขวนลอยของเม็ดเลือดแดงถูกเตรียมในสารละลายน้ำเกลือที่มีค่า pH ที่เป็นกรด เพื่อที่ว่าหลังจากผสมกับส่วนผสมของไวรัสและซีรั่มที่มีค่า pH เท่ากับ 9 ค่า pH สุดท้ายจะถูกตั้งไว้ที่ 6.2 หลังจากเพิ่มสารแขวนลอยของเม็ดเลือดแดงลงในบ่อน้ำ แผงจะถูกเขย่า ผนึกด้วยฟิล์มใสแล้ววางบนน้ำแข็ง ผลของ RTHA จะถูกนำมาพิจารณาหลังจาก 40-50 นาทีและด้วยเม็ดเลือดแดงของไก่อายุ 2 วันหรือลิงจำพวก - หลังจาก 1-1.5 ชั่วโมง

การทดสอบภูมิคุ้มกันด้วยรังสีตามความสามารถของ AT ในการผูกกับฉลาก 125 1-AG WB ได้รับการพัฒนา IgG ที่ติดฉลากที่แยกได้จากซีรัมต้านโรคพิษสุนัขบ้า สามารถใช้เพื่อตรวจหา WB AG ด้วย RIA แบบโซลิดเฟส ผลลัพธ์ที่ดีที่สุดได้มาจากการใช้สารละลายเกลือฟอสเฟต (pH 6.0) ที่มีความแรงไอออนิก 0.01 M และติดฉลาก IgG ด้วยกิจกรรม 200-250,000 พัลส์ / นาที

RIA ที่แข่งขันได้แบบโซลิดเฟสใช้ได้กับการตรวจหาแอนติบอดีโรคพิษสุนัขบ้าในซีรัมและไฮบริโดมาเหนือตะกอน

การวินิจฉัยแยกโรค. จำเป็นต้องแยกโรค Aujeszky ซึ่งสัตว์ป่วยไม่ก้าวร้าวไม่มีความอยากอาหารในทางที่ผิด ในสุนัข ไม่รวมรูปแบบทางประสาทของกาฬโรค สงสัยว่าเป็นโรคพิษสุนัขบ้าในโรคไข้สมองอักเสบติดเชื้อในม้า การตรวจทางห้องปฏิบัติการที่ซับซ้อนช่วยให้คุณวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้าได้อย่างแม่นยำ แนะนำ วิธีการใหม่การแยกความแตกต่างของสายพันธุ์ต่างๆ ของ VB โดยพิจารณาจากความแตกแยกที่จำกัดของผลิตภัณฑ์การขยายเสียงใน PCR ของส่วนยีน N

สภาระหว่างรัฐเพื่อมาตรฐาน มาตรวิทยาและการรับรอง

สภาระหว่างรัฐเพื่อมาตรฐาน มาตรวิทยาและการรับรอง

อินเตอร์สเตท

มาตรฐาน

สัตว์

ฉบับทางการ

แบบฟอร์มมาตรฐาน

คำนำ

เป้าหมาย หลักการพื้นฐาน และขั้นตอนพื้นฐานสำหรับการดำเนินงานเกี่ยวกับมาตรฐานระหว่างรัฐนั้นกำหนดโดย GOST 1.0 - 92 "ระบบมาตรฐานระหว่างรัฐ พื้นฐานของบทบัญญัติ” และ GOST 1.2-2009 “ระบบมาตรฐานระหว่างรัฐ มาตรฐานระหว่างรัฐ กฎเกณฑ์และข้อแนะนำสำหรับการสร้างมาตรฐานระหว่างรัฐ กฎการพัฒนา การยอมรับ การสมัคร การต่ออายุ และการยกเลิก”

เกี่ยวกับมาตรฐาน

1 พัฒนาโดยรัฐบาลกลาง สถาบันงบประมาณ"รัสเซียล้วน ศูนย์รัฐคุณภาพและมาตรฐาน ยาสำหรับสัตว์และอาหาร" (FGBU "VGNKI")

2 แนะนำโดยหน่วยงานของรัฐบาลกลางสำหรับกฎระเบียบทางเทคนิคและมาตรวิทยาของสหพันธรัฐรัสเซีย

3 รับรองโดย Interstate Council for Standardization, Metrology and Certification (รายงานการประชุมวันที่ 27 มิถุนายน 2556 ฉบับที่ 57-P)

ชื่อย่อของประเทศตาม MK (ISO 3166) 004-97	รหัสประเทศ MK (ISO 3166) 004-97	ชื่อย่อของหน่วยงานมาตรฐานแห่งชาติ
		กระทรวงเศรษฐกิจแห่งสาธารณรัฐอาร์เมเนีย
เบลารุส		มาตรฐานแห่งสาธารณรัฐเบลารุส
คีร์กีซสถาน		มาตรฐานคีร์กีซ
		มอลโดวา-มาตรฐาน
		Gosstandart
อุซเบกิสถาน		Uzsgandart

4 ตามคำสั่งของหน่วยงานกลางสำหรับกฎระเบียบทางเทคนิคและมาตรวิทยาลงวันที่ 30 กันยายน 2556 ฉบับที่ 1127-st มาตรฐานระหว่างรัฐ GOST 26075-2013 มีผลบังคับใช้เป็นมาตรฐานแห่งชาติของสหพันธรัฐรัสเซียตั้งแต่วันที่ 1 มกราคม 2558

5 แทน GOST 26075-54

ข้อมูลเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงมาตรฐานนี้เผยแพร่ในดัชนีข้อมูลที่เผยแพร่เป็นประจำทุกปี "มาตรฐานแห่งชาติ" และข้อความของการเปลี่ยนแปลงและแก้ไข - ในดัชนีข้อมูลที่เผยแพร่รายเดือน "มาตรฐานแห่งชาติ" ในกรณีที่มีการแก้ไข (เปลี่ยน) หรือยกเลิกมาตรฐานนี้ ประกาศที่เกี่ยวข้องจะได้รับการตีพิมพ์ในดัชนีข้อมูลที่เผยแพร่รายเดือน "มาตรฐานแห่งชาติ" ข้อมูลที่เกี่ยวข้องการแจ้งเตือนและข้อความจะถูกโพสต์ในระบบข้อมูลสาธารณะ - บนเว็บไซต์อย่างเป็นทางการของ Federal Agency for Technical Regulation และ Metrology บนอินเทอร์เน็ต

© Standartinform, 2014

ในสหพันธรัฐรัสเซีย มาตรฐานนี้ไม่สามารถทำซ้ำได้ทั้งหมดหรือบางส่วน ทำซ้ำและแจกจ่ายเป็นสิ่งพิมพ์อย่างเป็นทางการโดยไม่ได้รับอนุญาตจาก Federal Agency for Technical Regulation and Metrology

มาตรฐานอินเตอร์สเตท

สัตว์

วิธีการวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการของโรคพิษสุนัขบ้า

วิธีการวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการของโรคพิษสุนัขบ้า

วันที่แนะนำ - 2015 - 01 - 01

1 พื้นที่ใช้งาน

มาตรฐานนี้ใช้กับสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมทุกชนิด และกำหนดวิธีการต่อไปนี้สำหรับการวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการของโรคพิษสุนัขบ้า:

วิธีการแอนติบอดีเรืองแสง (MFA);

วิธีการแยกไวรัสพิษสุนัขบ้าในการเพาะเลี้ยงเซลล์ของ neuroblastoma CCL-131 ของหนูเมาส์ (หรือโหนดของ neurinoma Gasser ของหนู - NGUK-1);

การทดสอบทางชีวภาพของหนูขาว:

วิธีการทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA);

ปฏิกิริยาการตกตะกอน (RDP)

หมายเหตุ

1 วิธีการเหล่านี้ใช้ได้กับสมาชิกในสกุล Lyssavwus ทั้งหมด

2 ไวรัสพิษสุนัขบ้าข้างถนนเป็นของจุลินทรีย์ที่ทำให้เกิดโรคประเภทที่ 2 (เป็นอันตรายต่อมนุษย์และสัตว์)

3 หากจำเป็น ให้สร้างยีนไวรัสพิษสุนัขบ้าโดยใช้สำเร็จรูป ระบบทดสอบใช้วิธีปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบย้อนกลับ (RT-PCR)

2 การอ้างอิงเชิงบรรทัดฐาน

มาตรฐานนี้ใช้การอ้างอิงเชิงบรรทัดฐานกับมาตรฐานต่อไปนี้:

GOST ISO/IEC 17025 - 2009 ข้อกำหนดทั่วไปสู่ความสามารถของห้องปฏิบัติการทดสอบและสอบเทียบ

GOST 12.0.004 - 90 ระบบมาตรฐานความปลอดภัยในการทำงาน การจัดอบรมความปลอดภัยแรงงาน บทบัญญัติทั่วไป

GOST 12.1.005-68 ระบบมาตรฐานความปลอดภัยแรงงาน ข้อกำหนดด้านสุขอนามัยและสุขอนามัยทั่วไปสำหรับอากาศในพื้นที่ทำงาน

GOST 12.1.008 - 76 ระบบมาตรฐานความปลอดภัยในการทำงาน ความปลอดภัยทางชีวภาพ ข้อกำหนดทั่วไป

GOST 12.4.011 - 89 ระบบมาตรฐานความปลอดภัยในการทำงาน วิธีการป้องกันสำหรับคนงาน ข้อกำหนดทั่วไปและการจำแนกประเภท

GOST 17.0.0.01 - 76 ระบบมาตรฐานในด้านการคุ้มครองธรรมชาติและการปรับปรุงการใช้ทรัพยากรธรรมชาติ ประเด็นสำคัญ

GOST 177-88 ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ข้อมูลจำเพาะ GOST 2603 - 79 รีเอเจนต์ อะซิโตน ข้อมูลจำเพาะ GOST 2768 - 84 อะซิโตนทางเทคนิค ข้อมูลจำเพาะ GOST 4204 - 77 รีเอเจนต์ กรดซัลฟูริก. ข้อมูลจำเพาะ GOST 6709 - 72 น้ำกลั่น ข้อมูลจำเพาะ

GOST ISO 7218 - 2011 จุลชีววิทยา ผลิตภัณฑ์อาหารและอาหารสัตว์ ข้อกำหนดและคำแนะนำทั่วไปสำหรับการศึกษาทางจุลชีววิทยา

GOST 8074 - 82 กล้องจุลทรรศน์เครื่องมือ ประเภท พารามิเตอร์พื้นฐานและขนาด ความต้องการทางด้านเทคนิค.

GOST 9147 - 80 เครื่องแก้วและอุปกรณ์สำหรับห้องปฏิบัติการ ข้อมูลจำเพาะ GOST 9284-75 สไลด์ไมโครสโคป ข้อมูลจำเพาะ GOST 12026 - 76 กระดาษกรองสำหรับห้องปฏิบัติการ ข้อมูลจำเพาะ GOST 13739-78 น้ำมันแช่สำหรับกล้องจุลทรรศน์ ความต้องการทางด้านเทคนิค. วิธีทดสอบ

GOST 16317-87 เครื่องทำความเย็นไฟฟ้าในครัวเรือน ข้อกำหนดทั่วไป

GOST 21241-69 แหนบแพทย์ ข้อกำหนดทั่วไป

GOST 22967 - 90 เข็มฉีดยาทางการแพทย์ ใช้ซ้ำได้. ข้อกำหนดทางเทคนิคทั่วไปและวิธีการทดสอบ

GOST 24661 - 91 (ISO 7866 84) เข็มฉีดยาแบบใช้ครั้งเดียว

GOST 25046 - 81 (ISO 7864-81) เข็มฉีดยาแบบใช้ครั้งเดียว มิติข้อมูลหลัก ความต้องการทางด้านเทคนิค. วิธีทดสอบ

GOST 25336 - 82 เครื่องแก้วและอุปกรณ์ในห้องปฏิบัติการ ประเภท พารามิเตอร์พื้นฐาน และมิติ

GOST 29230 - 91 (ISO 835-4-81) เครื่องแก้วในห้องปฏิบัติการ ปิเปตสำเร็จการศึกษา ส่วนที่ 4. ปิเปตเป่า

หมายเหตุ - เมื่อใช้มาตรฐานนี้ ขอแนะนำให้ตรวจสอบความถูกต้องของมาตรฐานอ้างอิงในระบบข้อมูลสาธารณะ - บนเว็บไซต์ทางการของ Federal Agency for Technical Regulation and Metrology บนอินเทอร์เน็ตหรือตามดัชนีข้อมูลประจำปี "มาตรฐานแห่งชาติ" ซึ่งเผยแพร่เมื่อวันที่ 1 มกราคมของปีปัจจุบัน และปัญหาของดัชนีข้อมูลรายเดือน "มาตรฐานแห่งชาติ" สำหรับปีปัจจุบัน หากมีการเปลี่ยนมาตรฐานอ้างอิง (แก้ไข) เมื่อใช้มาตรฐานนี้ คุณควรได้รับคำแนะนำจากมาตรฐานการแทนที่ (แก้ไข) หากมาตรฐานที่อ้างอิงถูกยกเลิกโดยไม่มีการเปลี่ยน บทบัญญัติที่ให้การอ้างอิงจะใช้บังคับในขอบเขตที่การอ้างอิงนี้ไม่ได้รับผลกระทบ

3 ข้อกำหนด คำจำกัดความ และตัวย่อ

3.1 ข้อกำหนดต่อไปนี้ใช้ในมาตรฐานนี้พร้อมคำจำกัดความที่เกี่ยวข้อง:

3.1.1 โรคพิษสุนัขบ้าของมนุษย์และสัตว์ที่เกิดจากสมาชิกในวงศ์ Rhabdoviridae ในสกุล Lyssavirus (rhabdovirus) ส่งผลให้ ผลร้ายแรงใน 100% ของกรณี

3.1.2 ไวรัสพิษสุนัขบ้า: เชื้อโรค โรคติดเชื้อมนุษย์และสัตว์

3.1.3 โครงสร้างโปรตีนพื้นผิวแอนติเจนของไวรัสพิษสุนัขบ้าของไวรัสพิษสุนัขบ้าซึ่งต่อต้านการสร้างแอนติบอดี

3.1.2 วิธีแอนติบอดีเรืองแสง (MFA): วิธีการตรวจหาแอนติเจนของไวรัสพิษสุนัขบ้าด้วยแอนติบอดีต้านโรคพิษสุนัขบ้าที่ติดฉลาก fluorescein eothiocyanate ด้วยการก่อตัวของสารเชิงซ้อนรวมเรืองแสงที่มีลักษณะเฉพาะที่ตรวจพบในมุมมองของกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง .

3.1.3 วิธีการแยกไวรัสพิษสุนัขบ้าในการเพาะเลี้ยงเซลล์ของมิวรีนนิวโรบลาสโตมา CCL-131 (หรือนิวริโนมาของปมประสาทหนูแกสเซอร์ - NGUK-1): วิธีการแยกแอนติเจนของไวรัสพิษสุนัขบ้า ขึ้นอยู่กับการสืบพันธุ์ของไวรัสในการเพาะเลี้ยงเซลล์และการระบุโดยวิธีแอนติบอดีเรืองแสง

3.1.3 การทดสอบทางชีวภาพ: วิธีการแยกไวรัสพิษสุนัขบ้าในหนูขาวโดยการฉีดสารแขวนลอยของสารทางพยาธิวิทยา ตามด้วยการระบุไวรัสโดยวิธีแอนติบอดีเรืองแสง

3.1.4 วิธีการทดสอบภูมิคุ้มกันที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA) สำหรับการตรวจหาแอนติเจนของไวรัสพิษสุนัขบ้า โดยอาศัยปฏิกิริยาจำเพาะของมันกับแอนติบอดีต้านโรคพิษสุนัขบ้าที่ถูกตรึงไว้บนตัวพาที่เป็นของแข็ง ตามด้วยการตรวจจับแอนติเจนที่ถูกผูกไว้โดยใช้แอนติบอดีที่ติดฉลากด้วยเอนไซม์ตัวที่สองโดยการย้อมสีผลิตภัณฑ์ที่ทำปฏิกิริยาด้วยโครโมเจน

3.1.5 การทดสอบการตกตะกอนแบบแพร่ (RDP): วิธีการตรวจหาไวรัสพิษสุนัขบ้าโดยอาศัยความสามารถของแอนติบอดีและแอนติเจนของไวรัสพิษสุนัขบ้าในการแพร่กระจายในเจลวุ้นและเมื่อเกิดปฏิกิริยาร่วมกัน จะเกิดคอมเพล็กซ์แอนติเจนและแอนติบอดีที่มองเห็นได้ด้วยตาเปล่า ตาในรูปของสายฝน

3.1.6 วิธีปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบย้อนกลับ (RT-PCR) สำหรับตรวจหาจีโนมไวรัสพิษสุนัขบ้าโดยการแปลลำดับ RNA เฉพาะของไวรัสเป็น DNA ตามด้วยการคัดลอกซ้ำของ DNA ที่ได้ผลลัพธ์และการตรวจจับผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาที่ทำในหลอดทดลอง .

3.2 ตัวย่อต่อไปนี้ใช้ในมาตรฐานนี้:

FAG - อิมมูโนโกลบูลินต่อต้านโรคพิษสุนัขบ้าเรืองแสง;

ANG - โกลบูลินต่อต้านโรคพิษสุนัขบ้า;

CFG - ควบคุมโกลบูลินเรืองแสง

PBS - สารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟต

NGUK-1-neurinoma Gasser โหนดของหนู;

FITC - ฟลูออเรสซีน ไอโซไธโอซิเนต:

RNA - กรดไรโบนิวคลีอิก:

DNA - กรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก:

CCN31 - การเพาะเลี้ยงเซลล์นิวโรบลาสโตมาของหนูเมาส์:

OFD - ออร์โธฟีนิลไดเอมีน;

TMB - เตตระเมทิลเบนซิดีน

4 เงื่อนไขการวิจัยและข้อกำหนดด้านความปลอดภัย

4.1 เงื่อนไขการวิจัย

4.1.1 ข้อกำหนดทั่วไปสำหรับการวิเคราะห์ทางจุลชีววิทยาและการทำงานกับจุลินทรีย์ของกลุ่มก่อโรค I - II - ตาม GOST ISO 7218

4.1.2 ข้อกำหนดทั่วไปสำหรับสถานที่ - ตาม GOST ISO 7218

4.1.3 ข้อกำหนดสำหรับบุคลากร - ตาม GOST ISO 7218, GOST ISO / IEC 17025 (1)

พนักงานที่ผ่านการรับรองซึ่งมีประสบการณ์ในการทำงานกับจุลินทรีย์ของกลุ่มก่อโรค I-II ซึ่งได้ศึกษาวิธีการทำงานทางจุลชีววิทยาจะได้รับอนุญาตให้ทำการวิจัยได้ ฉีดวัคซีนป้องกันโรคพิษสุนัขบ้า

4.2 ข้อกำหนดด้านความปลอดภัย

4.2.1 ข้อกำหนดด้านความปลอดภัยทั่วไปสำหรับการทำงานตาม GOST 12.1.008

4.2.2 อุปกรณ์ป้องกันสำหรับคนงานต้องเป็นไปตามข้อกำหนดของ GOST 12.4.011

4.2.3 อากาศของพื้นที่ทำงานต้องเป็นไปตามข้อกำหนดของ GOST 12.1.005

4.2.4 การฝึกอบรมบุคลากรด้านความปลอดภัยแรงงานตาม GOST 12.0.004

4.2.5 การกำจัดวัสดุที่ได้รับสำหรับการศึกษา ตลอดจนอุปกรณ์ป้องกันส่วนบุคคลที่ใช้แล้ว เครื่องมือ ฯลฯ ดำเนินการโดยการต้มเป็นเวลา 30 นาทีหรือนึ่งเป็นเวลา 15 นาทีที่ความดัน (0.11 ± 0.20) MPa

5 เครื่องมือวัด อุปกรณ์ วัสดุ น้ำยาและสัตว์

5.1 สำหรับใช้ในการวิจัย:

การสแกนสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ด้วยช่วงสเปกตรัมของความยาวคลื่นตั้งแต่ 190 ถึง 1100 นาโนเมตร โดยมีข้อผิดพลาดไม่เกิน ± 0.5 นาโนเมตร และช่วงการวัดความหนาแน่นของแสง (OD) ตั้งแต่ 0.1 ถึง 3.0;

แผ่นสำหรับปฏิกิริยาภูมิคุ้มกัน 96 หลุม:

เครื่องควบคุมอุณหภูมิที่รักษาอุณหภูมิตั้งแต่ 20 "-C ถึง 50 ° C:

ตู้เย็นในครัวเรือนให้การรักษาอุณหภูมิตั้งแต่ 0 ° C ถึง 10 ° C ตาม GOST 16317:

เครื่องหมุนเหวี่ยงในห้องปฏิบัติการ

อ่างอาบน้ำ;

กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงกลับด้านตาม GOST 8074:

ครกพอร์ซเลนที่มีสากตาม GOST 9147 หรือโฮโมจีไนเซอร์ตาม GOST ISO/IEC 17025

สไลด์ตาม GOST 9284:

หลอดทดลองแก้วตาม GOST 25336;

จานเพาะเชื้อตาม GOST 25336;

Cuvette ตาม GOST 25336;

ปิเปตที่มีความจุ 1.0; 2.0 และ 10.0 ซม. 3 ตาม GOST 29230;

ปิเปตอัตโนมัติที่มีความจุ 0.05 ถึง 0.20 ซม. 3 พร้อมทิป:

แหนบทางการแพทย์ตาม GOST 21241:

เข็มฉีดยาอินซูลินที่มีความจุ 1.0 ซม. 3 ตาม GOST 22967 หรือ GOST 24861

เข็มฉีดยาตาม GOST 25046:

แก้ววัฒนธรรมแปดหลุม;

กรงสำหรับเลี้ยงหนู

อะซิโตนตาม GOST 2603 หรือ GOST 2768;

อิมมูโนโกลบูลินต่อต้านโรคพิษสุนัขบ้าเรืองแสง (FAG);

ต่อต้านโรคพิษสุนัขบ้าโกลบูลิน (AnG);

ควบคุมโกลบูลินเรืองแสง (CFG);

น้ำมันแช่ไม่เรืองแสงตาม GOST 13739;

น้ำกลั่นตาม GOST 6709;

สารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟตที่มีความเข้มข้นของโมล 0.01 โมล/dm 3 (PBS) pH 7.2 - 7.4;

- สารละลายโซเดียมคลอไรด์ปลอดเชื้อ 0.9% ไอโซโทนิก:

การเพาะเลี้ยงเซลล์ของมิวรีนนิวโรบลาสโตมา CC31 หรือโหนดของ nonerynoma Gasser ของหนู -

เพนิซิลลิน;

สเตรปโตมัยซิน;

MEM เข็มขนาดกลางพร้อมกรดอะมิโนและวิตามินสองชุด (DMEM), pH 7.2;

สารละลายทริปซิน 0.25%;

เซรั่มเลือดตัวอ่อนของโคสำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ 10%;

กลูตามีน 3%;

ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 3% ตาม GOST 177;

ชุดเตรียมการตรวจทางห้องปฏิบัติการของโรคพิษสุนัขบ้าในสัตว์โดย ELISA;

สารละลายกรดซัลฟิวริกที่มีความเข้มข้นของโมล 2 โมล / dm 3 ตาม GOST 4204

กระดาษกรองตาม GOST 12026;

แสตมป์สำหรับทำบ่อน้ำ;

เมอร์ไทโอเลต;

Agar "Difko" หรือคล้ายกัน

สารละลายเมทิลออเรนจ์ 1% ในเอทานอล 50%:

แอนติเจนบวกและลบ;

เซรั่มต่อต้านโรคพิษสุนัขบ้าหรืออิมมูโนโกลบูลิน

หนูขาวสุขภาพดีทางคลินิกน้ำหนัก 6-8 กรัม

5.2 อนุญาตให้ใช้เครื่องมือวัดอื่นที่มีลักษณะทางมาตรวิทยาและอุปกรณ์ที่มีลักษณะทางเทคนิคไม่เลวลง เช่นเดียวกับรีเอเจนต์และวัสดุที่มีคุณภาพไม่ต่ำกว่าที่ระบุไว้ข้างต้น อนุญาตให้ใช้เครื่องใช้บนโต๊ะอาหารแบบใช้แล้วทิ้ง

6 การสุ่มตัวอย่าง

6.1 เพื่อดำเนินการวิจัยเกี่ยวกับไวรัสพิษสุนัขบ้า วัตถุทางพยาธิวิทยาจะถูกส่งไปยังห้องปฏิบัติการ - ศพสดหรือหัวของสัตว์เล็กหัวหรือสมองของสัตว์ใหญ่

6.2 วัสดุทางพยาธิวิทยาที่เลือกสำหรับการวิจัยบรรจุในภาชนะกันความชื้นและจัดส่งไปยังห้องปฏิบัติการในภาชนะโลหะ วัสดุแช่แข็งถูกวางไว้ในตู้แช่แข็ง

6.3 เอกสารทางพยาธิวิทยามาพร้อมกับเอกสารที่มีข้อมูลดังต่อไปนี้ ชื่อและที่อยู่ของผู้ส่ง ประเภทของสัตว์ ข้อมูลการลบความทรงจำและข้อมูลทางคลินิกและทางสรีรวิทยา

6.4 การศึกษาในห้องปฏิบัติการจะดำเนินการทันทีเมื่อได้รับวัสดุทางพยาธิวิทยา

6.5 สำหรับการวิจัย ชิ้นส่วนของเนื้อเยื่อจากแต่ละส่วนของสมอง (เขาของแอมมอน สมองน้อย เปลือกสมอง ไขกระดูก oblongata) ขนาด 0.5 - 1.0 ซม. นำมาจากสัตว์ใหญ่ สมองของสัตว์เล็ก เช่น หนู จะถูกตรวจสอบเป็น ทั้งหมด.

เฉพาะตัวอย่างเนื้อเยื่อสมองสดหรือแช่แข็งสดเท่านั้นที่เหมาะสำหรับการศึกษา MFA และวิธีการแยกไวรัสพิษสุนัขบ้าในการเพาะเลี้ยงเซลล์ neuroblastoma CCL-131 (หรือ NGUK-1) ของหนูเมาส์ ไม่อนุญาตให้ทำการวิจัยตัวอย่างสมองของสัตว์ที่เน่าเปื่อย (ในระยะการสลายตัว) เก็บรักษาด้วยกลีเซอรอล ตรึงด้วยเมทิลแอลกอฮอล์ ฟอร์มาลิน หรือวิธีการอื่นๆ ที่ส่งเสริมการเกิดการเรืองแสงที่ไม่เฉพาะเจาะจง

สำหรับการตั้งค่าการทดสอบทางชีวภาพ อนุญาตให้ใช้ตัวอย่างสมองที่เก็บรักษาไว้ในสารละลายกลีเซอรอล 30% -50% * ไม่อนุญาตให้ใช้สารกันบูดอื่นๆ สำหรับการเก็บรักษา วัสดุทางพยาธิวิทยาสามารถแช่แข็งได้ที่อุณหภูมิไม่เกินลบ 10 C

7 วิธีแอนติบอดีเรืองแสง (MFA)

7.1 สาระสำคัญของวิธีการ

สาระสำคัญของวิธีการแอนติบอดีเรืองแสงอยู่ในการทำงานร่วมกันเฉพาะของแอนติบอดีต่อต้านโรคพิษสุนัขบ้าเรืองแสงกับแอนติเจนที่คล้ายคลึงกันของไวรัสพิษสุนัขบ้า คอมเพล็กซ์แอนติเจน-แอนติบอดีที่เป็นผลลัพธ์ที่ติดฉลากด้วย FITC ตรวจพบด้วยตาเปล่าโดยลักษณะเรืองแสงในขอบเขตการมองเห็นเมื่อมองด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง

7.2 การเตรียมตัวสำหรับการศึกษา

7.2.1 การเตรียมตัวอย่าง

7.2.1.1 มีการเตรียมการอย่างน้อยสามครั้ง (รอยประทับหรือรอยเปื้อน) จากแต่ละส่วนของสมองจากเนื้อเยื่อที่เลือกตามข้อ 6.5 บนสไลด์แก้วที่ตัดไขมันอย่างระมัดระวัง หากสภาพของวัสดุทางพยาธิวิทยาอนุญาตก็เตรียมงานพิมพ์ในกรณีอื่น ๆ จะทำรอยเปื้อน

7.2.1.2 การเตรียมงานพิมพ์

ชิ้นผ้าที่เลือกตามข้อ 6.5 ใส่กระดาษกรองพับสี่ถึงหกชั้น สมองของสัตว์ตัวเล็กถูกตัดขวาง จับส่วนต่างๆ ของมัน แล้ววางโดยให้ด้านที่ตัดขึ้นบนกระดาษกรองที่พับเป็นสี่ถึงหกชั้น พื้นผิวที่ตัดถูกสัมผัสด้วยสไลด์แก้ว กดเล็กน้อยจนได้รอยประทับบางๆ บนกระจก

7.2.1.3 การเตรียมการสเมียร์

เนื้อเยื่อจากแต่ละส่วนของสมอง (ในสัตว์เล็กคือสมองทั้งหมด) เลือกตามข้อ 6.5 ถูในครกพอร์ซเลนด้วยสากจนได้มวลที่เป็นเนื้อเดียวกันซึ่งจะทำรอยเปื้อนบนสไลด์แก้ว

7.2.1.4 ในการควบคุม การกวาดหรือการแสดงผลจะทำจากสมองของหนูขาวที่มีสุขภาพดี ปลอดโรคพิษสุนัขบ้า และไม่ได้รับการฉีดวัคซีนตามที่อธิบายไว้ใน 7.3.1.2 และ 7.3.1.3

7.2.1.5 หลังจากเตรียม รอยเปื้อนหรือรอยพิมพ์จะถูกทำให้แห้งในอากาศเป็นเวลา 20-30 นาที แก้ไขในอะซิโตนแช่เย็นที่อุณหภูมิ 4'C เป็นเวลา 4 - 12 ชั่วโมงหรือที่อุณหภูมิลบ 20 * C เป็นเวลา 1 ชั่วโมงหลังจากนั้นนำออกจากอะซิโตนและทำให้แห้งในอากาศเป็นเวลา 10 - 15 mJ

7.2.2 การเตรียมรีเอเจนต์

เอฟเอจี อ่างและ KFG ถูกละลายด้วยน้ำกลั่นจนถึงปริมาตรเริ่มต้นที่ระบุไว้บนฉลากของหลอดบรรจุ อายุการเก็บรักษาของ FA ที่ละลายน้ำ AnH และ CFG ที่อุณหภูมิ (5 ± 2) C - ไม่เกินสองสัปดาห์

สำหรับการศึกษาโดยตรง ปริมาณ FAG ที่ต้องการละลาย AnG และ KFG ถูกเจือจางด้วย FBI จนถึงการเจือจางการทำงานที่ระบุบนฉลากหลอด การเจือจางการทำงานของ FAG ที่ละลายน้ำ ใช้อ่างและ CFG ในวันเตรียมการ

7.3 การดำเนินการศึกษา

สไลด์ที่มีการเตรียมการ (รอยเปื้อนหรือรอยพิมพ์) ตามข้อ 7.2.1 จะถูกวางไว้ในห้องที่มีความชื้น (จานเพาะเชื้อหรือคิวเวตต์ที่มีก้นชุบน้ำ) จากนั้น หนึ่งในสามของการเตรียมการที่เตรียมไว้จะถูกเคลือบด้วย FAG ในการเจือจางที่ใช้งานได้อย่างสม่ำเสมอทั่วทั้งพื้นผิวของรอยเปื้อนหรือรอยประทับโดยใช้ปิเปต การเจือจางการทำงานของ KFG ถูกนำไปใช้กับการเตรียมการครั้งที่สอง ปิดห้องด้วยยา วางในเทอร์โมสตัทที่อุณหภูมิ (37 ± 1) * C และเก็บไว้ 30

นาที สารเตรียมควบคุมถูกย้อมแบบขนาน ในตอนท้ายของการย้อมสี การเตรียมการจะถูกล้างสามครั้ง แช่พวกเขาในแต่ละครั้งเป็นเวลา 10 นาทีในภาชนะที่มี PBS ล้างออกด้วยน้ำกลั่นและผึ่งให้แห้งในอากาศเป็นเวลา 20-30 นาที

การเจือจางการทำงานของ Ang ถูกนำไปใช้กับการเตรียมการครั้งที่สาม วางในเทอร์โมสตัทที่อุณหภูมิ (37 ± 1) * C และฟักเป็นเวลา 30 นาที จากนั้นล้างการเตรียมการสามครั้ง แช่แต่ละครั้งเป็นเวลา 10 นาทีในภาชนะที่มี PBS ล้างด้วยน้ำกลั่น ตากในอากาศเป็นเวลา 20 - 30 นาที และย้อมด้วย FAG เจือจาง ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น

7.4 การจัดการผลลัพธ์

ในการเตรียมการเปื้อน เนื้อเยื่อสมองที่ไม่ได้รับผลกระทบจากไวรัสพิษสุนัขบ้าจะเรืองแสงจางๆ สีเทาอมเหลือง

แอนติเจนของไวรัสพิษสุนัขบ้าตรวจพบในเซลล์ประสาทและเซลล์ภายนอกในรูปแบบของเม็ดสีเขียวสดใสที่มีรูปร่างและขนาดต่าง ๆ ตั้งแต่แทบจะสังเกตไม่เห็นจนถึงขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง 15-20 ไมครอน บางครั้งมีอนุภาคสีเขียวสดใสขนาดเล็กจำนวนมาก (ขนาดไม่เกิน 1 ไมครอน) ที่มีรูปร่างกลมและรูปไข่

การวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้าถือเป็นการพิสูจน์ หากพบเม็ดสีเขียวอมเหลืองทั่วไปในการเตรียมการศึกษาในมุมมองของกล้องจุลทรรศน์หลายด้าน ในเวลาเดียวกัน ในการเตรียมการควบคุม (ในรอยเปื้อนหรือรอยประทับจากสมองของหนูขาวที่มีสุขภาพดีที่ไม่มีโรคพิษสุนัขบ้า ย้อมด้วย FAG) เช่นเดียวกับในการเตรียมการศึกษา ย้อมด้วย CFG และได้รับการบำบัดล่วงหน้าด้วย AnG และย้อมด้วย FAG การก่อตัวดังกล่าวไม่ควรมีอยู่

ผลการศึกษาจะรายงานไปยังหน่วยงานที่มีอำนาจตามขั้นตอนที่บังคับใช้ในอาณาเขตของรัฐที่ใช้มาตรฐาน

8 กรณีของผลลบการศึกษาจะดำเนินการในวันที่ 8 หรือ 9

8 วิธีการแยกไวรัสพิษสุนัขบ้าในการเพาะเลี้ยงเซลล์ของหนูเมาส์นิวโรบลาสโตมา CCL-131

8.1 สาระสำคัญของวิธีการ

สาระสำคัญของวิธีการนี้อยู่ที่การแยกไวรัสพิษสุนัขบ้าในการเพาะเลี้ยงเซลล์หนู

neuroblastoma CCL-131 หรือ NGUK-1 พร้อมการระบุในภายหลังโดยวิธีการของแอนติบอดีเรืองแสง

วิธีการนี้เป็นทางเลือกแทนการตรวจทางชีวภาพในหนูขาวตามข้อ 9

8.2 การเตรียมตัวสำหรับการศึกษา

8.2.1 การเตรียมตัวอย่าง

เนื้อเยื่อส่วนเท่าๆ กันที่นำออกจากสมองแต่ละส่วนของสัตว์ขนาดเล็ก (เขาของแอมมอน สมองน้อย เยื่อหุ้มสมอง ไขกระดูก) หรือชิ้นส่วนของเนื้อเยื่อจากแต่ละส่วนของสมองของสัตว์ใหญ่ ตามข้อ 6.5 บดด้วยกรรไกรและบดในครกหรือโฮโมจีไนเซอร์ ค่อยๆ เติมสารละลายโซเดียมคลอไรด์ไอโซโทนิก 0.9% ที่ผ่านการฆ่าเชื้อจนได้สารแขวนลอย 10% ยาเพนนิซิลลินและสเตรปโตมัยซินถูกเติมลงในสารแขวนลอยของสมองตามหน่วยสหรัฐ/ซม. 3 และ 1 มก./ซม. 3 ตามลำดับ

สารแขวนลอยที่ได้จะถูกผสมอย่างทั่วถึงและหมุนเหวี่ยงเป็นเวลา 5-10 นาทีที่ความเร็ว 2,000 รอบต่อนาที ของเหลวตะกอนข้างต้นถูกถ่ายโอนไปยังหลอดทดลองที่ปลอดเชื้อและเก็บไว้ที่อุณหภูมิไม่เกิน 4 °C จนกว่าจะใช้

8.2.2 การเตรียมสไลด์วัฒนธรรม

การเพาะเลี้ยงเซลล์นิวโรบลาสโตมาของหนูเมาส์ทุกวัน CCL-131 (หรือ NGUK-1) จะถูกลบออกจากขวดเพาะเลี้ยงโดยใช้สารละลายทริปซิน 0.25% และเจือจางด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อ DMEM ด้วยซีรั่มวัวในครรภ์ 10% และกลูตามีน 3% เพื่อให้เซลล์มีความเข้มข้น 2 * 10 วินาที /ซม. 3 . 0.1 ซม. 3 ของสารแขวนลอยของเซลล์ที่เกิดขึ้นจะถูกเพิ่มลงในบ่อแก้วเพาะเลี้ยง ปิดฝาและวางในตู้อบ CO g แบบชื้นที่มีปริมาณ CO 5% ที่อุณหภูมิ (37 ± 1) ° C เป็นเวลา 18- 20 ชั่วโมง

8.3 การดำเนินการศึกษา

เพิ่มสารแขวนลอย 0.05 ซม. 3 จากแต่ละส่วนของสมองลงในแก้วเพาะเลี้ยงสองหลุมตามข้อ 8.2.2 เหลือสองหลุมในแต่ละสไลด์เพื่อการควบคุมด้านบวกและด้านลบ การหยุดชะงักของสมองของหนูที่ติดเชื้อไวรัสพิษสุนัขบ้า - สายพันธุ์ CVS ถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวก การระงับสมองของหนูที่มีสุขภาพดีทางคลินิกถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ วางแก้วเพาะเลี้ยงไว้ในตู้เพาะเลี้ยง CO2 แบบชื้นที่มีปริมาณ CO2 5% ที่อุณหภูมิ (37 ± 1) *C เป็นเวลา 42–48 ชั่วโมง

ในตอนท้ายของการฟักไข่ สื่อจะถูกลบออกจากบ่อของแก้วเพาะเลี้ยงโดยใช้ปิเปตอัตโนมัติ เซลล์จะถูกล้างด้วย PBS หนึ่งครั้ง (โดยใช้ปิเปตอัตโนมัติ เติมสารละลาย 0.2 ซม. 3 ในแต่ละหลุม) และตากใน การไหลของอากาศลามิเนตเป็นเวลา 20 - 30 นาที จากนั้นเติมอะซิโตน 0.1 ซม. 3 ลงในแต่ละหลุมที่อุณหภูมิลบ 20 * C และทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที

หลังจากการตรึงเซลล์ แก้วเพาะเชื้อจะกลับด้านและเขย่าเพื่อขจัดอะซิโตน และจากนั้นทำให้แห้งในการไหลของอากาศแบบราบเป็นเวลา 20–30 นาที ใช้มีดผ่าตัดและแหนบ ถอดหัวฉีดพลาสติกแล้วเช็ดกระจกให้แห้งอีก 5-10 นาที 0.05 - 0.10 ซม. 3 ของ FAG ถูกเติมในแต่ละหลุมในการเจือจางการทำงาน (เลือกโดยสังเกตจากประสบการณ์) ที่เตรียมใน FBI วางในจานเพาะเชื้อที่เปียกและฟักที่อุณหภูมิ (37 ± 1) C เป็นเวลา 30 นาที

ในตอนท้ายของการย้อมสี สไลด์จะถูกล้างสามครั้ง แช่ไว้ 10 นาทีในแต่ละครั้งในภาชนะที่มี PBS จากนั้นเตรียมล้างด้วยน้ำกลั่นและทำให้แห้งในอากาศเป็นเวลา 20-30 นาที

น้ำมันแช่แบบไม่มีฟลูออเรสเซนต์ถูกนำไปใช้กับการเตรียมการย้อมสีและตรวจดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง

8.4 การจัดการผลลัพธ์

ในการเตรียมการย้อมสี การเพาะเลี้ยงเซลล์ที่ไม่ได้รับผลกระทบจากไวรัสพิษสุนัขบ้าจะเรืองแสงจางๆ สีเทาอมเหลือง (ตัวควบคุมเชิงลบ) ตรวจพบแอนติเจนของไวรัสพิษสุนัขบ้าในไซโตพลาสซึมของการเพาะเลี้ยงเซลล์ในรูปแบบของเม็ดสีเขียวสดใสที่มีรูปร่างและขนาดต่าง ๆ พร้อมขอบที่กำหนดไว้อย่างชัดเจน (กลุ่มควบคุมเชิงบวก)

การวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้าได้รับการพิจารณาหากพบว่ามีเม็ดสีเหลืองสีเขียวทั่วไปในการเตรียมการทดสอบในหลายด้านของกล้องจุลทรรศน์

หากตรวจไม่พบไวรัสพิษสุนัขบ้าในการเพาะเลี้ยงเซลล์ การวินิจฉัยทางลบจะเกิดขึ้น

ผลการแยกเชื้อไวรัสพิษสุนัขบ้าในการเพาะเลี้ยงเซลล์ถือเป็นที่สิ้นสุด ไม่มีการศึกษาเพิ่มเติม

9 Bistlerob กับหนูขาว

9.1 แก่นแท้ของวิธีการ

สาระสำคัญของวิธีการนี้อยู่ที่การแยกเชื้อไวรัสพิษสุนัขบ้าโดยการฉีดสารทางพยาธิวิทยาเข้าในสมองในหนูขาว ตามด้วยการระบุไวรัสโดยวิธีแอนติบอดีเรืองแสงตามข้อ 7

9.2 การเตรียมตัวอย่างสำหรับการตรวจ - ตามข้อ 6.2.1

9.3 การดำเนินการศึกษา

หนูขาวห้า-6 ตัวติดเชื้อด้วยสารแขวนลอย 10% ของวัสดุทางพยาธิวิทยา im-tracerebral ในปริมาตร 0.02 - 0.03 ซม. 3 . หนูที่ติดเชื้อจะอยู่ในกรงที่แยกจากกัน โดยติดฉลากระบุวันที่ติดเชื้อ จำนวนหนู วิธีการติดเชื้อ และหมายเลขการตรวจของวัสดุทางพยาธิวิทยา สัตว์ถูกสังเกตอย่างน้อย 30 วัน จำนวนหนูที่มีสุขภาพดี ป่วย และตายจะถูกบันทึกไว้ในบันทึกประจำวัน

9.4 การจัดการผลลัพธ์

เมื่อประเมินผลลัพธ์ จะพิจารณาการปรากฏตัวของอาการทางคลินิกในหนูที่ติดเชื้อ (ขนที่ระคายเคือง, การรับประทานอาหาร, การประสานงานที่บกพร่องของการเคลื่อนไหว, อัมพาต, การสั่น, การกราบ) การตายของหนูในสองวันแรกหลังการติดเชื้อจะไม่ถูกนำมาพิจารณา ตัวอย่างสมองจากสัตว์ป่วยและตายตั้งแต่วันที่สามจะถูกตรวจโดย MFA โดย 7

การตรวจทางชีวภาพถือเป็นบวก หากเริ่มตั้งแต่วันที่สามหลังการติดเชื้อ หนูอย่างน้อยหนึ่งตัวล้มป่วยและเสียชีวิต และตรวจพบการรวมตัวของไวรัสพิษสุนัขบ้าในตัวอย่างสมองโดยใช้ MFA

การวินิจฉัยเชิงลบสามารถทำได้หลังจากสังเกตได้ 30 วัน โดยที่สัตว์ที่ติดเชื้อทั้งหมดยังมีชีวิตอยู่และมีสุขภาพดี

ผลการตรวจทางชีวภาพถือเป็นที่สิ้นสุด ยังไม่มีการวิจัยเพิ่มเติม

10 วิธีเอนไซม์อิมมูโนแอสเซย์ (ELISA)

10.1 สาระสำคัญของวิธีการ

8 ELISA ขึ้นอยู่กับปฏิสัมพันธ์จำเพาะของแอนติเจนของไวรัสพิษสุนัขบ้ากับแอนติฮีเลียม ตรึงไว้กับผู้ให้บริการที่เป็นของแข็ง ตรวจพบแอนติเจนที่ถูกจับโดยใช้แอนติบอดีต่อโรคพิษสุนัขบ้าที่ติดฉลากเปอร์ออกซิเดสตัวที่สอง ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาซึ่งมีสีเมื่อเติมโครโมเจน ความเข้มของการย้อมสีของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาเป็นสัดส่วนโดยตรงกับปริมาณของแอนติเจน

10.2 การเตรียมตัวสำหรับการศึกษา

10.2.1 ในฐานะที่เป็นวัสดุทดสอบ (แอนติเจน) จะใช้ตัวอย่างเนื้อเยื่อสมองของคนตาย ถูกบังคับฆ่า สงสัยว่าเป็นโรคพิษสุนัขบ้า หรือสัตว์ทดลองที่ติดเชื้อไวรัสพิษสุนัขบ้า

10.2.2 การเตรียมการทดสอบแอนติเจน

ตัวอย่างเนื้อเยื่อสมองที่ได้รับตาม 6.5 ถูกบดขยี้บดในครกและเตรียมสารแขวนลอย 10% * ในสารละลายโซเดียมคลอไรด์ไอโซโทนิก C.9% อุ่นในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 60 * C เป็นเวลา 15 นาทีและหมุนเหวี่ยง 5-10 นาที ที่ 2000 รอบต่อนาที ส่วนเหนือตะกอนถูกใช้เป็นแอนติเจนทดสอบ

10.2.3 การเตรียมรีเอเจนต์

สารละลายและรีเอเจนต์ทั้งหมดก่อนตั้งค่าปฏิกิริยาต้องเก็บไว้อย่างน้อย 30 นาทีที่อุณหภูมิ (22 ± 1) * C

การเตรียมส่วนประกอบชุดจะดำเนินการตามคำแนะนำในการใช้งาน

10.3 การดำเนินการศึกษา

10.3.1 ELISA ดำเนินการในรูปแบบแซนวิชโดยใช้ส่วนประกอบที่รวมอยู่ในชุดอุปกรณ์สำหรับการตรวจหาแอนติเจนของเชื้อโรคพิษสุนัขบ้าในวัสดุทางพยาธิวิทยา

สำหรับ ELISA จะใช้เพลตสำหรับปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันที่มีก้นแบน

ปริมาณของส่วนผสมที่แนะนำในขั้นตอนลงในหลุมของแท็บเล็ตมีค่าเท่ากันและเป็น

10.3.2 การแพ้ของเพลต

แผ่นโพลีสไตรีน 6 หลุมบรรจุ ANG ในการเจือจางการทำงานที่ระบุบนฉลาก จานที่มี ANG ปิดฝาและฟักในเทอร์โมสตัทที่อุณหภูมิ (37 ± 0.5) *C เป็นเวลา 3 ชั่วโมงหรือที่อุณหภูมิ 4 *C เป็นเวลา 18 ชั่วโมง หลังจากฟักตัวแล้วหลุมของจานจะถูกล้าง สามครั้งด้วยสารละลายบัฟเฟอร์การซัก เขย่าเนื้อหาในบ่อด้วยการซักแต่ละครั้ง และสารละลายที่เหลือจะถูกลบออกโดยแตะที่กระดาษกรอง

10.3.3 การใช้แอนติเจน

8 แถวของจาน A. 8 และ C เพิ่มบัฟเฟอร์การซัก แอนติเจนควบคุมที่เป็นบวก (หลุม A1) และเชิงลบ (หลุม A2) ที่รวมอยู่ในชุดอุปกรณ์ เช่นเดียวกับตัวอย่างทดสอบ (หลุม AZ. A4 เป็นต้น) จะถูกนำเข้าไปในหลุมของยาเม็ดและไตเตรทในแนวตั้ง โดยได้การเจือจางตั้งแต่ 1 : 2 ถึง 1: 8. ด้วยตัวอย่างจำนวนมาก ให้กรอกข้อมูลในแถวอื่นๆ ของแท็บเล็ต แผ่นปิดด้วยฝาปิดและฟักในเทอร์โมสแตทที่อุณหภูมิ (37 ± 0.5) * C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ในตอนท้ายของการฟักไข่หลุมของจานจะถูกล้างสามครั้งจากแอนติเจนที่ไม่จับกับอิมมูโนโกลบูลิน ตามที่อธิบายไว้ใน 10.3.2

10.3.4 การใช้โรคพิษสุนัขบ้า leroxidase conjugate

การเจือจางการทำงานของคอนจูเกตต่อต้านโรคพิษสุนัขบ้าเปอร์ออกซิเดสจะถูกเพิ่มลงในหลุมของจานแล้วปิดฝาและฟักในเทอร์โมสตัทที่อุณหภูมิ (37 ± 0.5) C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นหลุมของจานจะ ล้างสามครั้งตามที่อธิบายไว้ใน 10.3.2

10.3.5 การแพร่กระจายส่วนผสมของซับสเตรต

สำหรับการแสดงปฏิกิริยา ส่วนผสมของซับสเตรตที่เตรียมไว้จะถูกเติมลงในหลุมของยาเม็ด ปฏิกิริยาจะแสดงเป็นเวลา 15 - 30 นาทีที่อุณหภูมิ (22 ± 0.5) *C ในที่มืด ปฏิกิริยาหยุดลงโดยการเติมสารละลายกรดซัลฟิวริกที่มีความเข้มข้นของโมลเท่ากับ 2 โมล/DM 3

10.4 การจัดการผลลัพธ์

การบัญชีสำหรับปฏิกิริยาจะดำเนินการด้วยสายตาหรือบนเครื่องสแกนสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ตามคำแนะนำในการใช้ชุดอุปกรณ์

ถ้าใช้ OPD เป็นโครโมเจนในส่วนผสมของซับสเตรต จากนั้นทำการวัดความหนาแน่นของแสงที่ 490 นาโนเมตร ถ้าใช้ TMB จากนั้นที่ 450 กม.

ปฏิกิริยาจะพิจารณาก็ต่อเมื่อไม่มีการย้อมสีจำเพาะในบ่อที่มีการควบคุมแอนติเจนเชิงลบ ในขณะที่การย้อมสีแบบเข้มข้นในบ่อที่มีการควบคุม แอนติเจนที่เป็นบวก. เมื่อนับด้วยสายตา ตัวอย่างจะถือเป็นบวกหากการเจือจางอย่างน้อยหนึ่งครั้ง (ครั้งแรก) แสดงให้เห็นการย้อมสีอย่างเฉพาะเจาะจง

เมื่อพิจารณาด้วยสเปกโตรโฟโตเมตริกโดยคำนึงถึงผลลัพธ์ของ ELISA จะทำการคำนวณสัมประสิทธิ์ความจำเพาะ K sp ซึ่งเท่ากับอัตราส่วนของความหนาแน่นเชิงแสง (OD) ของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาในหลุมที่มีแอนติเจนที่เป็นบวกควบคุมหรือวัสดุทดสอบ (OD) ต่อความหนาแน่นเชิงแสงของสารตั้งต้นในหลุมที่มีแอนติเจนเชิงลบควบคุม (OD) . ปฏิกิริยานี้ถือเป็นบวก ถ้าค่าสัมประสิทธิ์ความจำเพาะมากกว่า 2.1 และลบถ้าน้อยกว่า 2.1

OP1 * 0.641, OPg a 0.120, Ksp \u003d 5.34 - ปฏิกิริยาเป็นบวกหรือ OP1 \u003d 0.180, OPg ที่ 0.120 K ด้วย„ * 1.5 - ปฏิกิริยาเป็นลบ

ในกรณีของปฏิกิริยาเชิงบวก การวินิจฉัยจะถือว่าเป็นที่ยอมรับ ผลลบต้องได้รับการยืนยันด้วยวิธีอื่นตามข้อ 7 - 9

11 ปฏิกิริยาการตกตะกอน (RDP)

11.1 สาระสำคัญของวิธีการ

สาระสำคัญของวิธี RDP อยู่ที่ความสามารถของแอนติบอดีและแอนติเจนของไวรัสในการแพร่กระจายในเจลวุ้นและเมื่อเกิดปฏิกิริยาเฉพาะเจาะจงจะก่อให้เกิดสารเชิงซ้อนของแอนติเจนและแอนติบอดีซึ่งมองเห็นได้ด้วยตาเปล่าในรูปแบบของเส้นตกตะกอน

11.2 การเตรียมสอบ

11.2.1 การเตรียมตัวอย่าง

การเตรียมตัวอย่างเพื่อการวิจัย - ตาม 8.2.1

อนุญาตให้ใช้ตัวอย่างสมองของสัตว์ที่ค้างอยู่ซึ่งปนเปื้อนด้วยจุลินทรีย์จากแบคทีเรียเพื่อการวิจัย

11.2.2 การเตรียมวุ้น

ในการเตรียมวุ้น ให้ผสมวุ้นดิฟโก 1.5 กรัม 1 ซม. 3 1% สารละลายเมทิลออเรนจ์ในเอทานอล 50% เมอร์ไทโอเลต 0.01 กรัม สารละลายไอโซโทนิกโซเดียมคลอไรด์ 100 ซม. 3 ส่วนผสมที่ได้จะถูกต้มจนวุ้นละลายหมด เทลงในหลอดทดลอง นึ่งด้วยความดัน 0.5 atm เป็นเวลา 30 นาที และเก็บไว้ในตู้เย็นที่อุณหภูมิ 4°C

11.2.3 การเตรียมสไลด์ (จานเพาะเชื้อ)

ปฏิกิริยาถูกวางบนสไลด์แก้วหรือบนจานเพาะเชื้อ หยดวุ้นที่หลอมละลายลงบนแก้วที่หลอมละลายแล้วกระจายไปทั่วแก้วและทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 20-30 นาทีเพื่อทำให้วุ้นแข็งตัว จากนั้นนำวุ้นที่หลอมเหลว 2.5 ซม. 3 มาทาบนแก้ว ทำให้เกิดชั้นหนาประมาณ 2 มม. และทิ้งไว้ 20-30 นาที รูทำในชั้นวุ้นแช่แข็งโดยใช้ตราประทับพิเศษหรือท่อโลหะผนังบางที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 4-5 มม. นำวุ้นวุ้นออกอย่างระมัดระวัง โดยไม่ทำลายหรือปล่อยให้เจลวุ้นวุ้นบางๆ ลอกออกจากแก้ว โดยใช้แหนบตาหรือเครื่องมืออื่นๆ

เตรียมจานเพาะเชื้อในลักษณะเดียวกัน โดยเติมวุ้นที่หลอมเหลว 10 - 15 ซม. 3 ลงไปเพื่อให้ได้ชั้นหนา 2-3 มม.

11.3 การดำเนินการศึกษา

ทันทีก่อนที่จะทำปฏิกิริยาเตรียมการเจือจางของซีรั่มต้านโรคพิษสุนัขบ้า (อิมมูโนโกลบูลิน) ซึ่งเติมสารละลายไอโซโทนิกโซเดียมคลอไรด์ 1.0 ซม. 3 ลงในหลอดทดลองสี่หลอด เติมซีรั่มต้านโรคพิษสุนัขบ้า 1.0 ซม. 3 ลงในหลอดทดลองแรก โดยเจือจาง 1: 2

ผสมและถ่ายโอนส่วนผสม 1.0 ซม. 3 ลงในหลอดทดลองที่สอง ฯลฯ ดังนั้นจะได้หลอดทดลองสี่หลอดที่มีการเจือจาง 1: 2.1: 4.1: 8 และ 1:16

8 หลุมที่เตรียมไว้มีส่วน 0.05 - 0.07 ซม. 3 ของตัวอย่างสมอง (แต่ละตัวอย่างเป็นหลุมแยก) ได้รับตาม 8.2.1 และการเจือจางของซีรั่มต้านโรคพิษสุนัขบ้าหรืออิมมูโนโกลบูลิน (1:2; 1:4; 1:8:1:16) ตามรูปที่ 1

รูปที่ 1 - รูปแบบการใช้วัสดุ

Ar - เขาของ Emmon; น. - ไขกระดูก oblongata; A+ - แอนติเจนควบคุมเชิงบวก; M - สมองน้อย; K - เปลือกสมอง; A- - แอนติเจนควบคุมเชิงลบ

เป็นไปได้ที่จะใช้รูปแบบอื่นในการแนะนำวัสดุ แต่ต้องใช้แอนติเจนที่เป็นบวกและลบ

วางสไลด์ที่มีวัสดุทดสอบในจานเพาะเชื้อที่มีก้นชุบน้ำหรือเครื่องดูดความชื้นแบบเปียก จากนั้นใส่เทอร์โมสตัทที่อุณหภูมิ (37 ± 1) * C เป็นเวลา 48 ชั่วโมง (จานเพาะเชื้อปิดฝาและวางใน เทอร์โมสตัท)

ปฏิกิริยาจะถูกนำมาพิจารณาหลังจาก 6.24 และ 48 ชั่วโมง

11.4 การจัดการผลลัพธ์

ปฏิกิริยานี้ถือเป็นผลบวกเมื่อแม้แนวการตกตะกอนของความเข้มข้นใดๆ ก็ตามปรากฏขึ้นระหว่างหลุมที่มีวัสดุทดสอบและซีรัมต้านโรคพิษสุนัขบ้า (อิมมูโนโกลบูลิน)

ในกรณีนี้ ควรสังเกตเส้นการตกตะกอนที่เห็นได้ชัดเจนระหว่างแอนติเจนที่เป็นบวกและซีรั่มต้านโรคพิษสุนัขบ้า (อิมมูโนโกลบูลิน) และไม่ควรมีเส้นตกตะกอนระหว่างแอนติเจนเชิงลบและซีรั่มต้านโรคพิษสุนัขบ้า (อิมมูโนโกลบูลิน)

ใน 8 กรณีของปฏิกิริยาเชิงบวก การวินิจฉัยจะถือว่าเป็นที่ยอมรับ ผลลัพธ์เชิงลบจะต้องได้รับการยืนยันด้วยวิธีอื่นตาม 7-10

บรรณานุกรม

EU Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products for Human and Veterinary Use

UDC 619:616.98:579.852.1:615371 MKS 11.220

คำสำคัญ: โรคพิษสุนัขบ้า การวินิจฉัย วิธีแอนติบอดีเรืองแสง เชื่อมโยงการทดสอบอิมมูโนดูดซับ, การทดสอบทางชีวภาพ, ปฏิกิริยาการตกตะกอนการแพร่กระจาย

ลงนามเผยแพร่เมื่อ 04/01/2014 รูปแบบ 60x84V

อูเอล พีวีซี ล. 1.40. หมุนเวียน 31 เท่ากับ แซค. 1363.

จัดทำขึ้นบนพื้นฐานของเวอร์ชันอิเล็กทรอนิกส์ที่จัดทำโดยผู้พัฒนามาตรฐาน

FSUE "มาตรฐาน"

123995 มอสโก เลนโกเมน 4

คำแนะนำวิธีการ
ห้องปฏิบัติการวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้า

1. การวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้าเกิดขึ้นจากข้อมูลที่ซับซ้อนของข้อมูลทาง epizootological ทางคลินิก พยาธิกายวิภาค และส่วนใหญ่อยู่บนพื้นฐานของการทดสอบในห้องปฏิบัติการ

2. สำหรับการวิจัย พวกเขาถูกส่งไปยังห้องปฏิบัติการโดยผู้จัดส่ง: ศพสดหรือหัวจากสุนัข (แมว, จิ้งจอก, จิ้งจอกอาร์กติก, แกะ, ลูกวัว ฯลฯ ) จากสัตว์ขนาดใหญ่ - หัวหรือสมอง (สดหรือกระป๋อง ในสารละลายกลีเซอรีน 30 - 50%) เฉพาะสมองที่ไม่ได้รับการรักษาเท่านั้นที่เหมาะสำหรับการศึกษาทางซีรัมวิทยา

3. การตรวจทางห้องปฏิบัติการของโรคพิษสุนัขบ้าประกอบด้วยการตรวจสมองด้วยกล้องจุลทรรศน์ (เพื่อตรวจหาร่างกาย Babes-Negri) การตรวจทางซีรั่ม (การตรวจหาแอนติเจนของโรคพิษสุนัขบ้า) รวมทั้งในการตั้งค่าการทดสอบทางชีววิทยากับหนูขาวหรือกระต่าย .

คำสั่งวิจัย

๔. จากสมองที่ได้รับการศึกษา เพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อก่อน ส่วนหนึ่งของสมองจะถูกนำไปใส่ในตู้เย็นทันทีและเก็บไว้ในกรณีที่จำเป็นต้องตรวจซ้ำ วัสดุถูกนำมาจากส่วนที่เหลือของสมองเพื่อการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ ปฏิกิริยาทางซีรั่ม และตัวอย่างทางชีววิทยา

บันทึก. การชันสูตรพลิกศพการกำจัดสมองและงานอื่น ๆ ดำเนินการภายใต้สภาวะปลอดเชื้อด้วยการปฏิบัติตามมาตรการป้องกันส่วนบุคคลอย่างเข้มงวด (การตรึงศีรษะของสัตว์อย่างแน่นหนาการป้องกันมือด้วยถุงมือสองคู่: การผ่าตัดและกายวิภาค สวมแว่นตา ปกป้องดวงตาและปิดจมูกและปากด้วยผ้ากอซ)

I. การศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์

5. สำหรับการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ รอยพิมพ์และรอยเปื้อนจะทำจากส่วนต่างๆ ของสมอง

6. เพื่อเตรียมรอยประทับ ชิ้นส่วนของสมอง (เขาแอมมอน, เปลือกสมอง, ซีรีเบลลัม, ไขกระดูก oblongata) วางบนกระดาษกรองพับ 4-6 ชั้น พื้นผิวที่ตัดถูกสัมผัสหลายครั้ง (3 - 4) ติดต่อกันด้วยสไลด์แก้วที่สะอาด กดเบา ๆ เพื่อให้มีรอยประทับบาง ๆ บนกระจก

7. รอยเปื้อนเกิดจากส่วนเดียวกันของสมอง ในการทำเช่นนี้ ชิ้นส่วนของสมองจะถูกบดในครกพอร์ซเลนด้วยสากหรือในหลอดทดลองที่มีแท่งแก้วจนเกิดมวลที่เป็นเนื้อเดียวกัน ซึ่งทำให้เกิดรอยเปื้อนหยาบๆ บนสไลด์แก้วที่รีดน้ำมันแล้ว

คุณสามารถทำรอยเปื้อนด้วยวิธีอื่น เมื่อต้องการทำเช่นนี้ สมองชิ้นเล็ก ๆ จะถูกวางบนขอบของสไลด์แก้ว และบดด้วยแก้วอีกใบแล้วทาจากขอบข้างหนึ่งไปอีกขอบหนึ่ง อันเป็นผลมาจากการที่ผิวของแผ่นแก้วบางๆ กระจก.

8. รอยเปื้อนหรือรอยพิมพ์ที่เกิดจากการย้อมสีด้วยวิธีใดวิธีหนึ่งต่อไปนี้:

ก) การย้อมสีตาม Muromtsev รอยเปื้อนหรือรอยพิมพ์ที่ทำขึ้นโดยที่ยังเปียกอยู่จะได้รับการแก้ไขทันทีในเอทิลหรือเมทิลแอลกอฮอล์หรือในส่วนผสมของแอลกอฮอล์ครึ่งหนึ่งกับอีเธอร์หรืออะซิโตน (บริสุทธิ์ทางเคมี) เป็นเวลา 1-2 ชั่วโมงแล้วล้างด้วยน้ำ ภาชนะสำหรับตรึงต้องปิดผนึกอย่างดีเพื่อป้องกันไม่ให้ของเหลวตรึงจากการระเหย หลังจากล้างด้วยน้ำแล้ว ให้ทาคราบเปียกในสารละลายของ Munson เป็นเวลา 5-10 นาที เจือจางด้วยน้ำ 1:40 จากนั้นสีจะถูกระบายออกและทันทีที่รอยเปื้อนถูกแช่ในสารละลายแทนนิน 10% ในน้ำเป็นเวลา 8-10 นาทีจนกระทั่งสีน้ำเงินปรากฏขึ้น หลังจากนั้นให้ล้างรอยเปื้อนด้วยน้ำ เช็ดให้แห้งด้วยกระดาษกรอง ผ่านส่วนผสมของแอลกอฮอล์ที่เท่ากันกับอะซิโตน (บริสุทธิ์ทางเคมี) หรือแอลกอฮอล์ที่มีไซลีน แล้วเช็ดให้แห้งด้วยกระดาษกรองอีกครั้ง คราบเปื้อนควรมีพื้นหลังสีฟ้าอ่อน ในขณะที่นิวเคลียสของเซลล์ประสาทจะเป็นสีน้ำเงิน และร่างกายของ Babesh-Negri เป็นสีม่วงซีดและมีสีคล้ำ

b) ผู้ขายเปื้อน ในการพิมพ์แบบเปียกหรือรอยเปื้อนที่เตรียมไว้ ให้ใช้ส่วนผสมของรีเอเจนต์ "A" 4 วินาที (เมทิลีนบลู - 2 กรัม เมทิลแอลกอฮอล์ที่ไม่มีอะซิโตน - 100 มล.) และรีเอเจนต์ "B" (ฟูชซินพื้นฐาน - 0.5 กรัม เอทิลแอลกอฮอล์ไร้ร่องรอย ของอะซิโตน - 100 มล.) สารละลายในการทำงานของสีย้อมประกอบด้วยรีเอเจนต์ "A" 15 มล., รีเอเจนต์ "B" 2 - 4 มล. และเมทิลแอลกอฮอล์ 25 มล. หลังจากการย้อมสีการเตรียมจะถูกล้างด้วยน้ำไหลและทำให้แห้ง ในรอยเปื้อน ไซโทพลาซึมของเซลล์ประสาทเป็นสีฟ้าสดใส นิวคลีโอลีเป็นสีน้ำเงินเข้ม เม็ดเลือดแดงเป็นสีแดงอิฐ ร่างกายของ Babesh-Negri เป็นสีม่วงแดงพร้อมโครงสร้างแบบเบสโซฟิลิกที่มองเห็นได้ชัดเจนของร่างกาย

c) การย้อมสีตาม Mikhin รอยเปื้อนหรือรอยพิมพ์ได้รับการแก้ไขในส่วนผสมของแอลกอฮอล์และอีเธอร์ (เท่ากัน) เป็นเวลา 5-10 นาทีหลังจากนั้นจะเช็ดให้แห้งด้วยกระดาษกรองและย้อมด้วยสี Giemsa เป็นเวลา 30-40 นาที (1-2 หยดต่อน้ำกลั่น 1 มล. ) ล้างอย่างรวดเร็วด้วยแอลกอฮอล์ที่เป็นกรด (กรดอะซิติกน้ำแข็ง 1 หยดต่อ 30 มล. ของแอลกอฮอล์ 96 °) จากนั้นใช้น้ำ เช็ดให้แห้งด้วยกระดาษกรองและอยู่ภายใต้การวิจัย หากวัสดุอยู่ในกลีเซอรีน ให้ล้างด้วยน้ำสะอาดล่วงหน้าแล้วเช็ดให้แห้งด้วยกระดาษกรอง

ในการเตรียมสี ภายใต้การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ พื้นหลังหลักควรเป็นสีแดงกับโทนสีม่วง ด้วยความเด่นของโทนสีน้ำเงิน สเมียร์จะถูกล้างอีกครั้งด้วยแอลกอฮอล์ที่เป็นกรดและล้างด้วยน้ำ เซลล์ประสาทพีระมิดมีสีฟ้าและมีนิวเคลียสสีดำอย่างเข้มข้น และร่างกายของ Babesh-Negri มีสีชมพูแดงและมีสีน้ำเงินเข้มประปราย

d) การย้อมสีตาม Bormann-Gainullina รอยเปื้อนหรือรอยพิมพ์บาง ๆ ได้รับการแก้ไขเป็นเวลา 5 นาทีในส่วนผสมขององค์ประกอบต่อไปนี้: แอลกอฮอล์และอีเธอร์ (เท่ากัน) - 98 มล., กรดอะซิติกน้ำแข็ง - 2 มล.; หลังจากตรึงพวกเขาจะแช่เป็นเวลา 5 นาทีในสารละลายคริสตัลลีน 10% แล้วล้างด้วยน้ำและทำให้แห้งในอากาศ รอยเปื้อนคงที่จะถูกย้อมเป็นเวลา 2 นาทีด้วยสีที่เตรียมไว้ก่อนการใช้งาน (สารละลายน้ำอิ่มตัวของเมทิลีนบลู - 3 หยด, สารละลายฟูชซินพื้นฐานอิ่มตัว - 2 หยด, น้ำประปา - 20 มล.) สารละลายสีถูกเทลงบนสเมียร์ จับจ้องที่เปลวไฟ จากนั้นสีจะถูกทิ้งไว้อีกนาทีหนึ่ง หลังจากนั้นล้างด้วยน้ำและเช็ดให้แห้งด้วยกระดาษกรอง ในรอยเปื้อน พื้นหลังหลักควรเป็นสีแดงสด โปรโตพลาสซึมของเซลล์ประสาทเป็นสีน้ำเงินอมแดง และนิวเคลียสของพวกมันเป็นสีน้ำเงินเข้ม ลำตัว Babes-Negri เป็นสีแดงสตรอเบอรี่ที่มีโครงสร้างเป็นเม็ดๆ เซลล์เม็ดเลือดแดงมีลักษณะเป็นวงกลมที่ไม่มีสี

ครั้งที่สอง การศึกษาทางเซรุ่มวิทยา

9. ปฏิกิริยาการตกตะกอนแบบกระจายในเจลวุ้น ปฏิกิริยานี้ใช้เพื่อตรวจหาแอนติเจนโรคพิษสุนัขบ้าที่จำเพาะในสมองที่ไม่ได้รับการรักษาของสัตว์ที่เสียชีวิตจากโรคพิษสุนัขบ้าตามท้องถนน เช่นเดียวกับในสัตว์ที่ทำการวิเคราะห์ทางชีวภาพ สำหรับปฏิกิริยานี้ คุณสามารถใช้สมองที่ค้าง (นานถึง 1 เดือน)

ปฏิกิริยาจะดำเนินการบนสไลด์หางซึ่ง 2.5 มล. ของเจลวุ้นละลายและทำให้เย็นถึง 60 ° C เตรียมตามสูตร: วุ้นแห้ง - 12 - 15 กรัม; โซเดียมคลอไรด์บริสุทธิ์ทางเคมี - 8.6 กรัม สารละลาย 1% (กรอง) ของเมทิลออเรนจ์ในแอลกอฮอล์ 50 ° - 5 - 10 มล. เมอร์ไทโอเลต - 0.01 กรัม น้ำกลั่น - 1 ลิตร

บันทึก. ในการตั้งค่าปฏิกิริยาควรใช้ Difko agar-agar ซึ่งละลายได้อย่างสมบูรณ์ไม่จำเป็นต้องกรองตัวกลาง วุ้นวุ้นชนิดอื่นๆ ต้องใช้การกรองอย่างระมัดระวัง

หลังจากที่วุ้นแข็งตัวแล้วจะทำรูในนั้นโดยใช้โลหะผนังบางหรือท่อแก้วที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 4-5 มม. จัดเรียงตามลายฉลุ (ดูรูปที่ -)

สำหรับปฏิกิริยาในสัตว์ขนาดใหญ่นั้นใช้ชิ้นส่วนของสมอง - เขาแอมมอน, เยื่อหุ้มสมองของซีกโลก, สมองน้อย, ไขกระดูก; ในหนู โกเฟอร์ หนูตะเภา, แฮมสเตอร์, ฯลฯ - สามส่วนของสมอง; หนูมีสมองทั้งหมด

รูปแบบการตั้งค่าไมโครตกตะกอน:
แต่ - เปลือกไม้ (ซีกซ้าย); ที่- เยื่อหุ้มสมอง (ซีกขวา); จาก- ฮอร์นแอมมอน (ซ้าย);
ดี- แตรแอมมอน (ขวา); อี- สมองน้อย; และ- ไขกระดูก;
1 , 2 , 3 , 4 - การเจือจางของโกลบูลินตามลำดับ 1:2, 1:4, 1:8, 1:16

RP ที่เป็นบวกพร้อมการเจือจางโกลบูลินทั้งหมด
(เปลือกสมองแกะ โรคพิษสุนัขบ้าข้างถนน)

RP ที่เป็นบวกพร้อมการเจือจางโกลบูลิน 1:4; 1:8, 1:16
(เขาหมาแอมมอน โรคพิษสุนัขบ้าข้างถนน)

RP ที่เป็นบวกพร้อมการเจือจางโกลบูลิน 1:16
ไม่มีสายฝนที่มีการเจือจาง 1:2, 1:4,
(สุนัขไขกระดูก oblongata, โรคพิษสุนัขบ้าข้างถนน)

สมองถูกบดในครกพอร์ซเลนด้วยสากหรือในกะโหลกศีรษะในตัวเองให้เป็น "น้ำพริก" ซึ่งเต็มไปด้วยหลุมสำหรับแอนติเจน หลุมที่เหลือจะเต็มไปด้วยโกลบูลินต้านโรคพิษสุนัขบ้าที่ตกตะกอนโดยเจือจาง 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 ปริมาณส่วนผสมที่ใช้คือ 0.02 มล.

ส่วนควบคุมที่มีแอนติเจนบวกและลบจะวางพร้อมกันบนสไลด์ที่แยกจากกันโดยใช้วุ้นเดียวกันโดยใช้ลายฉลุเดียวกัน

หลังจากใส่ส่วนผสมของปฏิกิริยาลงในหลุมที่เหมาะสม สไลด์แก้วจะถูกถ่ายโอนไปยังห้องที่มีความชื้น (จานเพาะเชื้อด้วยกระดาษกรองเปียกหรือสำลี) และวางไว้ในเทอร์โมสตัทเป็นเวลา 6 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37-38 °C จากนั้นวางจานไว้ที่อุณหภูมิห้องอีก 18 ชั่วโมง

การบัญชีสำหรับปฏิกิริยาจะดำเนินการ 3, 6 และ 24 ชั่วโมงหลังจากการตั้งค่า เพื่อป้องกันไม่ให้วุ้นแห้ง สไลด์ปฏิกิริยาจะถูกวางไว้ในจานเพาะเชื้อที่มีสำลีชุบหลังจากการดูแต่ละครั้ง

ด้วยปฏิกิริยาการตกตะกอนที่เป็นบวก เส้นหยาดน้ำฟ้าคู่ขนานหนึ่ง สอง และแทบจะแทบจะไม่เกิดขึ้นระหว่างบ่อที่มีโกลบูลินและแอนติเจน เส้นหยาดน้ำที่เป็นผลลัพธ์จะมองเห็นได้ชัดเจนเมื่อแว่นตาส่องสว่างด้วยไฟส่องสว่างจากด้านล่างขึ้นบนที่มุมประมาณ 45°

ด้วยข้อบ่งชี้เชิงลบของปฏิกิริยาการตกตะกอน จะทำการวิเคราะห์ทางชีวภาพ

10. ปฏิกิริยาอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ โดยอาศัยการตรวจหาโดยกล้องจุลทรรศน์พิเศษ (ML-1, ML-2, ML-3 เป็นต้น) ของแอนติเจนของไวรัสที่ทำปฏิกิริยากับเซรั่มต้านโรคพิษสุนัขบ้าที่ติดฉลากด้วยสีย้อมเรืองแสง

สำหรับปฏิกิริยาดังกล่าว ภาพพิมพ์บางและชั้นเท่ากันจะทำบนแก้วที่ล้างไขมันอย่างระมัดระวังจากสมองที่สดหรือแช่แข็ง รอยประทับถูกเตรียมจากชิ้นส่วนของสมอง (เขาของแอมมอน, เยื่อหุ้มสมอง, ซีรีเบลลัม, ไขกระดูก oblongata) ในลักษณะเดียวกับการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ มีการเตรียมการอย่างน้อย 4 อย่างจากสมองแต่ละส่วน สำหรับการควบคุม ยาก็ทำมาจากสมองของสัตว์ที่แข็งแรงเช่นเดียวกัน

หลังจากการอบแห้งในอากาศ การเตรียมจะถูกตรึงในอะซิโตนเป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่อุณหภูมิไม่เกิน 4 °C ภาชนะสำหรับตรึงต้องปิดผนึกอย่างดีเพื่อป้องกันไม่ให้ของเหลวตรึงจากการระเหย หลังจากแก้ไขด้วยอะซิโตน คอนจูเกตสองสามหยด (แกมมาโกลบูลินต่อต้านโรคพิษสุนัขบ้าเรืองแสง) จะถูกนำไปใช้กับการเตรียมการในการเจือจางการทำงาน จากนั้นนำไปวางไว้ในห้องที่มีความชื้น (จานเพาะเชื้อหรือคิวเวตต์เคลือบปิดที่มีก้นชุบ) เป็นเวลา 20 - 30 นาทีที่อุณหภูมิ 25 °C

หลังจากนั้น การเตรียมการจะถูกล้างด้วยน้ำหรือสารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (pH 7.2 - 7.4) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นล้างด้วยน้ำกลั่น ตากในอากาศ และอยู่ภายใต้การวิจัย การเตรียมการจะถูกดูภายใต้ระบบแช่ น้ำมันไม่เรืองแสงใช้สำหรับแช่

ในการเตรียมสี ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง เนื้อเยื่อสมองจะเรืองแสง (เรืองแสง) ด้วยสีเทาอมเหลืองหม่น ตรวจพบแอนติเจนของไวรัสพิษสุนัขบ้าในการเตรียมการในรูปของเม็ดสีเหลืองแกมเขียวหรือสีเขียวสดใสที่มีรูปร่างและขนาดต่าง ๆ ตั้งแต่แทบจะสังเกตไม่เห็นจนถึงมีเส้นผ่านศูนย์กลาง 15-20 ไมครอน

ในการเตรียมสารควบคุม จะไม่พบแกรนูลเรืองแสงสีเหลืองเขียวอย่างเข้มข้น

ในการศึกษาโดยใช้วิธีแอนติบอดีเรืองแสง การวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้าถือเป็นการพิสูจน์ ถ้าพบจำนวนเม็ดทั่วไปที่เพียงพอ (อย่างน้อย 10) ที่มีแสงสีเขียวสดใสขนาดต่างๆ ในมุมมองของกล้องจุลทรรศน์หลายด้าน ในการควบคุมการก่อตัวดังกล่าวไม่ควรจะเป็น

ในกรณีที่ไม่มีสารเรืองแสงเป็นบวก ให้วางตัวอย่างทางชีวภาพ

สาม. ตัวอย่างทางชีวภาพ

11. ทำการทดสอบทางชีววิทยาสำหรับโรคพิษสุนัขบ้าหากได้ผลลัพธ์เป็นลบในระหว่างการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ (ตรวจไม่พบร่างกายของ Babes-Negri) ด้วยปฏิกิริยาทางซีรั่ม (ตรวจไม่พบแอนติเจนโรคพิษสุนัขบ้าจำเพาะ) รวมทั้งเมื่อตรวจพบการรวมตัวที่ผิดปกติ การทดสอบทางชีววิทยาดำเนินการกับหนูขาวหรือกระต่าย

12. หนูทดลองหรือกระต่ายทดลองติดเชื้อด้วยสารแขวนลอย 10% จากสมองทดสอบในน้ำเกลือหรือน้ำซุปเนื้อเปปโตนที่มีค่า pH 7.2 - 7.4 ในการเตรียมสารแขวนลอยจะใช้ส่วนเดียวกันของสมองซึ่งเป็นวัสดุที่ใช้สำหรับการศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์และเซรุ่มวิทยา

ชิ้นส่วนของสมองที่ถูกตัดออกจะถูกรวบรวมในหลอดทดลองที่ปลอดเชื้อและชั่งน้ำหนัก จากนั้นบดให้ละเอียดในครกด้วยสาก หลังจากนั้นจึงเติมน้ำเกลือหรือน้ำซุปเนื้อเปปโตนเพื่อให้ได้สารแขวนลอย 10% สารแขวนลอยที่เป็นผลลัพธ์สามารถยืนได้ 10 นาทีและ supernatant ใช้สำหรับการติดเชื้อ

หากวัสดุทางพยาธิวิทยาปนเปื้อนสารเหนือตะกอนจะถูกเทลงในภาชนะอื่น (หลอดทดลอง) และเติมเพนิซิลลินและสเตรปโตมัยซิน 500-1,000 IU ต่อของเหลว 1 มล. หลังจากนั้นอนุญาตให้ยืนอีก 30 นาทีที่ อุณหภูมิห้องแล้วใช้สำหรับการติดเชื้อ การระงับต้องเตรียมภายใต้สภาวะปลอดเชื้อและปฏิบัติตามกฎการป้องกันส่วนบุคคลอย่างเคร่งครัด

การทดสอบทางชีวภาพของหนูขาว. สำหรับการติดเชื้อจะใช้หนูขาวที่มีน้ำหนัก 8-10 กรัม สำหรับแต่ละการศึกษามีหนู 6 ตัวซึ่ง 3 ตัวติดเชื้อในสมองและ 3 ตัว - ใต้ผิวหนัง เมื่อติดเชื้อในสมอง เข็มจะถูกสอดเข้าไปที่จุดหลังเส้นเชื่อมมุมด้านหลังและห่างจากเส้นที่อยู่ตรงกลางศีรษะเล็กน้อย บริเวณที่ติดเชื้อถูกเช็ดด้วยแอลกอฮอล์ ยาระงับความรู้สึกในขนาด 0.03 มล. เพื่อป้องกันการเจาะลึกของเข็มเข้าไปในสมอง จะมีการใส่ลิมิตเตอร์ไว้บนปลาย ซึ่งเป็นท่อยางชิ้นเล็ก ๆ ซึ่งติดอยู่ที่ระยะ 2-3 มม. จากปลายเข็ม ในกรณีที่มีการติดเชื้อใต้ผิวหนัง การฉีดสารแขวนลอยจะถูกฉีดเข้าไปในบริเวณปลายจมูก (ริมฝีปากบน) ในขนาด 0.05 มล. อาการบวมเล็กน้อยบริเวณที่ฉีด หนูที่ติดเชื้อจะถูกวางในขวดแก้วและสังเกตเป็นเวลา 30 วัน ที่ ผลลัพธ์ที่เป็นบวกตัวอย่างทางชีวภาพในหนู ปกติในวันที่ 7 - 15 หลังการติดเชื้อ คลินิกโรคพิษสุนัขบ้าเป็นอัมพาตจะพัฒนา

ในขั้นต้นจะสังเกตเห็นความเกียจคร้านเสื้อคลุมไม่เรียบร้อยและคนหลังค่อมรวมถึงการประสานงานของการเคลื่อนไหวที่บกพร่อง จากนั้นอัมพาตของขาหลังก็มาถึงและต่อมา - ด้านหน้ากลายเป็นอัมพาตทั่วไปและจบลงด้วยความตาย ระยะเวลาของโรคคือ 2-3 วัน

ด้วยการพัฒนาของอัมพาตทั่วไป หนูถูกสังเวยโดยใช้ยาสลบอีเธอร์หรือคลอโรฟอร์ม ในหนูที่ตายและตายช่องกะโหลกเปิดขึ้นสมองจะได้รับการฉีดวัคซีนในอาหารหลังจากนั้นจึงนำสมองออกซึ่งเตรียมการสำหรับการศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์และภูมิคุ้มกัน

ขาดเรียน อาการทางคลินิกโรคพิษสุนัขบ้าในหนูที่ติดเชื้อจะถูกทำลายภายใน 30 วัน โถที่เก็บไว้ได้รับการฆ่าเชื้ออย่างทั่วถึง

การทดสอบทางชีวภาพของกระต่าย. ในการตั้งค่าตัวอย่างทางชีวภาพ ให้นำกระต่าย 4 ตัวที่มีน้ำหนักอย่างน้อย 1.5 กก. มาแต่ละตัว กระต่าย 2 ตัวติดเชื้อในสมองและ 2 ตัวเข้ากล้ามเนื้อบริเวณต้นขา สารแขวนลอยจะถูกฉีดเข้าสมองในขนาด 0.2 มล. และฉีดเข้ากล้ามในขนาด 2 มล.

ด้วยผลการทดสอบทางชีววิทยาในเชิงบวก กระต่ายจะป่วยภายใน 16 ถึง 21 วัน โรคพิษสุนัขบ้าเกิดขึ้นในกระต่ายในรูปแบบเงียบด้วย ร้ายแรง. ในกระต่ายที่ตายแล้ว สมองจะถูกลบออกและทำการวิจัยเพิ่มเติมในลักษณะเดียวกับเมื่อติดเชื้อในหนู สังเกตกระต่ายเป็นเวลา 45-50 วัน หลังจากระยะเวลาที่กำหนด กระต่ายจะถูกทำลาย กรงที่เลี้ยงสัตว์ทดลองจะถูกฆ่าเชื้อ

IV. การตรวจเนื้อเยื่อ 1

1 การตรวจชิ้นเนื้อใช้เป็นวิธีการเพิ่มเติม

สำหรับการตรวจชิ้นเนื้อ นำชิ้นส่วนของเขา Ammon, cerebral cortex, cerebellum, medulla oblongata มาตรึงไว้ในอะซิโตนหนึ่งหรือสองส่วน เพื่อให้ระยะเวลาการตรึงอยู่ภายใน 6-18 ชั่วโมง

เป็นการดีกว่าที่จะปล่อยให้การตรึงในอะซิโตนค้างคืน จากนั้นวัสดุทางพยาธิวิทยาจะถูกส่งผ่านไซลีนสองส่วนโดยถือไว้ 30 นาทีในแต่ละส่วนและผ่านพาราฟินสองส่วน - 1 ชั่วโมง ส่วนที่พร้อมใช้งานจะถูกกำจัดพาราฟินด้วยวิธีปกติและย้อมสีตาม Lenz หรือ Turevich:

ระบายสีตาม Lenz ส่วนจะถูกย้อมด้วยสารละลาย eosin เป็นเวลา 1-3 นาที (ละลาย eosin 0.5 กรัมใน 100 มล. 60 ° เอทิลแอลกอฮอล์). Eosin ถูกชะล้างออกด้วยน้ำอย่างรวดเร็วและย้อมด้วยเมทิลีนบลูของ Lefleur เป็นเวลา 1 นาที ล้างด้วยน้ำ เช็ดให้แห้งด้วยกระดาษกรองอย่างระมัดระวัง และแยกความแตกต่างด้วยสารละลายของหน่วย ซึ่งโซเดียมในแอลกอฮอล์แน่นอน (โซดาไฟ 5 หยดต่อแอลกอฮอล์ 30 มล.) เป็นสีชมพูอ่อน สารละลายของกรดอะซิติกถูกเทลงบนการเตรียม (กรดอะซิติกน้ำแข็ง 1 หยดต่อแอลกอฮอล์ 60 มล.) และเก็บไว้จนเป็นสีน้ำเงินจาง ๆ ล้างออกด้วยแอลกอฮอล์อย่างรวดเร็วและล้างด้วยไซลีนเป็นเวลา 4-5 นาที ร่างกายของ Babesh-Negri นั้นมีสีแดงสดและมีสิ่งเจือปนสีน้ำเงิน ไซโตพลาสซึมของเซลล์ปมประสาทนั้นมีสีฟ้าซีด

ระบายสีตาม Turevich ส่วนที่ปราศจากพาราฟินทันทีหลังจากผ่านแอลกอฮอล์และน้ำกลั่นจะถูกย้อมด้วยฮีมาทอกซิลินของ Weigert หรือ Ehrlich ล้างด้วยน้ำกลั่น จากนั้นย้อมด้วยสารละลายกรดฟูชซินในน้ำ 1% เป็นเวลา 1 นาที แล้วล้างให้สะอาดด้วยน้ำกลั่นจนเป็นสีชมพูอ่อน หลังจากล้างแล้วจะได้รับการบำบัดด้วยส่วนผสม (ในส่วนเท่า ๆ กัน) ของสารละลายกรดปิคริกอิ่มตัว (กรดปิคริก 25-30 กรัมต่อน้ำกลั่นร้อน 1 ลิตร) และแอลกอฮอล์ 96% ในระหว่างการประมวลผลจะสังเกตเห็นการปล่อยเมฆสีแดงและส่วนต่างๆจะได้รับโทนสีเหลืองหลังจาก 10–20 วินาที ล้างส่วนต่างๆ อย่างรวดเร็วในน้ำและเช็ดให้แห้งด้วยกระดาษกรองเล็กน้อย จากนั้นอย่างรวดเร็วก็จะถูกส่งผ่านแอลกอฮอล์สัมบูรณ์หรือ 96 °คาร์โบลไซลีนไซลีนบริสุทธิ์และใส่ในบาล์ม ร่างกายของ Babesh-Negri เป็นสีแดงเชอร์รี่ นิวเคลียสของเซลล์เป็นสีดำหรือสีน้ำเงิน ขึ้นอยู่กับว่าฮีมาทอกซิลินที่ย้อมด้วยฮีมาทอกซีลิน รูปร่างและขนาดของร่างกายของ Babesh-Negri นั้นมีความหลากหลายมากพวกมันอยู่ในไซโตพลาสซึมและกระบวนการของเซลล์ประสาทในรูปแบบของสำเนาจำนวนมากหรือเดี่ยว บ่อยครั้งที่ร่างกายของ Babes-Negri ถูกพบในเซลล์ปมประสาทขนาดใหญ่ และเซลล์ที่มีพวกมันไม่มีสัญญาณของการเสื่อมสภาพที่เด่นชัด

มักพบสิ่งเจือปนอื่น ๆ ซึ่งเนื่องจากคุณสมบัติที่คล้ายคลึงกันหลายประการ บางครั้งจึงถูกเข้าใจผิดว่าเป็นร่างของเนกริ ควรระลึกไว้เสมอว่าสมองของแมวที่มีสุขภาพดีและหนูขาวในบางครั้งอาจมีร่างกายรวมกรดที่ไม่เฉพาะเจาะจง วัตถุเหล่านี้สามารถแยกความแตกต่างจากเนื้อ Negri ได้โดยไม่มีเม็ดภายในและความสม่ำเสมอของสารหลัก

โรคพิษสุนัขบ้ายังเป็นลักษณะอาการของโรคไข้สมองอักเสบเฉียบพลัน: ส่วนใหญ่อยู่รอบ ๆ เส้นเลือดเล็ก ๆ พบการแทรกซึมของ perivascular ซึ่งประกอบด้วยเซลล์น้ำเหลืองส่วนใหญ่ที่ดูเหมือนปิดปากเซลล์

ในเซลล์ปมประสาทของสมอง อาจมีโครมาโตไลซิส vacuolization และบวมเฉียบพลันของเซลล์ เช่นเดียวกับการตายของเซลล์แต่ละเซลล์ ในพื้นที่ของเซลล์ประสาทที่เสียหาย ปฏิกิริยาการงอกของเกลียจะค่อนข้างคงที่ โดยอยู่ในรูปแบบของเซลล์ประสาทที่แท้จริง ตามด้วยการเปลี่ยนเซลล์ประสาทด้วยองค์ประกอบของเกลียแบบทวีคูณ การสะสมของเซลล์ที่เพิ่มจำนวนดังกล่าวในบริเวณของเซลล์ประสาทที่แตกสลายเรียกว่า "ปมโรคพิษสุนัขบ้า" - บางครั้งสามารถติดตามกระบวนการของการพัฒนาปมในส่วนที่ (1) ได้

คำแนะนำวิธีการ
ห้องปฏิบัติการวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้า

1. การวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้าเกิดขึ้นจากข้อมูลที่ซับซ้อนของข้อมูลทาง epizootological ทางคลินิก พยาธิกายวิภาค และส่วนใหญ่อยู่บนพื้นฐานของการทดสอบในห้องปฏิบัติการ

2. สำหรับการวิจัย พวกเขาถูกส่งไปยังห้องปฏิบัติการโดยผู้จัดส่ง: ศพสดหรือหัวจากสุนัข (แมว, จิ้งจอก, จิ้งจอกอาร์กติก, แกะ, ลูกวัว ฯลฯ ) จากสัตว์ขนาดใหญ่ - หัวหรือสมอง (สดหรือกระป๋อง ในสารละลายกลีเซอรีน 30 - 50%) เฉพาะสมองที่ไม่ได้รับการรักษาเท่านั้นที่เหมาะสำหรับการศึกษาทางซีรัมวิทยา

3. การตรวจทางห้องปฏิบัติการของโรคพิษสุนัขบ้าประกอบด้วยการตรวจสมองด้วยกล้องจุลทรรศน์ (เพื่อตรวจหาร่างกาย Babes-Negri) การตรวจทางซีรั่ม (การตรวจหาแอนติเจนของโรคพิษสุนัขบ้า) รวมทั้งในการตั้งค่าการทดสอบทางชีววิทยากับหนูขาวหรือกระต่าย .

คำสั่งวิจัย

๔. จากสมองที่ได้รับการศึกษา เพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อก่อน ส่วนหนึ่งของสมองจะถูกนำไปใส่ในตู้เย็นทันทีและเก็บไว้ในกรณีที่จำเป็นต้องตรวจซ้ำ วัสดุถูกนำมาจากส่วนที่เหลือของสมองเพื่อการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ ปฏิกิริยาทางซีรั่ม และตัวอย่างทางชีววิทยา

บันทึก. การชันสูตรพลิกศพการกำจัดสมองและงานอื่น ๆ ดำเนินการภายใต้สภาวะปลอดเชื้อด้วยการปฏิบัติตามมาตรการป้องกันส่วนบุคคลอย่างเข้มงวด (การตรึงศีรษะของสัตว์อย่างแน่นหนาการป้องกันมือด้วยถุงมือสองคู่: การผ่าตัดและกายวิภาค สวมแว่นตา ปกป้องดวงตาและปิดจมูกและปากด้วยผ้ากอซ)

I. การศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์

5. สำหรับการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ รอยพิมพ์และรอยเปื้อนจะทำจากส่วนต่างๆ ของสมอง

6. เพื่อเตรียมรอยประทับ ชิ้นส่วนของสมอง (เขาแอมมอน, เปลือกสมอง, ซีรีเบลลัม, ไขกระดูก oblongata) วางบนกระดาษกรองพับ 4-6 ชั้น พื้นผิวที่ตัดถูกสัมผัสหลายครั้ง (3 - 4) ติดต่อกันด้วยสไลด์แก้วที่สะอาด กดเบา ๆ เพื่อให้มีรอยประทับบาง ๆ บนกระจก

7. รอยเปื้อนเกิดจากส่วนเดียวกันของสมอง ในการทำเช่นนี้ ชิ้นส่วนของสมองจะถูกบดในครกพอร์ซเลนด้วยสากหรือในหลอดทดลองที่มีแท่งแก้วจนเกิดมวลที่เป็นเนื้อเดียวกัน ซึ่งทำให้เกิดรอยเปื้อนหยาบๆ บนสไลด์แก้วที่รีดน้ำมันแล้ว

คุณสามารถทำรอยเปื้อนด้วยวิธีอื่น เมื่อต้องการทำเช่นนี้ สมองชิ้นเล็ก ๆ จะถูกวางบนขอบของสไลด์แก้ว และบดด้วยแก้วอีกใบแล้วทาจากขอบข้างหนึ่งไปอีกขอบหนึ่ง อันเป็นผลมาจากการที่ผิวของแผ่นแก้วบางๆ กระจก.

8. รอยเปื้อนหรือรอยพิมพ์ที่เกิดจากการย้อมสีด้วยวิธีใดวิธีหนึ่งต่อไปนี้:

ก) การย้อมสีตาม Muromtsev รอยเปื้อนหรือรอยพิมพ์ที่ทำขึ้นโดยที่ยังเปียกอยู่จะได้รับการแก้ไขทันทีในเอทิลหรือเมทิลแอลกอฮอล์หรือในส่วนผสมของแอลกอฮอล์ครึ่งหนึ่งกับอีเธอร์หรืออะซิโตน (บริสุทธิ์ทางเคมี) เป็นเวลา 1-2 ชั่วโมงแล้วล้างด้วยน้ำ ภาชนะสำหรับตรึงต้องปิดผนึกอย่างดีเพื่อป้องกันไม่ให้ของเหลวตรึงจากการระเหย หลังจากล้างด้วยน้ำแล้ว ให้ทาคราบเปียกในสารละลายของ Munson เป็นเวลา 5-10 นาที เจือจางด้วยน้ำ 1:40 จากนั้นสีจะถูกระบายออกและทันทีที่รอยเปื้อนถูกแช่ในสารละลายแทนนิน 10% ในน้ำเป็นเวลา 8-10 นาทีจนกระทั่งสีน้ำเงินปรากฏขึ้น หลังจากนั้นให้ล้างรอยเปื้อนด้วยน้ำ เช็ดให้แห้งด้วยกระดาษกรอง ผ่านส่วนผสมของแอลกอฮอล์ที่เท่ากันกับอะซิโตน (บริสุทธิ์ทางเคมี) หรือแอลกอฮอล์ที่มีไซลีน แล้วเช็ดให้แห้งด้วยกระดาษกรองอีกครั้ง คราบเปื้อนควรมีพื้นหลังสีฟ้าอ่อน ในขณะที่นิวเคลียสของเซลล์ประสาทจะเป็นสีน้ำเงิน และร่างกายของ Babesh-Negri เป็นสีม่วงซีดและมีสีคล้ำ

b) ผู้ขายเปื้อน ในการพิมพ์แบบเปียกหรือรอยเปื้อนที่เตรียมไว้ ให้ใช้ส่วนผสมของรีเอเจนต์ "A" 4 วินาที (เมทิลีนบลู - 2 กรัม เมทิลแอลกอฮอล์ที่ไม่มีอะซิโตน - 100 มล.) และรีเอเจนต์ "B" (ฟูชซินพื้นฐาน - 0.5 กรัม เอทิลแอลกอฮอล์ไร้ร่องรอย ของอะซิโตน - 100 มล.) สารละลายในการทำงานของสีย้อมประกอบด้วยรีเอเจนต์ "A" 15 มล., รีเอเจนต์ "B" 2 - 4 มล. และเมทิลแอลกอฮอล์ 25 มล. หลังจากการย้อมสีการเตรียมจะถูกล้างด้วยน้ำไหลและทำให้แห้ง ในรอยเปื้อน ไซโทพลาซึมของเซลล์ประสาทเป็นสีฟ้าสดใส นิวคลีโอลีเป็นสีน้ำเงินเข้ม เม็ดเลือดแดงเป็นสีแดงอิฐ ร่างกายของ Babesh-Negri เป็นสีม่วงแดงพร้อมโครงสร้างแบบเบสโซฟิลิกที่มองเห็นได้ชัดเจนของร่างกาย

c) การย้อมสีตาม Mikhin รอยเปื้อนหรือรอยพิมพ์ได้รับการแก้ไขในส่วนผสมของแอลกอฮอล์และอีเธอร์ (เท่ากัน) เป็นเวลา 5-10 นาทีหลังจากนั้นจะเช็ดให้แห้งด้วยกระดาษกรองและย้อมด้วยสี Giemsa เป็นเวลา 30-40 นาที (1-2 หยดต่อน้ำกลั่น 1 มล. ) ล้างอย่างรวดเร็วด้วยแอลกอฮอล์ที่เป็นกรด (กรดอะซิติกน้ำแข็ง 1 หยดต่อ 30 มล. ของแอลกอฮอล์ 96 °) จากนั้นใช้น้ำ เช็ดให้แห้งด้วยกระดาษกรองและอยู่ภายใต้การวิจัย หากวัสดุอยู่ในกลีเซอรีน ให้ล้างด้วยน้ำสะอาดล่วงหน้าแล้วเช็ดให้แห้งด้วยกระดาษกรอง

ในการเตรียมสี ภายใต้การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ พื้นหลังหลักควรเป็นสีแดงกับโทนสีม่วง ด้วยความเด่นของโทนสีน้ำเงิน สเมียร์จะถูกล้างอีกครั้งด้วยแอลกอฮอล์ที่เป็นกรดและล้างด้วยน้ำ เซลล์ประสาทพีระมิดมีสีฟ้าและมีนิวเคลียสสีดำอย่างเข้มข้น และร่างกายของ Babesh-Negri มีสีชมพูแดงและมีสีน้ำเงินเข้มประปราย

d) การย้อมสีตาม Bormann-Gainullina รอยเปื้อนหรือรอยพิมพ์บาง ๆ ได้รับการแก้ไขเป็นเวลา 5 นาทีในส่วนผสมขององค์ประกอบต่อไปนี้: แอลกอฮอล์และอีเธอร์ (เท่ากัน) - 98 มล., กรดอะซิติกน้ำแข็ง - 2 มล.; หลังจากตรึงพวกเขาจะแช่เป็นเวลา 5 นาทีในสารละลายคริสตัลลีน 10% แล้วล้างด้วยน้ำและทำให้แห้งในอากาศ รอยเปื้อนคงที่จะถูกย้อมเป็นเวลา 2 นาทีด้วยสีที่เตรียมไว้ก่อนการใช้งาน (สารละลายน้ำอิ่มตัวของเมทิลีนบลู - 3 หยด, สารละลายฟูชซินพื้นฐานอิ่มตัว - 2 หยด, น้ำประปา - 20 มล.) สารละลายสีถูกเทลงบนสเมียร์ จับจ้องที่เปลวไฟ จากนั้นสีจะถูกทิ้งไว้อีกนาทีหนึ่ง หลังจากนั้นล้างด้วยน้ำและเช็ดให้แห้งด้วยกระดาษกรอง ในรอยเปื้อน พื้นหลังหลักควรเป็นสีแดงสด โปรโตพลาสซึมของเซลล์ประสาทเป็นสีน้ำเงินอมแดง และนิวเคลียสของพวกมันเป็นสีน้ำเงินเข้ม ลำตัว Babes-Negri เป็นสีแดงสตรอเบอรี่ที่มีโครงสร้างเป็นเม็ดๆ เซลล์เม็ดเลือดแดงมีลักษณะเป็นวงกลมที่ไม่มีสี

ครั้งที่สอง การศึกษาทางเซรุ่มวิทยา

9. ปฏิกิริยาการตกตะกอนแบบกระจายในเจลวุ้น ปฏิกิริยานี้ใช้เพื่อตรวจหาแอนติเจนโรคพิษสุนัขบ้าที่จำเพาะในสมองที่ไม่ได้รับการรักษาของสัตว์ที่เสียชีวิตจากโรคพิษสุนัขบ้าตามท้องถนน เช่นเดียวกับในสัตว์ที่ทำการวิเคราะห์ทางชีวภาพ สำหรับปฏิกิริยานี้ คุณสามารถใช้สมองที่ค้าง (นานถึง 1 เดือน)

ปฏิกิริยาจะดำเนินการบนสไลด์แก้วหางซึ่ง 2.5 มล. ละลายและทำให้เย็นถึง 60 ° C วุ้นเจลเตรียมตามสูตร: วุ้นแห้ง - 12 - 15 กรัม; โซเดียมคลอไรด์บริสุทธิ์ทางเคมี - 8.6 กรัม สารละลาย 1% (กรอง) ของเมทิลออเรนจ์ในแอลกอฮอล์ 50 ° - 5 - 10 มล. เมอร์ไทโอเลต - 0.01 กรัม น้ำกลั่น - 1 ลิตร

บันทึก. ในการตั้งค่าปฏิกิริยาควรใช้ Difko agar-agar ซึ่งละลายได้อย่างสมบูรณ์ไม่จำเป็นต้องกรองตัวกลาง วุ้นวุ้นชนิดอื่นๆ ต้องใช้การกรองอย่างระมัดระวัง

หลังจากที่วุ้นแข็งตัวแล้วจะทำรูในนั้นโดยใช้โลหะผนังบางหรือท่อแก้วที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 4-5 มม. จัดเรียงตามลายฉลุ (ดูรูปที่ -)

สำหรับปฏิกิริยาในสัตว์ขนาดใหญ่นั้นใช้ชิ้นส่วนของสมอง - เขาแอมมอน, เยื่อหุ้มสมองของซีกโลก, สมองน้อย, ไขกระดูก; ในหนู, โกเฟอร์, หนูตะเภา, หนูแฮมสเตอร์, ฯลฯ - สมองสามส่วน; หนูมีสมองทั้งหมด

รูปแบบการตั้งค่าไมโครตกตะกอน:
แต่ - เปลือกไม้ (ซีกซ้าย); ที่- เห่า ( ซีกขวา); จาก- ฮอร์นแอมมอน (ซ้าย);
ดี- แตรแอมมอน (ขวา); อี- สมองน้อย; และ- ไขกระดูก;
1 , 2 , 3 , 4 - การเจือจางของโกลบูลินตามลำดับ 1:2, 1:4, 1:8, 1:16

RP ที่เป็นบวกพร้อมการเจือจางโกลบูลินทั้งหมด
(เปลือกสมองแกะ โรคพิษสุนัขบ้าข้างถนน)

RP ที่เป็นบวกพร้อมการเจือจางโกลบูลิน 1:4; 1:8, 1:16
(เขาหมาแอมมอน โรคพิษสุนัขบ้าข้างถนน)

RP ที่เป็นบวกพร้อมการเจือจางโกลบูลิน 1:16
ไม่มีสายฝนที่มีการเจือจาง 1:2, 1:4,
(สุนัขไขกระดูก oblongata, โรคพิษสุนัขบ้าข้างถนน)

สมองถูกบดในครกพอร์ซเลนด้วยสากหรือในกะโหลกศีรษะในตัวเองให้เป็น "น้ำพริก" ซึ่งเต็มไปด้วยหลุมสำหรับแอนติเจน หลุมที่เหลือจะเต็มไปด้วยโกลบูลินต้านโรคพิษสุนัขบ้าที่ตกตะกอนโดยเจือจาง 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 ปริมาณส่วนผสมที่ใช้คือ 0.02 มล.

ส่วนควบคุมที่มีแอนติเจนบวกและลบจะวางพร้อมกันบนสไลด์ที่แยกจากกันโดยใช้วุ้นเดียวกันโดยใช้ลายฉลุเดียวกัน

หลังจากใส่ส่วนผสมของปฏิกิริยาลงในหลุมที่เหมาะสม สไลด์แก้วจะถูกถ่ายโอนไปยังห้องที่มีความชื้น (จานเพาะเชื้อด้วยกระดาษกรองเปียกหรือสำลี) และวางไว้ในเทอร์โมสตัทเป็นเวลา 6 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37-38 °C จากนั้นวางจานไว้ที่อุณหภูมิห้องอีก 18 ชั่วโมง

การบัญชีสำหรับปฏิกิริยาจะดำเนินการ 3, 6 และ 24 ชั่วโมงหลังจากการตั้งค่า เพื่อป้องกันไม่ให้วุ้นแห้ง สไลด์ปฏิกิริยาจะถูกวางไว้ในจานเพาะเชื้อที่มีสำลีชุบหลังจากการดูแต่ละครั้ง

ด้วยปฏิกิริยาการตกตะกอนที่เป็นบวก เส้นหยาดน้ำฟ้าคู่ขนานหนึ่ง สอง และแทบจะแทบจะไม่เกิดขึ้นระหว่างบ่อที่มีโกลบูลินและแอนติเจน เส้นหยาดน้ำที่เป็นผลลัพธ์จะมองเห็นได้ชัดเจนเมื่อแว่นตาส่องสว่างด้วยไฟส่องสว่างจากด้านล่างขึ้นบนที่มุมประมาณ 45°

ด้วยข้อบ่งชี้เชิงลบของปฏิกิริยาการตกตะกอน จะทำการวิเคราะห์ทางชีวภาพ

10. ปฏิกิริยาอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ โดยอาศัยการตรวจหาโดยกล้องจุลทรรศน์พิเศษ (ML-1, ML-2, ML-3 เป็นต้น) ของแอนติเจนของไวรัสที่ทำปฏิกิริยากับเซรั่มต้านโรคพิษสุนัขบ้าที่ติดฉลากด้วยสีย้อมเรืองแสง

สำหรับปฏิกิริยาดังกล่าว ภาพพิมพ์บางและชั้นเท่ากันจะทำบนแก้วที่ล้างไขมันอย่างระมัดระวังจากสมองที่สดหรือแช่แข็ง รอยประทับถูกเตรียมจากชิ้นส่วนของสมอง (เขาของแอมมอน, เยื่อหุ้มสมอง, ซีรีเบลลัม, ไขกระดูก oblongata) ในลักษณะเดียวกับการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ มีการเตรียมการอย่างน้อย 4 อย่างจากสมองแต่ละส่วน สำหรับการควบคุม ยาก็ทำมาจากสมองของสัตว์ที่แข็งแรงเช่นเดียวกัน

หลังจากการอบแห้งในอากาศ การเตรียมจะถูกตรึงในอะซิโตนเป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่อุณหภูมิไม่เกิน 4 °C ภาชนะสำหรับตรึงต้องปิดผนึกอย่างดีเพื่อป้องกันไม่ให้ของเหลวตรึงจากการระเหย หลังจากแก้ไขด้วยอะซิโตน คอนจูเกตสองสามหยด (แกมมาโกลบูลินต่อต้านโรคพิษสุนัขบ้าเรืองแสง) จะถูกนำไปใช้กับการเตรียมการในการเจือจางการทำงาน จากนั้นนำไปวางไว้ในห้องที่มีความชื้น (จานเพาะเชื้อหรือคิวเวตต์เคลือบปิดที่มีก้นชุบ) เป็นเวลา 20 - 30 นาทีที่อุณหภูมิ 25 °C

หลังจากนั้น การเตรียมการจะถูกล้างด้วยน้ำหรือสารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (pH 7.2 - 7.4) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นล้างด้วยน้ำกลั่น ตากในอากาศ และอยู่ภายใต้การวิจัย การเตรียมการจะถูกดูภายใต้ระบบแช่ น้ำมันไม่เรืองแสงใช้สำหรับแช่

ในการเตรียมสี ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง เนื้อเยื่อสมองจะเรืองแสง (เรืองแสง) ด้วยสีเทาอมเหลืองหม่น ตรวจพบแอนติเจนของไวรัสพิษสุนัขบ้าในการเตรียมการในรูปของเม็ดสีเหลืองแกมเขียวหรือสีเขียวสดใสที่มีรูปร่างและขนาดต่าง ๆ ตั้งแต่แทบจะสังเกตไม่เห็นจนถึงมีเส้นผ่านศูนย์กลาง 15-20 ไมครอน

ในการเตรียมสารควบคุม จะไม่พบแกรนูลเรืองแสงสีเหลืองเขียวอย่างเข้มข้น

ในการศึกษาโดยใช้วิธีแอนติบอดีเรืองแสง การวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้าถือเป็นการพิสูจน์ ถ้าพบจำนวนเม็ดทั่วไปที่เพียงพอ (อย่างน้อย 10) ที่มีแสงสีเขียวสดใสขนาดต่างๆ ในมุมมองของกล้องจุลทรรศน์หลายด้าน ในการควบคุมการก่อตัวดังกล่าวไม่ควรจะเป็น

ในกรณีที่ไม่มีสารเรืองแสงเป็นบวก ให้วางตัวอย่างทางชีวภาพ

สาม. ตัวอย่างทางชีวภาพ

11. ทำการทดสอบทางชีววิทยาสำหรับโรคพิษสุนัขบ้าหากได้ผลลัพธ์เป็นลบในระหว่างการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ (ตรวจไม่พบร่างกายของ Babes-Negri) ด้วยปฏิกิริยาทางซีรั่ม (ตรวจไม่พบแอนติเจนโรคพิษสุนัขบ้าจำเพาะ) รวมทั้งเมื่อตรวจพบการรวมตัวที่ผิดปกติ การทดสอบทางชีววิทยาดำเนินการกับหนูขาวหรือกระต่าย

12. หนูทดลองหรือกระต่ายทดลองติดเชื้อด้วยสารแขวนลอย 10% จากสมองทดสอบในน้ำเกลือหรือน้ำซุปเนื้อเปปโตนที่มีค่า pH 7.2 - 7.4 ในการเตรียมสารแขวนลอยจะใช้ส่วนเดียวกันของสมองซึ่งเป็นวัสดุที่ใช้สำหรับการศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์และเซรุ่มวิทยา

ชิ้นส่วนของสมองที่ถูกตัดออกจะถูกรวบรวมในหลอดทดลองที่ปลอดเชื้อและชั่งน้ำหนัก จากนั้นบดให้ละเอียดในครกด้วยสาก หลังจากนั้นจึงเติมน้ำเกลือหรือน้ำซุปเนื้อเปปโตนเพื่อให้ได้สารแขวนลอย 10% สารแขวนลอยที่เป็นผลลัพธ์สามารถยืนได้ 10 นาทีและ supernatant ใช้สำหรับการติดเชื้อ

หากวัสดุทางพยาธิวิทยาปนเปื้อนสารเหนือตะกอนจะถูกเทลงในภาชนะอื่น (หลอดทดลอง) และเติมเพนิซิลลินและสเตรปโตมัยซิน 500-1,000 IU ต่อของเหลว 1 มล. หลังจากนั้นอนุญาตให้ยืนอีก 30 นาทีที่ อุณหภูมิห้องแล้วใช้สำหรับการติดเชื้อ การระงับต้องเตรียมภายใต้สภาวะปลอดเชื้อและปฏิบัติตามกฎการป้องกันส่วนบุคคลอย่างเคร่งครัด

การทดสอบทางชีวภาพของหนูขาว. สำหรับการติดเชื้อจะใช้หนูขาวที่มีน้ำหนัก 8-10 กรัม สำหรับแต่ละการศึกษามีหนู 6 ตัวซึ่ง 3 ตัวติดเชื้อในสมองและ 3 ตัว - ใต้ผิวหนัง เมื่อติดเชื้อในสมอง เข็มจะถูกสอดเข้าไปที่จุดหลังเส้นเชื่อมมุมด้านหลังและห่างจากเส้นที่อยู่ตรงกลางศีรษะเล็กน้อย บริเวณที่ติดเชื้อถูกเช็ดด้วยแอลกอฮอล์ ยาระงับความรู้สึกในขนาด 0.03 มล. เพื่อป้องกันการเจาะลึกของเข็มเข้าไปในสมอง จะมีการใส่ลิมิตเตอร์ไว้บนปลาย ซึ่งเป็นท่อยางชิ้นเล็ก ๆ ซึ่งติดอยู่ที่ระยะ 2-3 มม. จากปลายเข็ม ที่ การติดเชื้อใต้ผิวหนังการฉีดสารแขวนลอยเข้าไปในบริเวณปลายจมูก (ริมฝีปากบน) ในขนาด 0.05 มล. อาการบวมเล็กน้อยบริเวณที่ฉีด หนูที่ติดเชื้อจะถูกวางในขวดแก้วและสังเกตเป็นเวลา 30 วัน ด้วยผลบวกของการทดสอบทางชีววิทยาในหนูทดลอง โดยปกติในวันที่ 7 - 15 หลังการติดเชื้อ คลินิกโรคพิษสุนัขบ้าเป็นอัมพาตจึงพัฒนาขึ้น

ในขั้นต้นจะสังเกตเห็นความเกียจคร้านเสื้อคลุมไม่เรียบร้อยและคนหลังค่อมรวมถึงการประสานงานของการเคลื่อนไหวที่บกพร่อง จากนั้นอัมพาตของขาหลังก็มาถึงและต่อมา - ด้านหน้ากลายเป็นอัมพาตทั่วไปและจบลงด้วยความตาย ระยะเวลาของโรคคือ 2-3 วัน

ด้วยการพัฒนาของอัมพาตทั่วไป หนูถูกสังเวยโดยใช้ยาสลบอีเธอร์หรือคลอโรฟอร์ม ในหนูที่ตายและตายช่องกะโหลกเปิดขึ้นสมองจะได้รับการฉีดวัคซีนในอาหารหลังจากนั้นจึงนำสมองออกซึ่งเตรียมการสำหรับการศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์และภูมิคุ้มกัน

ในกรณีที่ไม่มีอาการทางคลินิกของโรคพิษสุนัขบ้าในหนูที่ติดเชื้อ จะถูกทำลายภายใน 30 วัน โถที่เก็บไว้ได้รับการฆ่าเชื้ออย่างทั่วถึง

การทดสอบทางชีวภาพของกระต่าย. ในการตั้งค่าตัวอย่างทางชีวภาพ ให้นำกระต่าย 4 ตัวที่มีน้ำหนักอย่างน้อย 1.5 กก. มาแต่ละตัว กระต่าย 2 ตัวติดเชื้อในสมองและ 2 ตัวเข้ากล้ามเนื้อบริเวณต้นขา สารแขวนลอยจะถูกฉีดเข้าสมองในขนาด 0.2 มล. และฉีดเข้ากล้ามในขนาด 2 มล.

ด้วยผลการทดสอบทางชีววิทยาในเชิงบวก กระต่ายจะป่วยภายใน 16 ถึง 21 วัน โรคพิษสุนัขบ้าเกิดขึ้นในกระต่ายในรูปแบบอัมพาตเงียบโดยมีผลร้ายแรง ในกระต่ายที่ตายแล้ว สมองจะถูกลบออกและทำการวิจัยเพิ่มเติมในลักษณะเดียวกับเมื่อติดเชื้อในหนู สังเกตกระต่ายเป็นเวลา 45-50 วัน หลังจากระยะเวลาที่กำหนด กระต่ายจะถูกทำลาย กรงที่เลี้ยงสัตว์ทดลองจะถูกฆ่าเชื้อ

IV. การตรวจเนื้อเยื่อ 1

1 การตรวจชิ้นเนื้อใช้เป็นวิธีการเพิ่มเติม

สำหรับการตรวจชิ้นเนื้อ นำชิ้นส่วนของเขา Ammon, cerebral cortex, cerebellum, medulla oblongata มาตรึงไว้ในอะซิโตนหนึ่งหรือสองส่วน เพื่อให้ระยะเวลาการตรึงอยู่ภายใน 6-18 ชั่วโมง

เป็นการดีกว่าที่จะปล่อยให้การตรึงในอะซิโตนค้างคืน จากนั้นวัสดุทางพยาธิวิทยาจะถูกส่งผ่านไซลีนสองส่วนโดยถือไว้ 30 นาทีในแต่ละส่วนและผ่านพาราฟินสองส่วน - 1 ชั่วโมง ส่วนที่พร้อมใช้งานจะถูกกำจัดพาราฟินด้วยวิธีปกติและย้อมสีตาม Lenz หรือ Turevich:

ระบายสีตาม Lenz ส่วนจะถูกย้อมด้วยสารละลายอีโอซินเป็นเวลา 1-3 นาที (อีโอซิน 0.5 กรัมละลายในเอทิลแอลกอฮอล์ 60% 100 มล.) Eosin ถูกชะล้างออกด้วยน้ำอย่างรวดเร็วและย้อมด้วยเมทิลีนบลูของ Lefleur เป็นเวลา 1 นาที ล้างด้วยน้ำ เช็ดให้แห้งด้วยกระดาษกรองอย่างระมัดระวัง และแยกความแตกต่างด้วยสารละลายของหน่วย ซึ่งโซเดียมในแอลกอฮอล์แน่นอน (โซดาไฟ 5 หยดต่อแอลกอฮอล์ 30 มล.) เป็นสีชมพูอ่อน สารละลายของกรดอะซิติกถูกเทลงบนการเตรียม (กรดอะซิติกน้ำแข็ง 1 หยดต่อแอลกอฮอล์ 60 มล.) และเก็บไว้จนเป็นสีน้ำเงินจาง ๆ ล้างออกด้วยแอลกอฮอล์อย่างรวดเร็วและล้างด้วยไซลีนเป็นเวลา 4-5 นาที ร่างกายของ Babesh-Negri นั้นมีสีแดงสดและมีสิ่งเจือปนสีน้ำเงิน ไซโตพลาสซึมของเซลล์ปมประสาทนั้นมีสีฟ้าซีด

ระบายสีตาม Turevich ส่วนที่ปราศจากพาราฟินทันทีหลังจากผ่านแอลกอฮอล์และน้ำกลั่นจะถูกย้อมด้วยฮีมาทอกซิลินของ Weigert หรือ Ehrlich ล้างด้วยน้ำกลั่น จากนั้นย้อมด้วยสารละลายกรดฟูชซินในน้ำ 1% เป็นเวลา 1 นาที แล้วล้างให้สะอาดด้วยน้ำกลั่นจนเป็นสีชมพูอ่อน หลังจากล้างแล้วจะได้รับการบำบัดด้วยส่วนผสม (ในส่วนเท่า ๆ กัน) ของสารละลายกรดปิคริกอิ่มตัว (กรดปิคริก 25-30 กรัมต่อน้ำกลั่นร้อน 1 ลิตร) และแอลกอฮอล์ 96% ในระหว่างการประมวลผลจะสังเกตเห็นการปล่อยเมฆสีแดงและส่วนต่างๆจะได้รับโทนสีเหลืองหลังจาก 10–20 วินาที ล้างส่วนต่างๆ อย่างรวดเร็วในน้ำและเช็ดให้แห้งด้วยกระดาษกรองเล็กน้อย จากนั้นอย่างรวดเร็วก็จะถูกส่งผ่านแอลกอฮอล์สัมบูรณ์หรือ 96 °คาร์โบลไซลีนไซลีนบริสุทธิ์และใส่ในบาล์ม ร่างกายของ Babesh-Negri เป็นสีแดงเชอร์รี่ นิวเคลียสของเซลล์เป็นสีดำหรือสีน้ำเงิน ขึ้นอยู่กับว่าฮีมาทอกซิลินที่ย้อมด้วยฮีมาทอกซีลิน รูปร่างและขนาดของร่างกายของ Babesh-Negri นั้นมีความหลากหลายมากพวกมันอยู่ในไซโตพลาสซึมและกระบวนการของเซลล์ประสาทในรูปแบบของสำเนาจำนวนมากหรือเดี่ยว บ่อยครั้งที่ร่างกายของ Babes-Negri ถูกพบในเซลล์ปมประสาทขนาดใหญ่ และเซลล์ที่มีพวกมันไม่มีสัญญาณของการเสื่อมสภาพที่เด่นชัด

มักพบสิ่งเจือปนอื่น ๆ ซึ่งเนื่องจากคุณสมบัติที่คล้ายคลึงกันหลายประการ บางครั้งจึงถูกเข้าใจผิดว่าเป็นร่างของเนกริ ควรระลึกไว้เสมอว่าสมองของแมวที่มีสุขภาพดีและหนูขาวในบางครั้งอาจมีร่างกายรวมกรดที่ไม่เฉพาะเจาะจง วัตถุเหล่านี้สามารถแยกความแตกต่างจากเนื้อ Negri ได้โดยไม่มีเม็ดภายในและความสม่ำเสมอของสารหลัก

โรคพิษสุนัขบ้ายังเป็นลักษณะอาการของโรคไข้สมองอักเสบเฉียบพลัน: ส่วนใหญ่อยู่รอบ ๆ เส้นเลือดเล็ก ๆ พบการแทรกซึมของ perivascular ซึ่งประกอบด้วยเซลล์น้ำเหลืองส่วนใหญ่ที่ดูเหมือนปิดปากเซลล์

ในเซลล์ปมประสาทของสมอง อาจมีโครมาโตไลซิส vacuolization และบวมเฉียบพลันของเซลล์ เช่นเดียวกับการตายของเซลล์แต่ละเซลล์ ในพื้นที่ของเซลล์ประสาทที่เสียหาย ปฏิกิริยาการงอกของเกลียจะค่อนข้างคงที่ โดยอยู่ในรูปแบบของเซลล์ประสาทที่แท้จริง ตามด้วยการเปลี่ยนเซลล์ประสาทด้วยองค์ประกอบของเกลียแบบทวีคูณ การสะสมของเซลล์ที่เพิ่มจำนวนดังกล่าวในบริเวณของเซลล์ประสาทที่แตกสลายเรียกว่า "ปมโรคพิษสุนัขบ้า" - บางครั้งสามารถติดตามกระบวนการของการพัฒนาปมในส่วนที่ (1) ได้