Vraćanje nanobakterija u njihov izvorni oblik. L-oblik bakterija. Raznolikost sustava regulacije biofilma

Uvod

Znanstvenici su stoljećima proučavali mikrobne populacije i mehanizme njihovog formiranja, a tek krajem prošlog stoljeća susreli su se s posebnim oblikom organizacije bakterijskih kultura - zajednicom mikroorganizama koji mogu kolonizirati objekte iz okoliša i postojati ne samo u obliku mikroplanktona, ali i specifično organiziranih biofilmova. Biofilmovi su pokretne heterogene zajednice koje se stalno mijenjaju (Chebotar, 2012.), koje mogu formirati bakterije jedne ili više vrsta, a sastoje se kako od aktivno funkcionalnih stanica tako i od onih uspavanih ili nekultiviranih. Formiranje takvih visoko specijaliziranih zajednica jedna je od glavnih strategija preživljavanja bakterijskih kultura ne samo u okolišu, već iu ljudskom tijelu. Općenito, biofilmovi su skupina mikrobnih stanica okruženih debelim, makromolekularnim slojem sluzi.

Mehanizam stvaranja biofilma

Mikroorganizmi obično postoje kao slobodno plutajuće mase ili pojedinačne kolonije, no neki predstavnici bakterijskog carstva imaju tendenciju pričvrstiti se za određenu površinsku podlogu i formirati biofilm, čiji je mehanizam stvaranja složen, strogo reguliran i uključuje četiri uzastopna stupnja.

Faza 1: reverzibilno (primarno) pričvršćivanje na površinu. Prvi stadij stvaranja biofilma karakterizira reverzibilna adhezija povezana s djelovanjem nespecifičnih fizikalno-kemijskih sila između molekula i struktura na površini mikroorganizama (elementi stanične stijenke, bičevi, pili) i čvrstog supstrata uslijed različitih interakcija: van der Waals, hidrofobni, ionski, elektrostatički;

Faza 2: nepovratno pričvršćivanje na površinu. Nakon adsorpcije, bakterijska stanica se kreće po površini supstrata, čvrsto se vežući za njega preko faktora adhezije, kao i uz pomoć nepolimernih adhezina, koji razlikuju strukturne elemente površine tkiva domaćina - kolagen, elastin, glikoproteine. , hijaluronska kiselina. U istoj fazi, osim jake vezanosti za supstrat, postoje: gubitak pokretljivosti bakterija, međustanične interakcije, izmjena gena između mikroorganizama i jednog i različiti tipovi.

Faza 3: sazrijevanje - sazrijevanje 1 . Nakon što se čvrsto pričvrste za supstrat i razmijene gene, pričvršćene bakterije počinju sintetizirati egzopolisaharid koji okružuje matriks poznat kao izvanstanična polimerna tvar ( izvanstanični polimerni tvar), koja je zaštitna “sluz” i čini 85% cjelokupnog zrelog biofilma (Chebotar, 2012; Frolova, 2015). Ova matrica potiče stvaranje početnog biofilma iz malih bakterijskih kolonija. Komponente egzopolisaharida variraju ovisno o tome koji su mikroorganizmi njegov dio.

Faza 4: rast - sazrijevanje 2 . U ovoj fazi nastaje zreli biofilm, nakon čega dolazi vrijeme za sekundarne kolonizatore, odnosno stanice koje se vežu za bakterije koje su već lokalizirane na površini (Afinogenova, 2011).

Zreli biofilmovi sposobni su izgubiti pojedinačne fragmente koji se, šireći se kroz makroorganizam, vežu za podloge i tvore nove biofilmove. Osim toga, bakterije se ne dijele u zrelim biofilmovima, jer su okružene gustim matriksom i zadržavaju visoku sposobnost preživljavanja.

Stvaranje biofilma je prilično brzo. Pričvršćivanje bakterija jedna na drugu događa se za nekoliko minuta, čvrsto vezane kolonije stvaraju se za 2-4 sata, a proizvodnja izvanstanične polimerne tvari događa se za 6-12 sati, nakon čega bakterije koje tvore biofilm postaju uglavnom tolerantne na antibiotici, dezinficijensi, antiseptici. Osim toga, biofilmovi se brzo oporavljaju nakon mehaničkog utjecaja (Chebotar, 2012).

Ultrastruktura biofilma

Ultrastruktura biofilma utvrđena je pomoću konfokalne skenirajuće laserske mikroskopije. Izvanstanični matriks mikrobnih stanica ima specifičnu strukturu i tvore ga trodimenzionalne gljivaste ili stupaste strukture. Egzopolisaharid koji se oslobađa u fazi sazrijevanja biofilma predstavljen je dvoslojnim heteropolisaharidom, koji je univerzalan za svaku vrstu mikroorganizama. Njegov vanjski sloj sadrži polisaharide u hidratiziranom stanju (dekstran, hijaluronska kiselina, celuloza), a unutarnji sloj je ispunjen membranskim vezikulama koje mogu djelovati kao faktori patogenosti (takve vezikule sadrže alkalnu fosfatazu C, proteaze, lizozim). Tvari vezikula također obavljaju funkciju lize oslabljenih bakterijske stanice, čiji su fragmenti nadalje faktor rasta i izvor prehrane za preostale članove biofilma.

Sve komponente matriksa razdvojene su kanalima kroz koje se odvija transport hranjivih tvari i kisika, kao i otpuštanje krajnjih produkata metabolizma bakterijskih stanica. Površinske strukture, ramnolipidi, koji se sastoje od mješavine polisaharida, proteina, nukleinskih kiselina i drugih tvari, odgovorne su za formiranje i održavanje takvih transportnih kanala.

Matrica biofilma također sadrži izvanstaničnu DNA koja je uključena u procese adhezije, međustanične interakcije te određuje specifičnosti postojanja zajednica biofilma (Tez, 2012.).

Morfologija stanica koje čine biofilm

Elektronskim mikroskopom utvrđeno je da rani stadiji stvaranjem biofilma, morfologija mikroorganizama se ne mijenja (Frolova, 2015). U sljedećim, kasnijim fazama, bakterijske strukture dobivaju morfološku specifičnost povezanu s pripojenim stanjem i kolektivnim suživotom. Osim toga, stanice u biofilmu zamjenjuju se površinskim strukturama, povećava se učestalost razmjene genetskog materijala između jedinki u zajednici, a ultrastrukturna organizacija se deformira.

Svojstva i uloga u zaštiti populacija bakterija

Biofilmovi su jedan od najznačajnijih čimbenika zaštite, značajno povećavaju otpornost bakterija na stresne situacije (nedostatak kisika i hranjivih tvari tijekom gladovanja), na čimbenike imunološki sustav ljudsko tijelo, na djelovanje vanjskih uvjeta (antibiotici, dezinficijensi, sterilizacija). Takva tolerancija pridonosi stjecanju apsolutne otpornosti na čimbenike koji bi mogli uništiti bakterije da su u slobodnom stanju.

Zaštitna uloga biofilma sastoji se u sljedećim svojstvima:

1. Svojstvo barijere. Biofilmovi sprječavaju duboko prodiranje velikih molekula i stanica koje uzrokuju upalu u njihovu matricu te služe kao difuzna barijera za male antimikrobne agense;
2. Ukupna zaštitna svojstva. Bakterije (iste i različite vrste) sposobne su izmjenjivati ​​zaštitne čimbenike (produkte metabolizma ili gene), odnosno provoditi međusobnu zaštitu. Dakle, bakterije jedne vrste koje su rezistentne na antibiotike mogu prenijeti gene odgovorne za rezistenciju na bakterije druge vrste koje su osjetljive na ovaj antibiotik, čime se povećava njihova otpornost na djelovanje faktora;
3. Svojstvo razmjene koje osigurava prijenos gena i otpadnih produkata između mikroorganizama koji su dio istog biofilma (Chebotar, 2012; Tets, 2012);
4. Svojstvo neaktivnosti, odnosno stvaranje nepokretnih (neaktivnih, nemetabolizirajućih, uspavanih) subpopulacija ključno je svojstvo svojstveno isključivo biofilmovima. Da bi antibiotik djelovao na mikroorganizam mora biti metabolički aktivan. Stoga su neaktivne bakterije u biofilmu najotpornije na takve utjecaje (Tets, 2012; Frolova, 2015).

Raznolikost sustava regulacije biofilma

Stanice u izvanstaničnom matriksu imaju « osjećaj kvoruma" ( kvorum osjetivši) - sposobnost prijenosa informacija i reguliranja njihovog ponašanja zbog lučenja signalnih molekula. Drugim riječima, to je regulatorni sustav smješten unutar biofilma. Poznata su tri sustava koji se međusobno razlikuju po prirodi autoinduktora:

1. Koriste ga uglavnom gram-negativne bakterije, a acilirani homoserin lakton djeluje kao signalna molekula, koja se veže na regulatorni protein koji stupa u interakciju s dva regulatorna enzima – luciferazom i homoserin-lakton-sintazom. Aktivacija regulatornih proteina inducira stvaranje nakupina biofilma kod mikroba (Tets, 2012; Turkutyukov, 2013).
2. Karakterističan je za gram-pozitivne bakterije i funkcionira pomoću linearnih i cikličkih oblika peptida, furana, laktona, njihovih derivata koji se izlučuju u vanjski okoliš. Neki od njih stupaju u interakciju sa senzornim kinazama koje se vežu na membranu, koje provode signal kroz membranu, dok se drugi transportiraju u stanicu pomoću permeaza, gdje se vežu na unutarstanične receptore. Signalni mehanizam takvih sustava je kaskada fosforilacije-defosforilacije. Informacijske molekule međusobno djeluju s dvokomponentnim sustavima, koji uključuju signalnu protein kinazu povezanu s membranom. Kinaza detektira glasnički peptid, a zatim fosforilira i aktivira regulatorni protein koji se veže na DNK i regulira transkripciju. Signalni peptidi ovog sustava kodirani su u kromosomu, dok su receptorski proteini kodirani u plazmidima. Tako se uz pomoć takve komunikacije translociraju plazmidi koji nose gene za rezistenciju na antibiotike, gene za hemolizine, bakteriocine i gene virulencije.
3. Javlja se u svim mikroorganizmima, a signalne molekule predstavljaju butirolakton, kinol, hidroksiketoni, luciferaza. Bakterije imaju receptorske senzorne proteine ​​koji vežu autoinduktore, tvoreći kompleks koji stupa u interakciju s kinazom vezanom na membranu. Kinaza se fosforilira, fosfat se prenosi na citoplazmatski protein, zatim na regulatorni protein koji se veže na DNA. Nakon toga dolazi do aktivacije gena koji kodiraju regulatorne RNA, što dovodi do prestanka ekspresije komponenti staničnih struktura koje provode intraspecifične međustanične komunikacije.

Takav složeni sustav regulacije, koji se temelji na proizvodnji molekula induktora signala, provodi se na različitim razinama utjecaja: transkripcijskim, translacijskim, posttranslacijskim. Zbog „quorum sensinga“ u populaciji biofilma stalno se odvijaju dvije vrste selekcije – pozitivna i negativna, odnosno stanice s korisnim svojstvima se čuvaju, a bakterije s „nepotrebnim“ fenotipovima se uništavaju (Tets, 2012).

Sudjelovanje TA sustava (sustav toksin-antitoksin) u stvaranju biofilma

Govoreći o biofilmovima, vrijedi napomenuti da nije svaki mikroorganizam sposoban za njihovo stvaranje. Proces sinteze egzopolisaharidnog matriksa određen je određenim čimbenicima. Prema posljednjim rezultatima istraživanja Sveučilišta u Strasbourgu. Louis Pasteur, može se tvrditi da je prisutnost specijaliziranog proteina neophodna za stvaranje biofilma. Na primjer, formirati zajednicu Staphylococcus aureus potrebna je prisutnost SasG-proteina (u kompleksu sa Zn 2+). SasG protein je RNA-vezujući protein koji aktivira:

1) rast površinskih struktura bakterija - flagela, pili;

2) sinteza izvanstaničnih polisaharida;

3) osigurava formiranje tolerancije.

Skup od dva ili više blisko povezanih gena odgovoran je za izlučivanje SasG proteina, koji zajedno kodiraju i protein i njegov odgovarajući blokator.

Ovaj sustav se naziva TA-modul. Lokaliziran je u plazmidu. Ovo je prilično složen sustav koji osigurava ne samo sposobnost bakterija da formiraju biofilmove, već također osigurava njihovu održivost u cjelini. Prema (Yamaguchi, 2011.), ako stanici kćeri nedostaje plazmid, tada se nestabilni antitoksin (blokator) naslijeđen iz citoplazme stanice majke uništava, a stabilni toksični protein ubija stanicu.

Osim toga, TA modul je odgovoran za:

1) regulacija gena: neki toksini djeluju kao opći represori ekspresije gena, dok su drugi specifičniji;

2) kontrola rasta: kao što je navedeno, bakteriostatski toksini ne ubijaju stanicu domaćina, ali ograničavaju njen rast;

3) rezistencija stanica: u nekim populacijama bakterija postoji subpopulacija stanica koje su otporne na djelovanje mnogih klasa antibiotika. Subpopulaciju kontroliraju sustavi toksin-antitoksin. Ove izdržljive stanice koje sporo rastu osiguravaju populaciju od potpunog izumiranja.

4) programirana stanična smrt i preživljavanje njezinih "bliskih srodnika" - različita razina otpornosti stanica populacije na stresne uvjete, uzrokujući programiranu smrt nekih stanica, što sprječava izumiranje cijele populacije (mrtva stanica postaje izvor prehrane za ostalo).

5) otpornost na bakteriofage: kada bakteriofag poremeti transkripciju i translaciju staničnih proteina, aktivacija sustava toksin-antitoksin ograničava replikaciju faga.

Klinički aspekt proučavanja biofilma

Trenutačno je uloga mikrobnih biofilmova u nastanku i razvoju mnogih zarazne bolesti. To su infekcije srčanih zalistaka i zglobnih proteza, infekcije površina rana. Rane su idealan supstrat za mikrobnu kontaminaciju s naknadnim stvaranjem biofilma. Biofilmovi u rani stvaraju okruženje s određenom mikroklimom, koju karakterizira nizak sadržaj kisika. Biofilmovi usporavaju migraciju i proliferaciju keratinocita, čime inhibiraju zaštitne imunološke mehanizme, a izvana stvaraju zaštitni sloj koji ne propušta antimikrobna sredstva lokalno djelovanje(Čebotar, 2012.a).

karakterističan biofilm zarazne patologije su gingivitis (upala zubnog mesa), stomatitis (upala sluznice usne šupljine), stvaranje zubnog kamenca. Otitis - najčešći otorinolaringološki problem - također je popraćen stvaranjem biofilma, ne samo bakterijskog, već i gljivičnog.

Osim infekcija rana, biofilmovi imaju ulogu u kroničnim bolestima mokraćnog sustava, infekcijama izazvanim kateterima i implantatima (kateteri, pacemakeri, srčani zalisci, ortopedski uređaji), kardiovaskularnim bolestima (sinusitis, endokarditis). Drugim riječima, biofilmovi igraju ključnu ulogu u patogenezi širok raspon površinskih i dubokih zaraznih bolesti. Sve te bolesti teško je liječiti, imati visoka frekvencija recidiva i neki od njih mogu biti uzrok smrti.

Ako sumnjate na prisutnost mikroorganizama koji stvaraju biofilm u vivo sljedeći čimbenici se uzimaju u obzir:

1) odvajanje biofilma u krvotoku ili urinarnom traktu može dovesti do stvaranja embolija;

2) Biofilmovi gram-negativnih bakterija mogu proizvesti endotoksin (lipopolisaharid), što dovodi do toksičnog šoka i DIC-a;

3) bakterije u biofilmovima mogu razmjenjivati ​​plazmide rezistencije (prijenos rezistencije s vrste na vrstu);

4) imunološki sustav domaćina ne utječe na bakterije u biofilmu;

5) biofilmovi mogu smanjiti osjetljivost bakterija na antimikrobna sredstva.

Zadnje tri točke pokazuju da su biofilmovi vrlo otporni na antibiotike. No, za njih je primjerenije koristiti termin tolerancija. Primjer nastanka fenomena tolerancije je SasG protein Stafilokok aureus. Njegova biosinteza izaziva neuspjeh u ciklusu nakon replikacije, u kojem je poremećeno funkcioniranje bakterijskog enzima giraze (analog topoizomeraze-4 u bakterijama). To dovodi do pojave perzistera.

Perzisteri su jedinstvene stanice bakterijskih zajednica, koje su, s istim skupom gena kao i ostali mikroorganizmi u zajednici, višestruko otpornije na vanjske čimbenike, za razliku od stanica koje ih okružuju (Ulyanov, 2014). Perzisteri se od običnih bakterija razlikuju po svojoj fiziologiji: čak i pod povoljnim uvjetima oko sebe stvaraju egzopolisaharidnu matricu, često rastu puno sporije od običnih bakterija i, kao što je već spomenuto, vrlo su otporni na vanjske čimbenike. Perzistere čine mali dio bakterijske zajednice, ali se njihov broj povećava u stacionarnoj fazi rasta. Zanimljivo je da stanice kćeri imaju istu otpornost na vanjske čimbenike kao i roditeljske perzister stanice.

Razmotrimo mehanizam postojane otpornosti. Pretpostavimo da vanjski faktor djeluje na bakterijsku koloniju - na primjer, antibiotik. Antibiotik inhibira aktivnost giraze (topoizomeraze-4), zbog čega dolazi do lomljenja dvolančane DNA u bakterijskoj stanici, ali samo u onim područjima gdje je giraza aktivna, odnosno u području "replikacijske vilice". ". Ako su stanice zaštićene izvanstaničnom polimernom tvari, a broj takvih mjesta nije veći od dva ili četiri, tada stanični sustavi štite bakteriju od smrti obnavljanjem oštećenja. U običnim brzorastućim bakterijskim stanicama postoji mnogo takvih lomova i DNK se razgrađuje kada se koriste antibiotici, dok je DNK perzistera sačuvana. Učinak antibiotika može varirati, ali svi se suočavaju s istim problemom: sporo rastuće, dobro zaštićene perzistente su manje izložene stresu i imaju vremena "stati u naftalinu" prije nego što im se učini nepopravljiva šteta.

Navedene informacije ne iscrpljuju podatke o karakteristikama mikrobnih biofilmova. Treba napomenuti da, unatoč velikom teoretskom materijalu i važnosti problema, ostaju neriješena pitanja vezana uz biofilmotvornu aktivnost patogenih i uvjetno patogenih mikroorganizama u sastavu bolničke mikroflore medicinskih bolnica različitih profila. Ne postoje lijekovi koji su učinkoviti protiv biofilma i mikroflore u sastavu izvanstaničnih matrica, kao ni sredstva za suzbijanje zrelog biofilma. Ovaj problem zahtijeva daljnji razvoj.

Bibliografija

1. Yamaguchi Y., Inouye M. Regulacija rasta i smrti Escherichie coli sustavima toksin-antitoksin. Nature Reviews Microbiology 2011, 9(11):779-790.

2. Afinogenova A.G., Dorovskaya E.N. Mikrobni biofilmovi rana: stanje tehnike // Traumatologija i ortopedija. - 2011. - br. 3. – Str.119–125.

3. Balko A.B., Balko O.I., Avdeeva L.V. Stvaranje biofilma sojevima Pseudomonas aeruginosa // Microbiological journal. - 2013. - br. 2. – Str.50–56.

4. Maltsev S.V., Mansurova G.Sh. Što je biofilm? // Praktična medicina. - 2011. - br. 53. – Str.7–10.

5. Tets V.V., Tets. G.V. Mikrobni biofilmovi i problemi antibiotske terapije // Praktična pulmologija. - 2013. - br. 4. – Str. 60–64.

6. Turkutyukov V.B., Ibragimova T.D., Fomin D.V. Molekularne značajke morfologije biofilmova formiranih sojevima nefermentirajućih gram-negativnih bakterija // Pacific Medical Journal. - 2013. - br. 4. – Str.44–47.

7. V. Yu. Ul'yanov, S. V. Operedintseva, I. G. Shvidenko, I. A. Norkin, G. V. Korshunov i E. V. Gladkova, Russ. Biološka kinetika biofilmova kliničkih sojeva Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa izoliranih iz bolesnika s bronhopulmonalnim komplikacijama u traumatskoj bolesti leđna moždina// Klinička laboratorijska dijagnostika. - 2014. - br. 8. – Str.43–47.

8. Frolova Ya.N. Biološka svojstva biofilmovi toksigenih sojeva Corinobacterium Diphtheriae gravis TOX + : dis. ... Kandidat bioloških znanosti: 6/12/2015 / Frolova Yana Nikolaevna. - Rostov, 2015. - 118 str.

9. Čebotar I.V. Mehanizam imuniteta protiv biofilma // Bilten Ruske akademije medicinskih znanosti. - 2012. - T.67. - br. 12. – Str.22–29.

10. Chebotar I.V., Konchalova E.D., Bugrova M.L. Vezikularne strukture u sustavu biofilma Neutrofili-Staphylococcus aureus // Infectious Immunology. – 2012a. - br. 61. – Str.35–39.

Prikupljen je eksperimentalni materijal koji pokazuje sposobnost NF da nastavi s rastom pod povoljnim uvjetima. Uvjeti reverzije uključuju korištenje različitih induktora reverzije (fizikalnih, kemijskih, biotičkih), ali se mogu sastojati i samo u uklanjanju štetnih učinaka, kao što je, primjerice, prikazano za mikroorganizme izložene gama zrakama.

Od fizikalnih čimbenika najčešći uzrok reverzije je porast temperature od 0,5-6°C na 20-22°C ili do 37°C, kratkotrajno zagrijavanje do 45°C. Nagli porast CFU u mikrokozmosu se smatra dokazom reverzije, a ne ponovnog rasta nekoliko preživjelih stanica.

U nekim slučajevima optimizacija temperature ne uspijeva potaknuti reverziju. V. parahaemolyticus preokreće se kada temperatura poraste na 25°C u kombinaciji s upotrebom minimalno slanog medija. NP V. harveyi i V. fischeri nastavljaju rast kada se dodaju organski ili anorganski izvori razlagača dušika, ugljika ili vodikovog peroksida.

Među kemijskim induktorima reverzije NF poznata je skupina spojeva koji razaraju vodikov peroksid (antioksidansi). Takvi spojevi uključuju natrijev piruvat, katalazu, vitamin E. Oni se uvode izravno u mikrokozmose kao zaštitnici ili kao dio hranjivih medija namijenjenih reverziji. To je omogućilo dobivanje reverzije E. coli, V. parahaemolyticus. Na učinkovitost reverzije utječe kemijski sastav medija i njegovo agregacijsko stanje (poželjno tekuće hranjive podloge).

Da bi se preokrenuo NF, biotički faktori rasta dodaju se hranjivim medijima: fetalni serum, supernatant rastuće kulture ili rekombinantni Rpf protein izoliran iz njega. Zabilježen je učinak citokina na reverziju NF. Nekultivirani virulentni sojevi Salmonella bili su reverzibilni in vitro i in vivo u prisutnosti faktora nekroze tumora (TNF).

Ponekad jedini učinkovita metoda reverzije su prolaz kroz osjetljivi organizam. Tako je, primjerice, NP rekultivacija patogenih sojeva salmonele pri unošenju u tijelo osjetljivih životinja uvijek dovodila do pozitivnog rezultata. Paralelno obnavljanje istih suspenzija in vitro nije dalo pozitivni rezultati.

Istina o reverziji, a ne ponovni rast preživjelih stanica, ostaje najkontroverznije pitanje. Rast iz malog inokuluma koristi se kao dokaz reverzije. Rast kulture iz male količine u vegetativnim stanicama mnogo je sporiji nego u varijantama s NF.

Stanične strukture nisu definitivno proučavane, budući da same stanice nisu kultivirane, već su poznate isključivo iz fragmenata DNA. Po svemu sudeći, ipak će biti potrebno razdvojiti "neobradive" na čiste kulture. Međutim, to zahtijeva jeftine, brze i dostupne metode svakom laboratoriju. genetske analize. Zatim, na primjer, nakon pronalaska "nekultivirane" DNK u uzorku, može se početi birati okruženje i uvjete, svaki put provjeravajući genetskim metodama: je li uzgojena kolonija željeni "nekultivirani mikroorganizam" ili ne? Ako ne, opet mijenjajte okolinu i uvjete dok se konačno ne počne uzgajati onaj "nekultivirani". Drugi mogući način da im se "pogleda u lice" jest da se izoliranoj "nekultiviranoj" DNK pokuša staviti neka fluorescentna ili radioaktivna oznaka, lansirati je u prirodu i vidjeti s kim se hibridizira po principu komplementarnosti. Što se tiče organizacije DNK - u biti, za dijagnostiku se ne koristi sva DNK, već samo regija koja kodira 16S ribosomsku RNK, i nema fundamentalnih razlika između bakterija, arheja i "nekultiviranih". 16S RNA odabire se prema nizu sasvim biološki opravdani razlozi. Ali ovaj pristup također je "iz siromaštva": vrlo je skupo i dugotrajno analizirati cijelu DNK, potpuno sekvencioniranje genoma provedeno je za vrlo mali broj prokariota (sjetite se koliko je truda i laboratorija diljem svijeta bilo uključeno u ljudski genom , a uostalom, bakterije imaju samo 10 puta manje gena od naših).

Proučavanje reverzije protoplasta bakterija i gljivica otkrilo je sličnost tijeka ovog procesa u njima. Konvencionalno se može podijeliti u tri faze: 1) regeneracija stanične stijenke, 2) reverzija, pojava revertantnih stanica, 3) obnova normalne citokineze i pojava stanica izvornog oblika.

Istodobno, svaka skupina mikroorganizama ima svoje karakteristike tijeka reverzije protoplasta povezane sa strukturom stanica i staničnih stijenki, prirodom metabolizma i citokineze.

Reverzija bakterijskih protoplasta. Ako tijekom liječenja lizozimom ili penicilinom u izotoničnom mediju stanična stijenka nije u potpunosti uklonjena iz bakterijske stanice, tada kada se ti agensi isključe iz medija, brz oporavak Stanice. Ako je stanična stijenka potpuno uklonjena, nastali pravi protoplast ne može je obnoviti u normalnim uvjetima. Jedan od uvjeta koji omogućuje takvim oblicima da se vrate u svoje izvorno stanje je prisutnost čvrste ili polučvrste baze u mediju za uzgoj. To može biti želatina (5-30%), agar (0,7-2%), membranski filteri, ubijene bakterijske stanice ili stanične stijenke. Štoviše, poželjna je uporaba čvrste podloge.

Reverzija protoplasta filamentoznih gljiva. Reverzija u oblike micelija u protoplastima gljiva događa se iu tekućini i na površini krutog medija, ili u sloju polutekućeg agara. Mnogi istraživači su pokazali da se reverzija gljivičnih protoplasta može dogoditi na tri načina, koji se razlikuju u prirodi formiranja primarnog micelija. S prvom metodom protoplasti u početku tvore lanac stanica sličnih kvascima (do 20 stanica). Zatim terminal, već osmotski stabilan, proizvodi primarnu hifu, koja tvori micelij. Drugi način reverzija počinje regeneracijom stanične stijenke protoplastima, zbog čega oni postaju otporni na osmotski šok. Protoplast zatim formira klicinu cijev. Treći način reverzija gljivičnih protoplasta je neobična. Protoplast, zadržavajući svoj sferični oblik, formira novu ljusku u obliku police, zatim se sadržaj majčinog protoplasta prenosi tamo. Ako se pojavi lanac takvih školjki, tada se citoplazma pomiče duž ovog lanca, ostavljajući za sobom "sjene" sa staničnih zidova. Posljednja stanica lanca tvori primarnu hifu. Protoplasti gljiva mogu se revertirati na jedan od tri načina ili su sva tri načina reverzije opažena kod jedne vrste. Teško je reći što utječe na izbor metode reverzije, možda, karakteristike vrste organizma, vrsta njegove citokineze, način dobivanja i uvjeti inkubacije protoplasta ili sastav medija za regeneraciju.

Protoplasti koji rastu i revertiraju dobar su model za proučavanje biosinteze stanične stijenke i odnosa između rasta stanice i diobe jezgre.

4.2. Uzgoj biljnih stanica

Ideja o mogućnosti uzgoja stanica izvan tijela iznesena je krajem 19. stoljeća. Razdoblje od 1892. do 1902. godine može se smatrati pretpoviješću razvoja metode kulture biljnih stanica i tkiva. U to su vrijeme njemački znanstvenici H. Fechting, K. Rechinger, G. Gaberlandt pokušavali uzgojiti komadiće tkiva izoliranih iz biljaka, skupina stanica i dlaka. Bez eksperimentalnog uspjeha, ovi su prvi istraživači ipak izrazili niz ideja koje su kasnije implementirane.

U sljedećih 20 godina dobiveni su prvi rezultati o uzgoju životinjskih tkiva na hranjivim podlogama s dodatkom seruma. No, u biljnom svijetu nije postignut značajan napredak, unatoč pokušajima stvaranja optimalnih hranjivih podloga koje mogu osigurati dugotrajno postojanje i reprodukciju biljnih stanica in vitro.

Godine 1922. W. Robbins i Kotte neovisno su pokazali mogućnost uzgoja meristemskih stanica vrha korijena rajčice i kukuruza na sintetskim hranjivim podlogama. Ovi pokusi označili su početak primjene metode uzgoja izoliranih biljnih stanica i organa.

U 30-60-im godinama prošlog stoljeća, zahvaljujući radu velikog broja znanstvenika (F. White, R. Gautre i drugi), broj biljnih vrsta čije su stanice i tkiva uzgajani in vitro dosegao je značajan broj (više od 150) . Opisani su sastavi hranjivih podloga, utvrđene su potrebe kultura za vitaminima i stimulansima rasta, razvijene su metode za dobivanje i uzgoj velikih masa staničnih suspenzija, kao i za uzgoj pojedinačne stanice izolirane iz suspenzije. F. Steward, radeći s kulturom izoliranog floema mrkve, dobio je iz nje 1958. cijele biljke. Značajan doprinos razvoju kulture biljnih stanica i tkiva dala su istraživanja R. G. Butenko i njezinih suradnika, koji su ovim metodama proučavali fiziologiju biljnih stanica i morfogenezu biljaka.

Sljedećih godina predložene su metode za dobivanje izoliranih protoplasta iz biljnih tkiva, pronađeni su uvjeti uzgoja pod kojima mogu formirati novu staničnu stijenku, podijeliti se i dati stanične linije. Koristeći izolirane protoplaste, razvijene su metode za hibridizaciju somatskih stanica spajanjem protoplasta s PEG (polietilen glikolom) i uvođenjem virusne RNK, staničnih organela i bakterijskih stanica u njih. Metodom meristemske kulture dobivene su bezvirusne gospodarski važne biljke s visokom stopom razmnožavanja.

Trenutačno se aktivno nastavlja razvoj metoda dubokog uzgoja stanica, metoda elektrofuzije izoliranih protoplasta itd.

Korištenje metoda za dobivanje somaklonskih varijanti, eksperimentalnih haploida, probira biokemijskih mutanata dovelo je do pojave produktivnijih i prilagođenijih uvjetima uzgoja staničnih sojeva koji se koriste za stvaranje novih oblika i sorti poljoprivrednih, ljekovitih, ukrasnih i drugih biljaka.

Uzročnici tuberkuloze su kiselootporne mikobakterije koje je otkrio R. Koch 1882. Poznato je nekoliko vrsta Mycobacterium tuberculosis: Mycobacterium tuberculosis (ljudska vrsta), Mycobacterium africanum (intermedijarna vrsta) i Mycobacterium bovis (goveđa vrsta), koje pripadaju rod Mycobacterium, porodica Mycobacteriacae, red Actinomycetalis. Uzročnici tuberkuloze u ljudi najčešće (u 92% slučajeva) su mikobakterije tuberkuloze ljudske vrste, mikobakterije goveda i intermedijarne vrste uzrokuju razvoj tuberkuloze u ljudi, odnosno u 5 odnosno 3% slučajeva. U suvremenoj mikrobiološkoj klasifikaciji ptičje mikobakterije (M. avium) svrstavaju se u netuberkulozne mikobakterije avium-intracelularnog kompleksa, koje mogu biti uzročnici mikobakterioza u ljudi i životinja.

Mycobacterium tuberculosis - tanki, ravni ili blago zakrivljeni štapići dugi 1-10 (obično 1-4) mikrona, široki 0,2-0,6 mikrona, homogeni ili zrnati s blago zaobljenim krajevima (Slika 1.1), nepomični su, ne tvore endospore , konidije i kapsule. Morfologija i veličina bakterijskih stanica značajno variraju, što ovisi o starosti stanica, a posebno o uvjetima postojanja i sastavu hranjive podloge. Elektronskom mikroskopijom identificirani su glavni strukturni elementi Mycobacterium tuberculosis: stanična stijenka, citoplazmatska membrana i njezin derivat - mezosom, citoplazma, jezgrina tvar - nukleotid.

Stanična stijenka ograničava stanicu izvana, pružajući mehaničku i osmotsku zaštitu. Elektronsko-mikroskopski su u staničnoj stijenci izolirana tri sloja debljine 10 nm; Stanična stijenka sadrži antigene specifične za vrstu. Cjepiva pripremljena od staničnih stijenki Mycobacterium tuberculosis imaju različitu virulentnost i imunogenost. Najizraženiju imunost izazivaju cjepiva iz staničnih stijenki visoko virulentnih mikobakterija. Stanične stijenke potiču razvoj preosjetljivosti odgođenog tipa (PDHT) i stvaranje protutijela u tijelu zdravih životinja. Međutim, njihova snažna senzibilizirajuća svojstva i prisutnost faktora toksične vrpce (faktor virulencije) u njima značajno kompliciraju hiperimunizaciju ove frakcije mycobacterium tubercle.

Slika 11 Mycobacterium tuberculosis Negativan kontrast x 35 000

cules [Averbakh M. M. et al., 1976; Romanova R. Yu., 1981]. Zadatak je izolirati komponente s visokim zaštitnim djelovanjem iz frakcija stanične stijenke.

Prema suvremenim konceptima, sastav citoplazmatske membrane koja se nalazi ispod stanične stijenke uključuje lipoproteinske komplekse. S njim su povezani različiti enzimski sustavi, posebno redoks sustavi. U citoplazmatskoj membrani procesi odgovorni za

specifičnosti reakcija mikobakterijskih stanica na okoliš.

Citoplazmatska membrana Mycobacterium tuberculosis invaginacijom u citoplazmu tvori intracitoplazmatski membranski sustav, odnosno mezosom. Mezosomi su polifunkcionalni. Povezani su s lokalizacijom mnogih enzimskih sustava, sudjeluju u sintezi materijala stanične stijenke i djeluju kao posrednici između jezgre i citoplazme. Slab razvoj ili odsutnost mezosoma primijećen je kod avirulentnih sojeva Mycobacterium tuberculosis i njihovih L-formi [Kats LN, Volk AV, 1974]. Citoplazma Mycobacterium tuberculosis sastoji se od granula i vakuola različitih veličina. Glavni dio malih zrnatih inkluzija predstavljaju ribosomi, na kojima se sintetizira specifični protein.

Jezgra tvari Mycobacterium tuberculosis određuje specifična svojstva stanice, od kojih su najvažnija sinteza proteina i prijenos nasljednih osobina na potomstvo. Utvrđeno je da je glavni način razmnožavanja ovih bakterija dioba matičnih stanica u dvije stanice kćeri.

Utvrđeno je da nositelj genetske informacije bakterija nisu samo kromosomi, već i nekromosomski elementi - plazmidi. Glavna razlika između kromosoma i plazmida je njihova veličina. Kromosom je mnogo puta veći od plazmida i, prema tome, nosi veliki broj genetske informacije. Moguća interakcija plazmida s kromosomom. Plazmidi su, zbog svoje male veličine, prikladni za prijenos od stanice do stanice. Studije plazmida nisu samo teorijske, već i praktična vrijednost. Postoji mišljenje da su geni za otpornost Mycobacterium tuberculosis na kemoterapijske lijekove lokalizirani i na kromosomu i na plazmidu.

Opisane su brojne morfološke varijante mikobakterija: divovski oblici s bočasto zadebljalim granama, nitasti, micelijski i batičasti, difteroidni i aktinomikotični oblici. Mycobacterium tuberculosis može biti duža ili kraća, deblja ili tanja nego inače, homogena ili zrnasta. Ponekad su to lanci ili pojedinačne nakupine kokoidnih zrnaca.

Fenomen varijabilnosti kod Mycobacterium tuberculosis otkriven je ubrzo nakon njihova otkrića. Već 1888. I. I. Mechnikov je izvijestio da u kulturama, osim tipičnih Kochovih štapića, postoje polimorfni oblici ovih mikroorganizama u obliku kratkih karika povezanih u parovima i divovskih formacija s granama u obliku tikvice. Prvo izvješće o mogućnosti postojanja filtrabilnih oblika u Mycobacterium tuberculosis odnosi se na 1910. godinu (A. Fontes). Tijekom kemoterapije eksperimentalne destruktivne tuberkuloze, kao i nakon njezinog prekida, u homogenatima stijenke kaviteta, propuštenim kroz bakterijske filtere s veličinom pora od 0,2 μm, nađeni su

vrlo mali, s pojednostavljenom strukturom oblika uzročnika tuberkuloze, koji se zove ultramali (slika 1.2). Zatim je pokazano da se ti oblici, kroz više bioloških prolaza, mogu preokrenuti u klasični štapićasti oblik [KhomenkoA. G. i sur., 1982, 1989]. Jedna od vrsta varijabilnosti mnogih bakterija je stvaranje L-formi. Sposobnost stvaranja L-formi također je dokazana u Mycobacterium tuberculosis [Dorozhkova IR, 1974; Shmelev N.A., Zemskova Z. C, 1974]. Istodobno je utvrđeno da se transformacija mikobakterija u L-oblike pojačava pod utjecajem lijekova protiv tuberkuloze. U ispljuvku "abacilarnih" pacijenata s destruktivnim oblicima tuberkuloze mogu postojati L-oblici mikobakterija koji mogu dugo ostati u tijelu, a zatim se pod odgovarajućim uvjetima preokreću u štapićastu varijantu [KhomenkoA. G. i sur., 1980]. Stoga abacilacija kaverni takvih bolesnika još ne znači njihovu sterilizaciju protiv Mycobacterium tuberculosis.

Uz morfološku varijabilnost, Mycobacterium tuberculosis karakterizira velika varijabilnost drugih svojstava, posebice otpornosti na kiseline. Potonji se očituje sposobnošću zadržavanja boje čak i uz intenzivno izbjeljivanje kiselim alkoholom i karakteristično je svojstvo svih vrsta mikobakterija zbog visokog sadržaja mikolne kiseline i lipida. Djelomični ili potpuni gubitak otpornosti na kiselinu dovodi do stvaranja mješovite populacije koja se sastoji od jedinki otpornih na kiseline i neotpornih na kiseline ili potpuno neotporne populacije.

Mycobacterium tuberculosis vrlo je otporan na čimbenike okoliša. U prirodnim uvjetima, u odsutnosti sunčeve svjetlosti, njihova održivost može trajati nekoliko mjeseci; u difuznom svjetlu, patogeni umiru nakon 1-IV2 mjeseci. Mycobacterium tuberculosis ostaje u uličnoj prašini do 10 dana, na stranicama knjiga - do 3 mjeseca, u vodi - do 5 mjeseci.Istodobno, kultura mikroorganizama ozračena sunčevom svjetlošću umire unutar IV2 sati, a pod utjecaj ultraljubičastih zraka - nakon 2-3 minute . Kod kuhanja mokrog sputuma, mikobakterije umiru nakon 5 minuta, a osušeni sputum - nakon 25 minuta. Spojevi koji oslobađaju slobodni aktivni klor (3-5% otopine kloramina, 10-20% otopine izbjeljivača itd.) uzrokuju smrt Mycobacterium tuberculosis unutar 3-5 sati.

Mycobacterium tuberculosis smatraju se aerobima, iako postoje dokazi da se neke njihove vrste mogu smatrati fakultativnim anaerobima. Ove se mikobakterije vrlo sporo razmnožavaju (jedna dioba stanice događa se u 14-18 sati). Mikroskopski vidljiv rast mikrokolonija uzgojenih na tekućim podlogama na temperaturi od 37°C otkriva se 5-7. dana, vidljiv rast kolonija na čvrstim podlogama uzgojenim na istoj temperaturi - 14-20. dana.

Za normalan razvoj Mycobacterium tuberculosis potrebne su posebne hranjive podloge koje sadrže ugljik, dušik, kisik, vodik, fosfor, magnezij, kalij, natrij, željezo, klor i sumpor. Ovi mikroorganizmi također trebaju neke čimbenike rasta koji uključuju spojeve srodne vitaminima B skupine, biotin, nikotin, riboflavin itd. Svi ovi čimbenici dio su posebnih hranjivih podloga koje se koriste za uzgoj Mycobacterium tuberculosis, iz njih se izoliraju podloge koje sadrže glicerol. , proteinske (jaje, sirutka, krumpir) i bezproteinske (sintetske) podloge, koje uključuju mineralne soli. Prema konzistenciji razlikuju se gusti, polutekući i tekući mediji. Najraširenije su guste podloge za jaja Levenshtein-Jensena, Ogawe, Petragnanija i Gelbera, razne Middbrook agar podloge, sintetičke i polusintetske podloge Sotona, Dubosa, Proskauer-Gecka, Shule, Shkolnikove itd.

Na tekućim hranjivim podlogama mikrobakterije tuberkuloze rastu u obliku suhog naboranog filma krem ​​boje (P-forma) koji se diže do stijenki posude, dok podloga ostaje prozirna. Tijekom intracelularnog razvoja mikobakterija, kao i kod njihovog uzgoja na tekućim podlogama, dobro se razlikuje karakterističan kord faktor (trehaloza-6,6-dimikolat). Nalazi se na površini stanica mnogih mikobakterija i, prema nekim istraživačima, povezan je s njihovom virulentnošću, pridonoseći konvergenciji mikrobnih stanica i njihovom rastu u obliku zmijolikih pletenica.

Na gustim podlogama Mycobacterium tuberculosis raste kao svijetlo kremasta, naborana ili suha ljuskasta prevlaka, formira kolonije s neravnim rubovima, uzdignute u sredini, kako rastu, poprimaju bradavičast izgled nalik cvjetači.

Pod utjecajem antibakterijskih tvari, Mycobacterium tuberculosis može steći otpornost na lijekove. Kulture takvih mikobakterija nisu uvijek tipične, mogu biti vlažne, meke (S-varijanta), ponekad sadrže zasebne glatke ili pigmentirane kolonije.

1.2. PATOGENEZA

Mycobacterium tuberculosis može ući u organizam na različite načine: aerogenim, enteralnim (kroz gastrointestinalni trakt), kroz oštećenu kožu i sluznicu, kroz placentu tijekom fetalnog razvoja. Međutim, glavni put infekcije je aerogeni.

Određenu zaštitnu ulogu u aerogenoj infekciji igra mukocilijarni sustav klirensa, koji vam omogućuje djelomično uklanjanje čestica prašine koje su ušle u bronhije, kapi sluzi, sline i sputuma koji sadrže mikroorganizme. Kod enteralne infekcije, apsorpcijska funkcija crijeva može biti od određene važnosti.

Lokalne promjene na mjestu unošenja mikobakterija prvenstveno su posljedica reakcije polinuklearnih stanica, koju zamjenjuje savršeniji oblik zaštitne reakcije u kojoj sudjeluju makrofagi koji provode fagocitozu i uništavanje mikobakterija. Proces interakcije plućnih makrofaga s različitim mikroorganizmima, uključujući Mycobacterium tuberculosis, složen je i nije u potpunosti shvaćen. Rezultat interakcije makrofaga i mikobakterija određen je stanjem imuniteta, razinom PCCT-a koji se razvija u procesu infekcije tuberkulozom, kao i nizom drugih čimbenika, uključujući one koji određuju probavni kapacitet makrofaga.

Fagocitoza se sastoji od tri faze: faza kontakta, kada makrofagi fiksiraju mikobakterije uz pomoć receptora na staničnoj membrani; faze prodiranja mikobakterija u makrofag invaginacijom stijenke makrofaga i "omatanjem" mikobakterije; faze probave, kada se lizosomi makrofaga spajaju s fagosomima koji sadrže mikobakterije. Enzimi otpušteni u fagolizosome uništavaju mikobakterije. U procesu fagocitoze važnu ulogu imaju i mehanizmi peroksidacije.

Mycobacterium tuberculosis, kao i neki drugi mikroorganizmi, ulazeći u makrofage, može postojati i čak se nastaviti razmnožavati. U slučajevima kada je proces probave mikobakterija blokiran, makrofagi se uništavaju i mikobakterije se oslobađaju iz stanica koje su ih apsorbirale.

Makrofagi koji fagocitiraju mikobakterije i provode njihovu probavu izlučuju u izvanstanični prostor fragmente uništenih mikobakterija, proteolitičke enzime, medijatore (uključujući interleukin-1), koji aktiviraju T-limfocite, posebno T-pomagače. Aktivirani T-pomagači izlučuju medijatore - limfokine (uključujući interleukin-2), pod utjecajem kojih novi makrofagi migriraju na mjesto lokalizacije mikobakterija. Istodobno, sinteza faktora inhibicije migracije je potisnuta, enzimska aktivnost makrofaga se povećava pod utjecajem faktora aktivacije makrofaga. Aktivirani limfociti također izlučuju kožni reaktivni faktor, koji uzrokuje upalni odgovor i povećanje vaskularne propusnosti. Ovaj faktor je povezan sa supresijom PCCT i pozitivnom tuberkulinskom reakcijom [Medunitsyn N. V. et al., 1980]. Osim T-pomagača, na stanje imuniteta značajno utječu T-supresori i supresorski monociti koji potiskuju imunološki odgovor.

Uz T-limfocite i makrofage, važnu ulogu u patogenezi tuberkuloznog procesa imaju tvari koje se oslobađaju tijekom uništavanja mikobakterija. Ove tvari (frakcije) su detaljno proučene. Dokazano je da cord faktor (čimbenik virulencije Mycobacterium tuberculosis, koji određuje njihov rast na gustom hranjivom mediju u obliku "pletenica"), izaziva akutni upalni proces, a sulfatidi povećavaju toksičnost cord faktora i , što je najvažnije, potiskuju stvaranje fagolizosoma u makrofagima, što sprječava uništenje intracelularno smještenih mikobakterija.

Intenzivnim razmnožavanjem mikobakterija u ljudskom tijelu, zbog neučinkovite fagocitoze, oslobađa se velik broj toksičnih tvari, izaziva izražena PCCT, što pridonosi pojavi eksudativne komponente upale s razvojem kazeozne nekroze i njezinim razmnožavanjem. . Tijekom tog razdoblja povećava se broj T-supresora, smanjuje se broj T-pomagača, što dovodi do inhibicije PCCT. To uzrokuje napredovanje tuberkuloznog procesa.

Uz relativno malu populaciju bakterija u uvjetima PCCT-a i učinkovite fagocitoze, primjećuje se stvaranje tuberkuloznih granuloma. Takav granulom se razvija kao rezultat PCST reakcija [Averbakh M. M. et al., 1974]. Akumulacija mononukleara oko neutrofila koji sadrže antigen i njihova naknadna transformacija odvija se pod regulatornim utjecajem limfokina koje proizvode T-limfociti (osobito T-pomagači) i koji su posrednici granulomatozne reakcije. Budući da se veličina bakterijske populacije, kao i priroda tijeka imunoloških reakcija u različitim stadijima tuberkulozne infekcije mijenjaju, morfološke reakcije u bolesnika s tuberkulozom karakteriziraju velika raznolikost.

Ovisno o mjestu unošenja Mycobacterium tuberculosis, upalno žarište, odnosno primarni afekt, može nastati u plućima, usnoj šupljini, tonzilama, crijevima itd. Kao odgovor na stvaranje primarnog afekta razvija se specifičan proces u regionalnim limfni čvorovi te nastaje primarni tuberkulozni kompleks. Utvrđeno je da se primarna tuberkuloza, koja se razvija kao rezultat prvog kontakta makroorganizma s patogenom, može manifestirati ne samo u obliku primarnog tuberkuloznog kompleksa, kako se dosad mislilo. Kao rezultat primarne infekcije može se razviti tuberkuloza intratorakalnih limfnih čvorova, pleuritis, tuberkulom i žarišni proces.

Primarna tuberkuloza kao posljedica "svježe" infekcije razvija se samo u 7-10% zaraženih osoba, ostali nose primarnu tuberkulozu bez kliničke manifestacije. Početak infekcije očituje se samo u promjeni tuberkulinskih reakcija.

Čak su i V. I. Puzik (1946), A. I. Kagramanov (1954) i drugi utvrdili da formiranju primarnog kompleksa često prethodi razdoblje "latentnog mikrobizma", u kojem Mycobacterium tuberculosis, ulazeći u tijelo, neko vrijeme ostaje u njemu bez izazivajući upalnu reakciju. Istodobno, mikobakterije se češće nalaze u limfnim čvorovima, osobito intratorakalnim. U tim slučajevima lokalne promjene na plućima ili drugim organima u obliku žarišta primarne tuberkuloze nastaju u kasnom razdoblju primarne infekcije i to ne na mjestu prodora mikobakterija u organizam, već u područjima najpovoljnijim za razvoj upala tuberkuloze.

Odsutnost kliničkih i morfoloških manifestacija primarne tuberkulozne infekcije može se objasniti visokom razinom prirodne otpornosti na tuberkulozu, a može biti i posljedica stečene BCG cijepljenje imunitet.

U prisutnosti lokalnih manifestacija, primarna tuberkuloza može nastaviti s razvojem široko rasprostranjenog procesa kompliciranog tipa ili, koji se trenutno promatra mnogo češće, nekompliciranog tipa s ograničenom upalnom reakcijom.

Primarna tuberkuloza u pravilu se liječi s malim rezidualnim promjenama, što je, očito, povezano s visokom prirodnom otpornošću i masovnim cijepljenjem i revakcinacijom BCG-om.

Mikobakterije preostale u rezidualnim žarištima ili njihove promijenjene oblike treba smatrati antigenom tuberkuloze, čija je prisutnost nužna za održavanje specifične imunosti senzibiliziranih limfocita. Određenu, međutim, još uvijek malo istraženu ulogu u održavanju antituberkuloznog imuniteta imaju B-stanični imunitet i genetski mehanizmi.

Dobiveni su dokazi o ulozi nasljeđa tijekom procesa tuberkuloze. Genetski čimbenici utječu na odgovor imunološkog sustava tijekom reprodukcije Mycobacterium tuberculosis u ljudskom tijelu, a posebno određuju interakciju između makrofaga, T- i B-limfocita, proizvodnju limfokina, monokina i drugih citokina od strane T- i B-limfociti i makrofagi, složeni imunološki odgovor, koji određuje osjetljivost ili otpornost na razvoj tuberkuloze. Otkrivena je povezanost HLA-genotipova s ​​bolešću tuberkuloze u obiteljima u kojima su roditelji i djeca bolesni s tuberkulozom.

Akumulacija nekih specifičnih tipova HLA u skupinama bolesnika s nepovoljnim tijekom bolesti ukazuje na povezanost određenih gena HLA kompleksa (uglavnom lokusa B i DR s predispozicijom za tuberkulozu) [Khomenko A. G., 1985].

Razdoblje primarne infekcije može završiti izlječenjem s minimalnim (malim) ili prilično izraženim rezidualnim promjenama. Ovi ljudi razvijaju stečenu imunost. Očuvanje perzistentnih mikobakterija u rezidualnim žarištima ne samo da održava stečenu imunost, već stvara rizik od endogene reaktivacije tuberkuloznog procesa zbog reverzije promijenjenih oblika uzročnika tuberkuloze u bakterijski oblik i reprodukcije mikobakterijske populacije.

Reverzija postojanih oblika mikobakterija u oblike koji se razmnožavaju događa se u uvjetima endogene reaktivacije tuberkuloznih žarišta i drugih rezidualnih promjena. Mehanizam endogene reaktivacije, kao i razvoj tuberkuloznog procesa, nisu dovoljno proučeni.

Reaktivacija se temelji na progresivnom razmnožavanju bakterijske populacije i povećanju broja mikobakterija [Khomenko A. G., 1986]. Međutim, do danas ostaje nepoznato što točno i koji uvjeti doprinose reverziji uzročnika tuberkuloze, koji je bio u trajnom stanju. Utvrđeno je da reaktivacija tuberkuloze i razvoj njezinih različitih klinički oblicičešće se promatra u osoba s rezidualnim promjenama u prisutnosti čimbenika koji smanjuju imunitet.

Moguć je i drugi način razvoja sekundarne tuberkuloze - egzogeni, povezan s novom (ponovljenom) infekcijom Mycobacterium tuberculosis (superinfekcija). Ali čak i uz egzogeni put razvoja sekundarne tuberkuloze, prodiranje mikobakterija u već zaraženi organizam nije dovoljno, čak ni uz masivnu ponovljenu superinfekciju. Nužna je kombinacija niza stanja i čimbenika rizika koji smanjuju imunitet. Sekundarnu tuberkulozu karakterizira veliki izbor kliničkih oblika. Glavne vrste patomorfoloških promjena u plućima i drugim organima karakteriziraju: a) žarišta s pretežno produktivnom tkivnom reakcijom, povoljnim, kroničnim tijekom i tendencijom zacjeljivanja; b) infiltrativno-pneumonične promjene s pretežno eksudativnom tkivnom reakcijom i sklonošću razvoju kazeozne nekroze ili resorpcije nastale upalne reakcije; c) tuberkulozna šupljina - rezultat razgradnje formiranih kazeoznih masa i njihovog odbacivanja kroz drenažne bronhe uz stvaranje karijesne šupljine.

Različite kombinacije glavnih patomorfoloških promjena u tuberkulozi stvaraju preduvjete za izuzetno široku raznolikost tuberkuloznih promjena, osobito u kroničnom tijeku bolesti s izmjenom razdoblja egzacerbacije i remisije procesa. Tome treba dodati da se iz formiranih zona lezije mikobakterije mogu širiti protokom limfe ili krvi na nezahvaćena područja i različite organe. Ishod bolesti ovisi o njezinom tijeku - progresivnom ili regresivnom, učinkovitosti liječenja i reverzibilnosti promjena koje su nastale tijekom bolesti. Dokazano je da u uvjetima gladovanja, pa čak i pothranjenosti, osobito kada u prehrani nema dovoljno bjelančevina i vitamina, često dolazi do reaktivacije tuberkuloze. Čimbenici reaktivacije uključuju razne bolesti: dijabetes melitus, limfogranulomatoza, silikoza, peptički ulkusželuca i dvanaesnika, stanja nakon resekcije želuca i dvanaesnika, kronične upalne bolesti pluća, mentalna bolest koji se javljaju kod depresivnog sindroma, alkoholizma, stresnih situacija, AIDS-a, dugotrajne primjene glukokortikoida, citostatika i imunosupresiva. Tijek i ishode tuberkuloze treba promatrati samo u kontekstu tekuće specifične kemoterapije, koja se primjenjuje na sve bolesnike s aktivnom tuberkulozom. Tijekom kemoterapije dolazi do smanjenja populacije mikobakterija zbog destruktivnog djelovanja kemoterapijskih lijekova na uzročnike tuberkuloze. Kao rezultat toga, broj mikobakterija se naglo smanjuje, stvaraju se povoljniji uvjeti za reparativne procese i sanogenezu. Istodobno, pri korištenju najučinkovitijih kombinacija suvremenih kemoterapijskih lijekova, bilježi se drugačiji tijek tuberkuloznog procesa: regresija s naknadnim cijeljenjem, stabilizacija procesa bez kliničkog izlječenja uz očuvanje šupljine, tuberkuloma ili drugih promjena, privremeno slijeganje upalni proces s naknadnom pojavom egzacerbacije, razvojem kroničnog procesa ili progresijom bolesti.

Dakle, smanjenje populacije mikobakterija pod utjecajem specifičnih kemoterapijskih lijekova ne dovodi uvijek do izlječenja. Zaustavljanje tuberkuloznog procesa i kasnije izlječenje ne ovisi samo o smanjenju populacije mikobakterija, već io sposobnosti reparativnih procesa u organizmu da osiguraju regresiju tuberkuloznog procesa i njegov završetak.

1.3. PATOLOŠKA ANATOMIJA

1.3.1. tuberkulozna upala

Patološke promjene organa i tkiva kod tuberkuloze su raznolike i ovise o obliku, stadiju, lokalizaciji i prevalenciji patološkog procesa.

Zajedničko većini oblika tuberkuloze su specifične promjene u kombinaciji s nespecifičnim ili paraspecifičnim reakcijama. Specifične promjene uključuju tuberkuloznu upalu čiji je tok popraćen stvaranjem tuberkuloznog tuberkuloza, odnosno granuloma, i većeg žarišta. Nespecifične promjene su različite reakcije koje uzrokuju tzv. maske tuberkuloze.

Morfologija tuberkulozne upale ovisi o reaktivnosti organizma i virulenciji uzročnika. Tuberkuloznim žarištem može dominirati eksudacija, nekroza ili proliferacija, a žarište u skladu s tim može biti pretežno eksudativno, nekrotično ili produktivno. Imunološki procesi imaju važnu ulogu u razvoju tuberkulozne upale. U mjestu upale najprije se razvija reakcija koja nema znakove tipične za tuberkulozu. U njemu su fenomeni alteracije i eksudacije izraženi u različitim stupnjevima. Na prvom mjestu su kršenja u mikrocirkulacijskom krevetu. Oni utječu na finu strukturu alveolarne stijenke, a mehanizmi njihovog razvoja mogu se pratiti na ultrastrukturnoj razini [Erokhin VV, 1987]. U ranim stadijima upale, promjene u submikroskopskoj organizaciji sastavnih elemenata alveolarne stijenke povezane su s povećanjem propusnosti kapilara, razvojem intracelularnog intersticijalnog i intraalveolarnog edema s ispiranjem alveolarnog surfaktanta edematoznom tekućinom.

Unaprijediti distrofične promjene povećanje alveolarnog tkiva, međutim, zajedno s njima, nastaju kompenzacijsko-restorativni procesi, usmjereni na razvoj intracelularne organizacije, povećavajući funkcionalnu aktivnost preostalih stanica interalveolarnog septuma. U sljedećoj fazi upale - proliferativnoj - pojavljuju se elementi specifični za tuberkulozu (pirogov-Langhans epiteloidne i divovske stanice), u središtu tuberkuloznog žarišta formiraju se područja svojevrsne homogene kazeozne (zgrušane) nekroze (slika 1.3). Na temelju podataka elektronske mikroskopije i autoradiografije o dinamici stanične transformacije, utvrđen je genetski odnos stanica granuloma duž linije monocita - divovske stanice [Serov VV, Shekhter AB, 1981; Erokhin V.V., 1978, 1987; Danneberg A.M., 1982.; SpectorW. G., 1982]. Makrofagi aktivno sintetiziraju i akumuliraju lizosomske enzime, obavljaju fagocitnu funkciju. Apsorbirani materijal, među kojima su Mycobacterium tuberculosis, nalazi se i probavlja u fagosomima i fagolizosomima. epiteloidne stanice

nastaju od mononuklearnih stanica i makrofaga koji se nakupljaju u žarištu tuberkulozne upale u prvim fazama upalne reakcije. Imaju veliku ovalnu jezgru, obično s 1-2 jezgrice.Citoplazma ovih stanica sadrži mitohondrije, granule, Golgijev aparat, dobro razvijen sustav tubula i cisterni zrnatog i nezrnastog citoplazmatskog retikuluma te pojedinačne male fagosomi. Broj mitohondrija, elemenata retikuluma i lizosomskih inkluzija uvelike varira i određen je funkcionalnim stanjem stanice.

Divovske Pirogov-Langhansove stanice mogu nastati iz epiteloidnih stanica ili makrofaga tijekom njihove proliferacije, kao i kao rezultat fuzije epiteloidnih stanica. Citoplazma divovskih stanica sadrži veliki broj jezgri, obično smještenih u obliku prstena ili potkove duž periferije stanice, mnoge mitohondrije, lizosome, elemente granularnog citoplazmatskog retikuluma i dobro razvijen Golgijev kompleks. Divovske stanice su sposobne za fagocitozu, u njihovoj citoplazmi nalaze se različiti rezidualni inkluzije.Karakterizira ih visoka aktivnost hidrolitičkih i respiratornih enzima.

Osim epiteloidnih i divovskih stanica, tuberkulozno granulacijsko tkivo obično sadrži značajan broj limfoidnih i plazma stanica, kao i neutrofilnih leukocita. U perifernim dijelovima granulacijskog sloja otkrivaju se fibroblasti. Oko žarišta upale često postoji perifokalna zona nespecifične upalne reakcije. S progresijom procesa uočava se povećanje kazeozne nekroze, pojačana infiltracija granulacijskog tkiva mononuklearima i limfoidnim stanicama, kao i neutrofilima, te širenje zone perifokalne upale. Specifičan proces širi se kontaktnim i limfnim putem.

S cijeljenjem tuberkuloznog žarišta, mase kazeozne nekroze postaju gušće, u potonjem se primjećuje taloženje malih zrnaca kalcijevih soli. U granulacijskom tkivu povećava se broj fibroblasta i kolagenih fibrila, spajajući se u kolagena vlakna, koja oko tuberkuloznog žarišta tvore vezivnu kapsulu. Kasnije se specifično granulacijsko tkivo sve više zamjenjuje fibroznim tkivom. Broj staničnih elemenata između kolagenih vlakana se smanjuje, ponekad dolazi do hijalinoze kolagenih vlakana. U sličnim žarištima i posttuberkuloznim žarištima pronađeni su izmijenjeni oblici Mycobacterium tuberculosis, posebice L-forma, što omogućuje bolje razumijevanje uloge starih žarišta tuberkuloze u patogenezi sekundarnih oblika tuberkuloze [Puzik V. I., Zemskova 3. C, Dorozhkova I. R., 1981, 1984]. U središtu reaktivacije tuberkuloze i formiranja razne forme sekundarna plućna tuberkuloza su reverzija i reprodukcija bakterijske populacije u pozadini razvoja insuficijencije specifične i nespecifične zaštite mikroorganizma.

Potpuno ili djelomično izgubljena stanična stijenka ili prethodnici njegove biosinteze, rastu u obliku karakterističnih malih kolonija. Prvi put otkrio 1935. E. Klieneberger u kulturi Streptobacillus moniliformis koju su izolirali K. Levaditi i sur. 1932. iz zglobne tekućine bolesnika s epidemijskim artikularnim eritemom. Streptobacillus moniliformis je gram-negativan, hemoglobinofilni bacil s oteklinama na krajevima poput kuglica, dobro raste na krvnom (10-20%) agaru i zgrušanom serumu.

Proučavajući eksperimentalnu infekciju kod štakora, Klineberger je izolirao nekoliko sojeva koji su sadržavali, osim tipičnog bakterijski oblici, polimorfni mikroorganizmi, izgledom kolonija i morfologijom vrlo slični organizmima sličnim pleuropneumoniae - pleuropneumoniae like organism (P PL O). Ovi mikroorganizmi su nazvani u čast Ying. Lister - u obliku slova L.

Klineberger je dugi niz godina L-oblike smatrao predstavnicima PPLO simbionta bakterije Streptobacillus moniliformis. Dokaz simbiotske egzistencije dvaju različitih mikroorganizama bio je izostanak reverzije bakterija iz L-formi tijekom 13 godina (350 pasaža).

Razni pokusi Amer. istraživač Daines (L. Dienes) i drugi dokazali su pogrešnost Klinebergerovog koncepta. Pokazalo se da se L-oblici Streptobacillus moniliformis, Fusiformis necrophorus i drugih bakterija mogu vratiti u izvorne bakterijske vrste. Nastanak L-formi bakterija opisuje se pod nazivima "L-transformacija", "L-konverzija", "indukcija L-formi".

VD Timakov i G. Ya. Kagan primili su L-oblike mnogih vrsta bakterija, proučavali njihovu biološku, svojstva i ulogu u patologiji (reumatska bolest srca, septički endokarditis, meningoencefalitis, hron, gonoreja itd.).

Transformacija u L-oblik je svojstvo, po svoj prilici, svojstveno svim bakterijama. Lijekovi koji imaju L-transformacijski učinak ili blokiraju određene karike u biosintezi staničnih stijenki, uglavnom peptidoglikana (murein), ili ih uništavaju. Lijekovi koji induciraju L-oblike bakterija uključuju: 1) antibiotike odgovarajućeg spektra djelovanja, npr. penicilin, cikloserin, lizostafin itd.; 2) murolitički enzimi - lizozim, endoacetilheksosaminidaza faga povezanog lizina streptokoka skupine C itd.; 3) određene aminokiseline (glicin i dr.).

Indukcija L-oblika bakterija ovisi o uvjetima i podlozi kulture: potrebno je stvoriti fizikalnu. okoliš koji pridonosi stabilizaciji osmotski krhke bakterijske membrane i štiti L-oblike od smrti.

Sastav medija i uvjeti uzgoja variraju ovisno o vrsti bakterije; polučvrsta i polutekuća koncentracija agar gela, prisutnost normalnog konjskog seruma i odabir osmotske koncentracije soli potrebni su za očuvanje cjelovitosti citoplazmatsku membranu bakterija L-forme.

Postoje nestabilni i stabilni L-oblici bakterija. Nestabilni oblici zadržavaju određene elemente stanične stijenke ili njezinih prekursora, a tijekom prolaza na podlozi bez L-inducirajućeg agensa vraćaju se na izvornu bakterijsku vrstu. Stabilni oblici potpuno gube komponente stanične stijenke i nisu je u stanju obnoviti, stoga se ne vraćaju u izvorni tip bakterije, čak ni pri ponovljenom prelasku na podloge bez inducirajućeg sredstva, kao i na podloge koje sadrže natrijev sukcinat ili želatina, koja potiče vraćanje bakterija iz L-formi.

L-oblici bakterija rastu u obliku dvije vrste kolonija - A. i B. Kolonije tipa A češće su svojstvene stabilnim L-oblikovima bakterija, vrlo su male (50-100 mikrona), rastu u agar , dobro rastu u skupinama, pojedinačne kolonije često ne daju rast. Minimalni reproduktivni elementi kolonija tipa A, potpuno lišeni stanične stijenke, nemaju fag-receptivne receptore. Kolonije tipa B češće su svojstvene nestabilnim L-oblikovima bakterija, veće su, veličine 0,5-2 mm, s nježnim čipkastim rubom i središtem koje raste u medij. U kolonijama dominiraju kuglasta tijela različite optičke gustoće; u njima ima manje submikroskopskih elemenata nego u kolonijama tipa A. Zadržavaju određene elemente stanične stijenke, fag-receptivne receptore i mogu se aglutinirati serumom izvorne vrste.

Diferencijacija kolonija na tipove A i B je uvjetna, kao i fenomen stabilizacije L-formi. U kulturama stabilnih L-oblika bakterija mogu se nalaziti kolonije tipa B, a u kulturama nestabilnih L-oblika kolonije tipa A.

Kolonije L-oblika bakterija sadrže: 1) kuglasta tijela različite optičke gustoće i veličine; 2) elementarna tjelešca ili granule smještene u skupinama, kao i unutarstanično u većim sfernim tvorevinama ili vakuolama; 3) loše oblikovana, bezoblična tijela koja stalno rastu; 4) uvijeni oblici; 5) velika tijela s inkluzijama u obliku vakuola. L-oblici bakterija razlikuju se u polimorfizmu (sl. 1, 1-6) i istovremeno su fundamentalno isti u različitim vrstama bakterija / što im ne dopušta razlikovanje po morfolu, znaku.

Zajedno s gubitkom stanične stijenke kod L-oblika bakterija gube se i mezosomi, što dovodi do izravnog vezanja citoplazmatske membrane za nukleoid; obnova mezosoma u procesu reverzije se ne promatra.

Nedostatak stanične stijenke uzrokuje dezorganizaciju podjele i mnoštva morfola, manifestacije u reprodukciji L-oblika bakterija. L-oblici bakterija razmnožavaju se diobom, pupanjem ili dezintegracijom stanice u male granule.

Fiziološka, ​​antigena i patogena svojstva ovih oblika određena su građom njihove citoplazmatske membrane, a možda i citoplazme.

L-oblici bakterija nastaju ne samo in vitro, već i in vivo; oni mogu postojati u tijelu i vratiti se u izvorni bakterijski oblik.

Slika 2 prikazuje rezultate dobivanja L-oblika S. typhi in vivo pod utjecajem penicilina. Miševima su istovremeno intraperitonealno primijenjene bakterije i antibiotik. Unošenjem 100 jedinica penicilina na 1 g težine stvaraju se nestabilni L-oblici koji nakon 24-48 sati prelaze u izvorne bakterijske oblike, što uzrokuje uginuće životinja. Uz uvođenje 2000 jedinica penicilina po 1 g težine tijekom 24-48 sati. formirani su stabilni L-oblici, podvrgnuti fagocitozi; uginuće životinja u narednih 5 dana. nije uočeno. Slični podaci dobiveni su proučavanjem in vivo indukcije L-oblika drugih bakterija.

Izvorna shema izdvajanja L-formi iz patola, materijal je razvijen, rubovi su omogućili izdvajanje i identifikaciju L-formi bakterija iz cerebrospinalne tekućine pacijenata s gnojnim meningitisom i reumatskom bolešću srca.

Slika 3 prikazuje mikrofotografije L-formi izoliranih iz krvi pacijenta s reumatskom bolešću srca i njihovih revertanata nastalih kao rezultat reverzije na streptokoke, naknadno identificirane kao skupina A Streptococcus hemolyticus.

Antitijela na stabilne L-forme Streptococcus hemolyticusa nađena su u 87,9% bolesnika s reumatizmom, u 77% bolesnika s infektivno-alergijskim miokarditisom, a samo u 11% zdravi ljudi(V. D. Timakov, G. Ya. Kagan, 1973.). L-oblici različitih vrsta bakterija nalaze se kod hrona, bakteriurije, pijelonefritisa, abakterijskih oblika tuberkuloze, reumatskih bolesti srca itd.

Eksperimentalno je dokazana patogenost L-oblika bakterija, poznat je hron, artritis uzrokovan intraartikularnom primjenom L-oblika Streptococcus hemolyticus, tonzilitis majmuna, kompliciran intersticijskim miokarditisom, izazvan intravenskom primjenom L-oblika bakterije. Streptococcus hemolyticus, pijelonefritis štakora i kunića uzrokovan L-formama bakterija iz roda Proteus i Streptococcus faecalis, meningoencefalitis kunića povezan s L-formama meningokoka te listerioza ovaca i kunića uzrokovana unošenjem L-formi listerije monocytogenes. Patol, procesi uzrokovani L-oblici bakterija razlikuju se u postupnom razvoju patol. fenomeni, produljena struja i postojanost uzročnika u L-obliku koji podržava prijelaz bolesti u hron, oblik. Perzistentnost L-formi bakterija eksperimentalno je utvrđena na L-formama Mycobacterium tuberculosis i Streptococcus hemolyticus.

S jednom intraperitonealnom infekcijom bijelih miševa sa stabilnim L-formama Streptococcus hemolyticus i naknadnim promatranjem godinu dana, antigen L-forme je sačuvan u svim unutarnjim organima. Slika 4, 1 prikazuje primjer lokalizacije L-formi Streptococcus hemolyticusa u slezeni nakon 3 tjedna. nakon infekcije, na slici 4, 2 - nakon 27 tjedana. Dugotrajna postojanost L-formi u tijelu popraćena je povećanjem štetnog učinka; razvoj intersticijalnog miokarditisa i teškog glomerulonefritisa.

Stvaranje L-oblika bakterija in vivo, njihova povezanost s mnogim kroničnim procesima, mogućnost preokreta bakterijskih oblika uz obnovu njihove virulencije i pojava recidiva koji posljedično nisu podložni učinkovitoj terapiji, stavili su med. . mikrobiologija, problem pronalaženja načina rješavanja varijanti mikroorganizama koji su izgubili staničnu stijenku (sferoplasti, protoplasti, L-forme). Potrage se vode s dvije dijametralno suprotne pozicije: 1) sprječavanje mogućnosti indukcije L-formi in vivo (put koji je teško kontrolirati); 2) primjena lijekova koji induciraju stvaranje L-formi, nakon čega slijedi primjena drugih lijekova koji su neučinkoviti protiv intaktnih stanica, ali prodiru intracelularno samo u L-forme bakterija i uništavaju ih. Ovaj put je najperspektivniji. Postoje dokazi o učinkovitosti kombinacija penicilina i kanamicina koje se koriste za liječenje pijelonefritisa. Penicilin potiče stvaranje L-oblika bakterija, koji se uništavaju intracelularnim prodorom kanamicina, koji ne djeluje na intaktne bakterije.

Bibliografija: Peshkov M. A. Citologija bakterija, str. 151, M.-L., 1955.; Timakov V.D., Kagan G. Ya. L-oblici bakterija i obitelji mycoplasmataceae u patologiji, M., 1973, bibliogr.; oni, L-oblici bakterija, porodica mycoplasmataceae i problem perzistencije mikroba, Zhurn, mikr., epid, i imuno., broj 4, str. 3, 1977, bibliogr.; Dienes L. Morfologija Li of Klieneberger i njegov odnos prema Streptobacillus monoliformis, J. Bact., v. 54, str. 231, 1947.; Dinenes L. a. Weinberger H. L-oblici bakterija, Bact. Rev., v. 15, str. 245, 1951.; Klieneberger E. Prirodna pojava organizama sličnih pleuropneumoniji, njihova očita simbioza sa Streptobacillus moniliformis i drugim bakterijama, J. Path. Bact., v. 40, str. 93, 1935.; K li eneb erger-N obel E. Pleuropneumonia-like organisms (PPLO) mycoplasmataceae, L.-N.Y., 1962.; Mikrobni protoplasti, sferoplasti i L-forme, ed. napisao L. B. Guze, Baltimore, 1968.

V. D. Timakov, G. Ya. Kagan.