ΤΑΧΕΙΑ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΛΥΣΣΗΣ

Μέθοδοι ανίχνευσης αντιγόνων. Σε περίπτωση λύσσας για ταχεία διάγνωση, μπορούν να χρησιμοποιηθούν μέθοδοι αντισωμάτων φθορισμού (MFA), αντιδράσεις καθίζησης (RP) σε γέλη άγαρ, μέθοδοι ενζυμικής ανοσοδοκιμασίας (ELISA), αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Απαιτούνται αρκετές εξετάσεις για τη διάγνωση της λύσσας σε ανθρώπους in vivo.

Προσδιορισμός αντισωμάτων στα αντιγόνα του ιού της λύσσας. Η ανίχνευση αντισωμάτων στον ορό του αίματος ή στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό είναι μια σημαντική διαγνωστική μέθοδος. Ο ορολογικός έλεγχος των ειδικών για τη λύσσα αντισωμάτων διεξάγεται στον ορό αίματος για τον προσδιορισμό του εμβολιασμού πριν και μετά την έκθεση και για τον προσδιορισμό του χρόνου της ενισχυτικής ανοσοποίησης προκειμένου να αυξηθεί η ανοσολογική απόκριση.

Απομόνωση ιών. Για την απομόνωση και την ταυτοποίηση του ιού χρησιμοποιείται η μέθοδος βιοδοκιμασίας σε λευκά ποντίκια. Το υλικό δοκιμής εναιωρείται σε φυσιολογικό διάλυμα που περιέχει αντιβιοτικά και εμβρυϊκό βόειο ορό. Το εναιώρημα χορηγείται ενδοεγκεφαλικά σε λευκά ποντίκια βάρους 5–6 g. Για να αποδειχθεί η ανάπτυξη μόλυνσης, τα ποντίκια παρακολουθούνται καθημερινά μέχρι την 30ή ημέρα μετά τον εμβολιασμό. Τα ποντίκια που αναπτύσσουν τη νόσο κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου υποβάλλονται σε ευθανασία αμέσως και οι ιστοί του εγκεφάλου εξετάζονται με απευθείας MFA.

Το πλεονέκτημα αυτής της προσέγγισης είναι η ικανότητα ανίχνευσης μικρών ποσοτήτων ιού της λύσσας στο υλικό. Το μειονέκτημα της μεθόδου είναι η ανάγκη πολλών ημερών (7–18 ημερών) αναμονής μεταξύ του εμβολιασμού και της εκδήλωσης των πρώτων σημείων της νόσου. Για να μειωθεί η περίοδος επώασης, χρησιμοποιούνται θηλάζοντα ποντίκια. Τα ποντίκια ηλικίας μικρότερης των 3 ημερών μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ταχεία διάγνωση: σε ποντίκια που σφάζονται μετά από 3 ημέρες, το αντιγόνο του ιού έχει ήδη ανιχνευθεί στον εγκέφαλο, το οποίο μπορεί να ανιχνευθεί με MFA.

Αυτή η μέθοδος απομόνωσης του ιού εφαρμόζεται ως επιβεβαιωτική διαγνωστική εξέταση για αρνητικά αποτελέσματα για την ανίχνευση αντιγόνου και σωμάτων Babes-Negri και σε περίπτωση δαγκώματος ατόμου από ζώο ύποπτο για λύσσα. Παρέχει κατάλληλη ευαισθησία και ειδικότητα, δηλ. θεωρείται στο επίπεδο της διαγνωστικής σημασίας της μεθόδου άμεσου ανοσοφθορισμού. Επιπλέον, αυτή η μέθοδος είναι η κύρια για την αναγνώριση παραλλαγών ιών και είναι πολλά υποσχόμενη για την ανάπτυξη διαγνωστικών αντιδραστηρίων.

Απομόνωση και ταυτοποίηση ιών σε κυτταρική καλλιέργεια. Το κύριο μειονέκτημα της απομόνωσης του ιού κατά τη μόλυνση των εργαστηριακών ζώων είναι η διάρκεια της μεθόδου. Αυτό μπορεί να αποφευχθεί χρησιμοποιώντας καλλιέργειες κυττάρων. Συνήθως, μια καλλιέργεια κυττάρων νευροβλαστώματος ποντικού χρησιμοποιείται για αυτούς τους σκοπούς εάν είναι απαραίτητο να εξεταστούν εγκεφαλικοί ιστοί. Ο εγκέφαλος εναιωρείται σε θρεπτικό μέσο καλλιέργειας, το εναιώρημα εφαρμόζεται σε μονοστιβάδα κυτταροκαλλιέργειας και επωάζεται για μία έως αρκετές ημέρες.

Η ευαισθησία μιας δεδομένης καλλιέργειας στον ιό μπορεί να αυξηθεί με θεραπεία της με δεξτράνη DEAE. Η κυτταρική μονοστιβάδα στη συνέχεια πλένεται, σταθεροποιείται εν ψυχρώ με ακετόνη ή μίγμα φορμαλίνης και μεθανόλης και εξετάζεται με ανοσοφθορισμό. Εάν το ζώο είχε μολυνθεί με τον ιό της λύσσας, τότε ανιχνεύονται κυτταροπλασματικά εγκλείσματα του αντιγόνου του ιού της λύσσας στη μονοστιβάδα της κυτταροκαλλιέργειας.

Αποδείχθηκε ότι το αντιγόνο του ιού της λύσσας μπορεί να ανιχνευθεί σε κύτταρα νευροβλαστώματος ποντικού Na C1 300 σε συνδυασμό με MFA μετά από 2 ημέρες. Η ευαισθησία της μεθόδου είναι συγκρίσιμη με εκείνη της απομόνωσης του ιού σε ποντίκια.

Αν και ο ιός της λύσσας έχει υποχρεωτική νευροπαθογονικότητα in vivo, είναι ικανός να μολύνει ένα ευρύ φάσμα κυττάρων ξενιστών in vitro, τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον έλεγχο άλλων ιστών και οργάνων για την παρουσία του ιού της λύσσας. Έχει διαπιστωθεί ότι ο ιός της λύσσας πολλαπλασιάζεται σε κύτταρα BHK-21 και Vero, σε πρωτογενή κύτταρα εμβρύων κοτόπουλου ή νεφρών χάμστερ. Έχει αποδειχθεί ότι η προσρόφηση του ιού και η εισαγωγή του στο κύτταρο συμβαίνει εντός 7 ωρών. Μετά από 24-48 ώρες, νέα ιικά σωματίδια σχηματίζονται μέσα στο κύτταρο, μετά από 72 ώρες εκβλάστησαν από την κυτταρική μεμβράνη στον μεσοκυττάριο χώρο.

Ερευνητικές μέθοδοι

Για ρητή διάγνωση της λύσσαςμπορεί να χρησιμοποιηθεί:

μια μέθοδος ΑΝ ΕΝΑ- για την ανίχνευση του αντιγόνου του ιού της λύσσας στα αποτυπώματα του κερατοειδούς ή στο πίσω μέρος του λαιμού ενός ασθενούς που περιέχει τριχοθυλάκια.
β) μέθοδος PCR- για την ανίχνευση RNA του ιού σε δείγματα βιοψίας ιστού, σάλιο, εγκεφαλονωτιαίο ή δακρυϊκό υγρό.
γ) μέθοδος ELISA- για την ανίχνευση ειδικών αντισωμάτων (αντιγόνου) σε ασθενείς με τυπική ή άτυπη πορεία.
δ) μέθοδος βιοδοκιμασίες- για την απομόνωση του ιού στα αρχικά στάδια της νόσου ή για την ανίχνευση αντισωμάτων στο αίμα ή στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό στα τελευταία στάδια της νόσου. Για ταχεία διάγνωση σύνθετη μέθοδος(βιοδοκιμασία + MFA), η οποία συνίσταται στη μόλυνση νεογέννητων ποντικών ηλικίας 2 ημερών με το υλικό δοκιμής και στην εξέταση του εγκεφάλου τους τις ημέρες 3-4 στο MFA.

Η επιλογή των μεθόδων in vivo διάγνωσης εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το στάδιο της νόσου: μια μέθοδος που βασίζεται στην ανίχνευση αντιγόνων, κατά κανόνα, είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη στο τέλος της περιόδου επώασης, κατά τις πρώτες ημέρες της νόσου. ενώ τα αντισώματα εξουδετέρωσης του ιού εμφανίζονται συνήθως στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό και στο αίμα του ορού μετά από 7-10 ημέρες από την έναρξη της νόσου.

αντίδραση ανοσοφθορισμού. Η μέθοδος βασίζεται στη χρήση αντισωμάτων δεσμευμένων σε μια χρωστική, για παράδειγμα, ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη. Το RIF χρησιμοποιείται ευρέως για την ανίχνευση ιικών αντιγόνων στο υλικό των ασθενών και για ταχεία διάγνωση.

Η μέθοδος έχει τον υψηλότερο βαθμό ευαισθησίας, είναι η βάση για σαφή διαγνωστικά και επιτρέπει την ανίχνευση ιικών αντιγόνων μέσα σε λίγες ώρες.

Τα κύρια πλεονεκτήματα του MFA είναι: ταχύτητα εκτέλεσης, υψηλή ειδικότητα (100%). Ο χρόνος που δαπανάται για τη διάγνωση της νόσου με τη βοήθειά της είναι λιγότερο από μία ημέρα. Χρησιμοποιούνται άμεσες και έμμεσες εκδόσεις του MFA.

Άμεσος ανοσοφθορισμόςπαραμένει η προτιμώμενη μέθοδος για τη διάγνωση της λύσσας. Διαφάνειες που περιέχουν επιχρίσματα-αποτυπώματα εγκεφαλικών ιστών ή γυαλιά με μονοστοιβάδα ιστοκαλλιέργειας στερεώνονται σε ακετόνη για 1-4 ώρες. Τα παρασκευάσματα στη συνέχεια ξηραίνονται και υποβάλλονται σε επεξεργασία με φθορίζοντα πολυκλωνικά αντι-νουκλεοκαψιδικά αντισώματα (ανοσοφθοριστικό αντιδραστήριο).

Αυτό το αντιδραστήριο είναι ένα συζυγές που παρασκευάζεται από ειδικά πολυκλωνικά αντισώματα κατηγορίας IgG προς το νουκλεοκαψιδικό αντιγόνο του ιού και την ισοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC). Ειδικά αντισώματα λαμβάνονται με υπερανοσοποίηση ζώων (κουνέλια, χάμστερ ή άλογα) με ένα μείγμα επιτόπων νουκλεοκαψιδίου του ιού.

Προς το παρόν, τα μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού έναντι του νουκλεοκαψιδίου του ιού της λύσσας χρησιμοποιούνται όλο και περισσότερο για αυτούς τους σκοπούς. Μετά από επώαση 30 λεπτών στους 37°C, τα διαγνωστικά παρασκευάσματα πλένονται επανειλημμένα με φυσιολογικό ορό και απεσταγμένο νερό.

Τα αντισώματα που επισημαίνονται με FITC στερεώνονται μόνο στις θέσεις εντοπισμού των ιικών νουκλεοπρωτεϊνικών αντιγόνων. Τα παρασκευάσματα στη συνέχεια ξηραίνονται στον αέρα και εξετάζονται με μικροσκόπιο φωτός χρησιμοποιώντας μια λάμπα xenon και ένα κατάλληλο φίλτρο ως πηγή φωτός.

Στο έμμεση έκδοσητο αντιγόνο αρχικά συνδυάζεται με μη χρωματισμένο ειδικό ανοσοποιητικό ορό. Στη συνέχεια, τα σχηματισμένα μη φθορίζοντα σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος εκτίθενται σε σημασμένο με φθορόχρωμα ανοσοορό που περιέχει αντισώματα σε συγκεκριμένες πρωτεΐνες ορού. Η έμμεση έκδοση του MFA, μαζί με την ανίχνευση του αντιγόνου, καθιστά δυνατό τον ποσοτικό προσδιορισμό των αντισωμάτων στον ορό δοκιμής με την κατάλληλη αραίωση του.

Οι σχηματισμοί με σήμανση FITC σε κύτταρα διαφορετικών ιστών ανιχνεύονται ως κιτρινοπράσινη φθορίζουσα χρώση σε σκούρο φόντο (με τη μορφή στρογγυλών ή ωοειδών ενδοκυτταροπλασματικών εγκλεισμάτων).

Συνδεδεμένη ανοσοπροσροφητική δοκιμασία. Η μέθοδος βασίζεται στην αρχή της προσρόφησης πρωτεΐνης στη στερεά φάση που ακολουθείται από το σχηματισμό συμπλεγμάτων αντιγόνου-αντισώματος που ανιχνεύονται από ένα διάλυμα υποστρώματος-δείκτη. Το αντιγόνο που προστίθεται στα φρεάτια συνδέεται ειδικά με τα αντισώματα. Οι οροί δοκιμής εφαρμόζονται στο στρώμα αντιγόνου στις απαιτούμενες αραιώσεις. Με την παρουσία ειδικών αντισωμάτων σε αυτά, τα τελευταία συνδέονται με το αντιγόνο. Για την ανίχνευση της δέσμευσης, ανοσοσφαιρίνη έναντι ανθρώπινων σφαιρινών ορού συζευγμένη με υπεροξειδάση χρένου εφαρμόζεται στο στρώμα αντισώματος. Η ποσότητα του συζυγούς ροφήματος είναι ανάλογη με την ποσότητα των ανθρωπίνων ορών που είναι δεσμευμένοι στο αντιγόνο. Αυτό μπορεί να προσδιοριστεί χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα δείκτη (ορθοφαινυλενοδιαμίνη + υπεροξείδιο του υδρογόνου), τα συστατικά του οποίου, ως αποτέλεσμα της δράσης της συζυγούς υπεροξειδάσης, χρωματίζουν το υγρό καφέ-κίτρινο. Κατά την εξέταση ασαφών περιπτώσεων, η χρήση ELISA επιπλέον των μεθόδων RP ή RSK σας επιτρέπει να αυξήσετε την αξιοπιστία της εργαστηριακής διάγνωσης της λύσσας, λόγω της υψηλής ευαισθησίας αυτής της μεθόδου. Η μέθοδος επιτρέπει την ανίχνευση μολυσματικών και ελαττωματικών σωματιδίων.

Για τον προσδιορισμό των αντισωμάτων κατά της λύσσας κατά τη διάρκεια του εμβολιασμού, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια έμμεση μέθοδος ELISA, χρησιμοποιώντας έναν καθαρισμένο ιό ως αντιγόνο, και για τον προσδιορισμό των αντισωμάτων κατηγορίας IgG στον ανθρώπινο ορό, την πρωτεΐνη Α σταφυλόκοκκου που σχετίζεται με την υπεροξειδάση χρένου. Τα αποτελέσματα της ELISA είναι συγκρίσιμα με αυτά που ελήφθησαν σε δοκιμές εξουδετέρωσης του ιού σε ποντίκια. Η μέθοδος επιτρέπει την ανίχνευση της παρουσίας IgM στην αρχή της διαδικασίας ανοσοποίησης.

Οι μέθοδοι ανοσοενζύμων είναι πολλά υποσχόμενες για την ανίχνευση του νουκλεοκαψιδικού αντιγόνου του ιού κατά τη μεταθανάτια διάγνωση σε εγκεφαλικούς ιστούς. Μεταξύ αυτών, για παράδειγμα, είναι μια ταχεία μέθοδος ELISA για τη διάγνωση της λύσσας, που βασίζεται στην παρασκευή πλακών ευαισθητοποιημένων με αντισώματα του ισοτύπου IgG στο νουκλεοκαψίδιο του πρώτου ορότυπου, αραιωμένων σε ανθρακικό ρυθμιστικό διάλυμα.

Το υλικό δοκιμής ομογενοποιείται σε ρυθμιστικό ή μέσο καλλιέργειας, διαυγάζεται με φυγοκέντρηση, προστίθεται σε φρεάτια και επωάζεται σε πλάκες. Το νουκλεοκαψιδικό αντιγόνο που στερεώνεται με ειδικά αντισώματα αναγνωρίζεται με την προσθήκη ενός συζυγούς υπεροξειδάσης με αντιλυσσικά αντισώματα κατά της νουκλεοκαψιδίου διαφορετικής εξειδίκευσης του είδους και ενός χρωμογόνου υποστρώματος. Η ευαισθησία της μεθόδου είναι 0,8–1,0 ng/ml.

Αυτή η μέθοδος μπορεί να ανιχνεύσει αντιγόνα ιών διαφόρων οροτύπων. Η χρήση συζυγών αντισωμάτων ειδικών για νουκλεοκαψίδια σημασμένων με βιοτίνη αυξάνει την ευαισθησία της μεθόδου σε 0,1–0,2 ng/ml.

Το αντιγόνο νουκλεοκαψιδίου ανιχνεύεται επιτυχώς με ELISA, αλλά το υλικό, ακόμη και αποσυντεθειμένο, δεν πρέπει να στερεωθεί με φορμαλίνη.

μέθοδος αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Για την ταχεία διάγνωση του ιού της λύσσας και την ταυτοποίηση των ιών της λύσσας, η πιο βολική μέθοδος είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Η μέθοδος PCR είναι η πιο αξιόπιστη και ταχύτερη μέθοδος για την απομόνωση του RNA του ιού από οποιοδήποτε δείγμα που περιέχει τον ιό σε χαμηλή συγκέντρωση. Με αυτό, μπορείτε να δημιουργήσετε πολλά αντίγραφα του ιού RNA. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων MFA και για την ανίχνευση του ιού στο σάλιο, στους θύλακες των τριχών στο πίσω μέρος του λαιμού και στο κεφάλι.

Η PCR βασίζεται στην αρχή της φυσικής αντιγραφής του DNA. Η ουσία της μεθόδου είναι επαναλαμβανόμενη επανάληψηκύκλους σύνθεσης (ενίσχυσης) μιας ειδικής για τον ιό αλληλουχίας DNA χρησιμοποιώντας μια θερμοσταθερή πολυμεράση DNA Taq και δύο ειδικούς εκκινητές, τους λεγόμενους εκκινητές.

Κάθε κύκλος αποτελείται από τρία στάδια με διαφορετικές συνθήκες θερμοκρασίας. Σε κάθε κύκλο, ο αριθμός των αντιγράφων της συνθετικής περιοχής διπλασιάζεται. Τα πρόσφατα συντιθέμενα θραύσματα DNA χρησιμεύουν ως πρότυπο για τη σύνθεση νέων κλώνων στον επόμενο κύκλο ενίσχυσης, γεγονός που καθιστά δυνατή τη συσσώρευση επαρκούς αριθμού αντιγράφων της επιλεγμένης περιοχής DNA σε 25-35 κύκλους για τον προσδιορισμό της, συνήθως με γέλη αγαρόζης ηλεκτροφόρηση.

Ιδιαίτερα υψηλή ευαισθησία της PCR όταν χρησιμοποιούνται εκκινητές συμπληρωματικοί προς το Ν-γονίδιο, όταν είναι δυνατό να ανιχνευθεί RNA ιού σε δείγματα που περιέχουν τον ιό σε τίτλο 10 MLD50. Η μέθοδος PCR μπορεί να ανιχνεύσει το RNA του ιού ακόμη και σε αποσυντεθειμένο παθολογικό υλικό.

Επί του παρόντος, επιβεβαιωτικές (επιβεβαιωτικές) δοκιμές, όπως η αντίστροφη μεταγραφάση PCR (RT-PCR), έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιούνται ευρέως στην πράξη. Η μέθοδος RT-PCR είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη και πιο αποτελεσματική. Το RNA εξάγεται από τους ιστούς του οργάνου που έχει μολυνθεί από τον ιό, μεταγράφεται σε cDNA, το οποίο στη συνέχεια ενισχύεται με PCR. Η RT-PCR απαιτεί εκκινητές που λαμβάνονται για συντηρητικές περιοχές του γονιδιώματος του ιού της λύσσας. Τυπικά, χρησιμοποιούνται γονίδια που κωδικοποιούν μια νουκλεοπρωτεΐνη ή μια Ν-πρωτεΐνη.

Η μέθοδος PCR είναι ιδιαίτερα ειδική και πολύ ευαίσθητη. Είναι ένα από τα πιο ακριβείς δοκιμέςΗ ανίχνευση του αντιγόνου της λύσσας καθιστά δυνατή τη διάγνωση της λύσσας ακόμη και αν υπάρχει τουλάχιστον ένα ιοσίδιο στο υλικό. Η δοκιμή βασίζεται στη συμπληρωματική ολοκλήρωση του εκμαγείου RNA, που πραγματοποιείται in vitro χρησιμοποιώντας το ένζυμο RNA πολυμεράση. Τα τελευταία χρόνια, η PCR χρησιμοποιείται όλο και περισσότερο για τη διάγνωση και την παρακολούθηση ιογενών λοιμώξεων. Ωστόσο, η τεχνική είναι πολύπλοκη, δαπανηρή και δεν είναι ακόμη επαρκώς ενοποιημένη για χρήση ρουτίνας.

Οι κυτταρολογικές μέθοδοι επί του παρόντος είναι περιορισμένες διαγνωστική αξία, αλλά θα πρέπει να χρησιμοποιείται για ορισμένες λοιμώξεις. Εξετάζονται υλικά αυτοψίας, βιοψίες, επιχρίσματα, τα οποία μετά από κατάλληλη επεξεργασία χρωματίζονται και αναλύονται στο μικροσκόπιο. Στη λύσσα, είναι η ανίχνευση εγκλεισμάτων στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων (σώματα Babes-Negri).

Απομόνωση ιών. Η απομόνωση του ιού μπορεί να είναι απαραίτητη για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων των δοκιμών αντιγόνου και για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό των απομονώσεων. Και παρόλο που αυτή η μέθοδος είναι μια από τις παλαιότερες και πιο χρονοβόρες διαγνωστικές μεθόδους, σήμερα η απομόνωση του ιού με μετέπειτα ταυτοποίηση χρησιμοποιώντας μία από τις σύγχρονες μεθόδους (ELISA με μονοκλωνικά αντισώματα ή PCR) είναι η πιο αξιόπιστη διαγνωστική μέθοδος, η λεγόμενη. "χρυσός κανόνας".

Η αποτελεσματικότητα των διαγνωστικών μεθόδων για τη λύσσα μπορεί να ποικίλλει ανάλογα με διάφορους παράγοντες (στάδιο της νόσου, χρόνος δειγματοληψίας υλικού, ποιότητα των δειγμάτων που λαμβάνονται, συνθήκες αποθήκευσης, εμπειρία του προσωπικού, ποιότητα αντιδραστηρίων κ.λπ.). Εάν ένα θετικό αποτέλεσμα επιβεβαιώνει τη λύσσα, τότε ένα αρνητικό αποτέλεσμα δεν υποδηλώνει πάντα την απουσία της νόσου. Ως εκ τούτου, για τη λύσσα, οι ειδικοί του ΠΟΥ συνιστούν τη χρήση πολλών δοκιμών, ειδικά MFA σε συνδυασμό με βιοδοκιμασία σε νεογέννητα (ηλικίας 2-3 ημερών) λευκά ποντίκια.

Μέτρα ατομικής πρόληψης

Όλες οι εργασίες με υλικό για το οποίο υπάρχει υποψία ότι περιέχουν τον ιό της λύσσας, καθώς και με ζώα για τα οποία υπάρχει υποψία λύσσας, πρέπει να εκτελούνται σύμφωνα με τα μέτρα προσωπικής ασφάλειας. Ιατρικοί εργαζόμενοικαι οι κτηνίατροι πρέπει να εργάζονται με ρόμπες, γάντια, μάσκες.

Στο τέλος της εργασίας, τα κουτιά υποβάλλονται σε επεξεργασία με διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου 3%.

Τα φιαλίδια, οι αμπούλες και τα εργαλεία, καθώς και τα υπόλοιπα υλικά που περιέχουν τον ιό της λύσσας, και όλα τα σκεύη μετά την εργασία απολυμαίνονται σε αυτόκαυστο για 1 ώρα στη 1,5 atm (τρόπος θανάτου).

Κεφάλαια προσωπική προστασίααπολυμαίνεται με βρασμό ή σε αυτόκαυστο. Η επιφάνεια εργασίας του τραπεζιού και τα χέρια απολυμαίνονται με απολυμαντικό διάλυμα (διάλυμα χλωραμίνης 0,5%).

Η λύσσα (R) είναι μια οξεία ασθένεια των θερμόαιμων ζώων που χαρακτηρίζεται από βλάβη στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Οικόσιτα και άγρια ​​ζώα κάθε είδους, καθώς και οι άνθρωποι, είναι ευπαθή.

Η ασθένεια είναι καταγεγραμμένη σε διάφορες περιοχές του πλανήτη. Δεν υπήρξαν περιπτώσεις εξάπλωσης της νόσου σε Αυστραλία, Μεγάλη Βρετανία, Ιαπωνία. Η ασθένεια σχεδόν πάντα καταλήγει σε θάνατο. Υπάρχουν πράγματι τεκμηριωμένες περιπτώσεις ανάρρωσης από λύσσα σε ανθρώπους και σκύλους μετά από πειραματική μόλυνση.

Ο ιός της λύσσας (ιός της λύσσας) ανήκει στην οικογένεια Rhabdoviridae, το γένος Lyssavirus. Έχει πλέον διαπιστωθεί ότι το VB έχει 4 ορότυπους, κάτι που προφανώς οφείλεται στη διαφορά στη σύνθεση των πρωτεϊνών της μεμβράνης. Όλες οι παραλλαγές του VB σχετίζονται ανοσοβιολογικά, αλλά διαφέρουν ως προς τη λοιμογόνο δράση. Η WB έχει ιδιότητες GA και GAD. Υπάρχει μια γραμμική σχέση μεταξύ λοιμώδους και GA δραστηριότητας. Τα ζώα που έχουν ανοσοποιηθεί κατά της λύσσας παράγουν αντισώματα VNA, KSA, antiHA και λυτικά (καταστρέφοντας κύτταρα που έχουν μολυνθεί με τον ιό παρουσία συμπληρώματος).

Η διάγνωση γίνεται με βάση τα επιδημιολογικά δεδομένα, τα συμπτώματα της νόσου, τις παθολογικές αλλαγές (είναι μικρότερης σημασίας) και, κυρίως, τα αποτελέσματα εργαστηριακή έρευνα.

Εργαστηριακή διάγνωση συνίσταται στη μελέτη του εγκεφάλου ζώων για την ανίχνευση του ιού AG σε IF, RDP, την ανίχνευση σωμάτων Babes-Negri και μια βιοδοκιμασία σε λευκά ποντίκια.

ΣΤΟ Ρωσική Ομοσπονδίαεπί του παρόντος, η παραγωγή κιτ για τη διάγνωση Β σε IF και RDP έχει οργανωθεί στο VNITIBP και στο KazNIVI.

Απομόνωση του ιού.Φρέσκα πτώματα μικρών ζώων αποστέλλονται στο εργαστήριο για έρευνα, από μεγάλα ζώα - το κεφάλι ή τον εγκέφαλο. Σε ορισμένες περιπτώσεις επιτρέπεται η κονσερβοποίηση εγκεφάλου σε 50% γλυκερίνη. Το πτώμα ή το κεφάλι πρέπει να συσκευαστεί προσεκτικά σε πλαστική σακούλα, ο εγκέφαλος - σε βάζο με γυάλινο ή λαστιχένιο πώμα, γεμάτο με παραφίνη. Το υλικό είναι συσκευασμένο σε δοχείο ανθεκτικό στην υγρασία. Μόνο οι μη συντηρημένοι εγκέφαλοι είναι κατάλληλοι για ιολογικές μελέτες. Πρέπει να θυμόμαστε ότι η αυτοψία, η εξαγωγή του εγκεφάλου και άλλες επεμβάσεις με παθολογικό υλικό πρέπει να γίνονται υπό συνθήκες στειρότητας και αυστηρής τήρησης των προσωπικών μέτρων πρόληψης: στερεώστε σταθερά το κεφάλι του ζώου, προστατέψτε τα χέρια με 2 ζευγάρια γάντια ( χειρουργική και ανατομική), βάλτε γυαλιά για την προστασία των ματιών και στη μύτη και το στόμα - έναν επίδεσμο γάζας 6 στρώσεων.

Εργαστηριακή έρευνα υλικούΗ λύσσα πραγματοποιείται εκτός σειράς. τα αποτελέσματα αναφέρονται αμέσως στον αγροτικό ιατρό και στον επικεφαλής γιατρό της περιφέρειας (πόλης).

Ένδειξη και ταυτοποίηση ιού. Η σειρά της έρευνας: από κάθε τμήμα του εγκεφάλου της αριστερής και της δεξιάς πλευράς (κέρατο Ammon, παρεγκεφαλίδα, εγκεφαλικός φλοιός και προμήκη), προετοιμάζονται 4 αποτυπώματα επιχρίσματος για IF και ανίχνευση σωμάτων Babesh-Negri. με εγκεφαλικο ιστο βαλε RDP? με αρνητικά αποτελέσματα τοποθετείται βιοδοκιμασία.

Ανίχνευση συγκεκριμένων φορέων ένταξης. Τα επιχρίσματα αποτυπωμάτων βάφονται σύμφωνα με τις μεθόδους Sellers, Muromtsev ή άλλες μεθόδους. Μετά τη χρώση, τα παρασκευάσματα εξετάζονται σε μικροσκόπιο φωτός με σύστημα εμβάπτισης. Η παρουσία συγκεκριμένων σωμάτων Babesh-Negri θεωρείται θετικό αποτέλεσμα (όταν χρωματίζεται σύμφωνα με τον Sellers - σαφώς καθορισμένοι οβάλ ή επιμήκεις κοκκώδεις σχηματισμοί ροζ-κόκκινου χρώματος στο πρωτόπλασμα, όταν χρωματίζονται σύμφωνα με τον Muromtsev - ανοιχτό μοβ με σκούρα μπλε εγκλείσματα Babesh -Τα νεγρικά σώματα, πιο συχνά βρίσκονται έξω από τα νευρικά κύτταρα.

Το πιο χαρακτηριστικό γνώρισμα των σωμάτων Babesh - Negri είναι η εσωτερική τους δομή, η οποία τους επιτρέπει να διαφοροποιούνται με απόλυτη ακρίβεια. Μικροί κόκκοι είναι ορατοί στο εσωτερικό - βασεόφιλοι κόκκοι σκούρου μπλε, ακόμη και μαύρου χρώματος, μεγέθους 0,2-0,5 μικρομέτρων.

Η διαγνωστική αξία της ανίχνευσης σωμάτων εγκλεισμού για ενδείξεις μόλυνσης από WB είναι γενικά αναγνωρισμένη. Ωστόσο, σε υγιή ζώα, ειδικά σε γάτες και λευκά ποντίκια, υπάρχουν σχηματισμοί, η παρουσία των οποίων μπορεί να προκαλέσει διαγνωστικές δυσκολίες. Σε ορισμένες περιπτώσεις, στον εγκέφαλο της γάτας, είναι δυνατό να διαφοροποιηθούν με σιγουριά τέτοια εγκλείσματα από τα σώματα Babes-Negri και εδώ συνιστάται η χρήση μεθόδων αναγνώρισης, ειδικά IF. Ομοίως, σε σκύλους που πέθαναν ως αποτέλεσμα δηλητηρίασης με δηλητήριο φιδιού ή βλάβη ηλεκτροπληξία, μπορεί κανείς να βρει σώματα εγκλεισμού που μοιάζουν με σώματα Babes-Negri. Τα σώματα Babesh-Negri ανιχνεύονται μόνο στο 65-85% των περιπτώσεων λύσσας, επομένως η απουσία τους δεν αποτελεί αρνητική απάντηση και το υλικό εξετάζεται σε άλλες δοκιμές (IF, RDP, βιοδοκιμασία).

ΑΝ.Μία από τις κύριες δοκιμές στη διάγνωση της Β. Με υψηλές επιδόσεις, επιτυγχάνεται σύμπτωση 99-100% με τη μέθοδο βιοδοκιμασίας. Συνήθως στη διαγνωστική πρακτική χρησιμοποιείται η άμεση μέθοδος του IF, η οποία πραγματοποιείται με τη χρήση φθορισμού Ig κατά της λύσσας. Η στερέωση των παρασκευασμάτων σε κρύο (8-10°C) ακετόνη πραγματοποιείται για τουλάχιστον 4 ώρες. Ως αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιούνται επιχρίσματα-αποτυπώματα του εγκεφάλου υγιών λευκών ποντικών. Τα αποτελέσματα λαμβάνονται υπόψη οπτικά σε ένα μικροσκόπιο φθορισμού με βάση την εκτίμηση της έντασης της λάμψης του συμπλέγματος AG-AT. Το AH VB ανιχνεύεται ως λαμπερά κιτρινοπράσινα ή πράσινα κοκκία διάφορα σχήματακαι τιμές σε κελιά (πιο συχνά εκτός κελιών). Η διάγνωση θεωρείται τεκμηριωμένη εάν βρεθεί επαρκής αριθμός (τουλάχιστον 10) τυπικών κόκκων με λαμπερή πράσινη λάμψη ή πολλές μικροσκοπικές κουκκίδες σε πολλά οπτικά πεδία.Στον έλεγχο δεν πρέπει να υπάρχει τέτοια λάμψη.

Για να αποδειχθεί η εξειδίκευση του φθορισμού του συμπλόκου AG-AT, χρησιμοποιείται η μέθοδος καταστολής IF, η οποία συνίσταται στην ικανότητα της λύσσας AG που σχετίζεται με μη φθορίζοντα AT να μην ανασυνδυάζεται με φθορίζοντα ειδικά AT. Για να γίνει αυτό, εφαρμόζεται 5% αντιλυσσικό μη φθορίζον Ig σε σταθερά παρασκευάσματα που παρασκευάζονται από τον υπό μελέτη εγκέφαλο, επωάζονται για 30 λεπτά στους 37°C σε υγρό θάλαμο, πλένονται με φυσιολογικό ορό και στη συνέχεια βάφονται με φθορίζον αντιλυσσικό Ig με τη συμβατική άμεση μέθοδο. Δεν πρέπει να υπάρχει φθορισμός στα παρασκευάσματα που έχουν υποστεί επεξεργασία με αυτόν τον τρόπο.

Η μέθοδος IF καθιστά δυνατή την ανίχνευση του WB στα κύτταρα του κερατοειδούς των ματιών και την προκαταρκτική διάγνωση in vivo: κατά τη διάρκεια της ασθένειας των ζώων, καθώς και 1-2 ημέρες ή περισσότερες πριν από την κλινική του εκδήλωση. Η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη ζώων που είναι ύποπτα για νόσο Β, καθώς και κλινικά υγιών σκύλων και γατών που έχουν δαγκώσει ανθρώπους και ζώα. Για να γίνει αυτό, προετοιμάζονται αποτυπώματα από τον κερατοειδή χιτώνα, τηρώντας όλους τους κανόνες προσωπικής ασφάλειας, ανοίγοντας την παλαπηβική σχισμή του ζώου με μια μεγάλη και δείκτεςκαι ελαφρώς διογκωμένο βολβός του ματιούπιέστε την επιφάνεια της γυάλινης διαφάνειας, οπισθοχωρώντας 0,5 cm από το άκρο. Είναι απαραίτητο να διασφαλιστεί ότι το ζώο δεν αναβοσβήνει με το τρίτο βλέφαρο, καθώς τα επιθηλιακά κύτταρα αφαιρούνται από το γυαλί και λαμβάνεται ένα επίχρισμα κακής ποιότητας. Τουλάχιστον 2 παρασκευάσματα που περιέχουν 2 αποτυπώματα γίνονται από κάθε μάτι. Για έλεγχο, τα αποτυπώματα του κερατοειδούς από υγιή ζώα παρασκευάζονται με παρόμοιο τρόπο. Μπορούν να μαγειρευτούν στο αγρόκτημα. Οι εκτυπώσεις ξηραίνονται στον αέρα, στερεώνονται σε ακετόνη για 4 ώρες στους 4°C, συσκευάζονται και αποστέλλονται στο εργαστήριο. Παρασκευάσματα λεκέδων, όπως στο IF, σύμφωνα με τη γενικά αποδεκτή μέθοδο.

Σε παρασκευάσματα που λαμβάνονται από άρρωστα ζώα ή εκείνα στο τέλος της περιόδου επώασης της νόσου, στο κυτταρόπλασμα πολλών επιθηλιακών κυττάρων, διαφορετικά σχήματαέντονα φωτεινοί κόκκοι διαφορετικών μεγεθών - από κουκκίδες που μοιάζουν με σκόνη έως 2 μικρά και περισσότερα. Με σκοπό την απόκτηση αξιόπιστα αποτελέσματασε κάθε παρασκεύασμα εξετάζονται 50-100 κύτταρα και συνολικά τουλάχιστον 200-400 κύτταρα από το ζώο. Τα αποτελέσματα της μικροσκοπίας θεωρούνται θετικά εάν βρεθούν 11% ή περισσότερα κύτταρα με χαρακτηριστικές εστίες φωταύγειας στα αποτυπώματα του κερατοειδούς χιτώνα του ζώου. Θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι σε παρασκευάσματα από υγιή ζώα (μάρτυρας), λόγω αυτοφθορισμού, μπορεί να υπάρχουν μεμονωμένα κύτταρα με εστίες παρόμοιες σε σχήμα και φωταύγεια.

Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι το IF καθιστά δυνατή την επιτάχυνση της ανταπόκρισης στην τελική διάγνωση με βιοδοκιμασία, καθώς η διάγνωση του Β μπορεί να καθοριστεί μόνο την 4-8η ημέρα μετά τη μόλυνση των ποντικών με το υλικό δοκιμής, και περίοδος επώασηςοι ασθένειες των ποντικών μπορούν να φτάσουν τις 20 ημέρες. Το IF μπορεί να ανιχνεύσει WB στους ιστούς του υπογνάθιου σιελογόνου αδένα. Παρασκευάζονται επιχρίσματα από τους υπογνάθιους σιελογόνους αδένες, λαμβάνοντας υλικό από τουλάχιστον 6 διαφορετικά σημεία του αδένα, αφού η κατανομή του ιού σε αυτόν είναι άνιση. Συχνά, για να αποκτήσετε αποτύπωμα, πρέπει να ασκήσετε ισχυρή πίεση, επειδή λόγω της αφθονίας της βλεννίνης, λίγο υλικό παραμένει στο γυαλί.

Παρουσιάστηκε η δυνατότητα αναγνώρισης της VB στο δέρμα με τη μέθοδο IF.Για το σκοπό αυτό λαμβάνονται δείγματα του τριχωτού της κεφαλής, καθώς και αισθητικών και απτικών τριχοθυλακίων του ρύγχους ή των πλευρικών αισθητηριακών θηλών (στο μάγουλο του σκύλου). Τα δείγματα φυλάσσονται στους -20 ή -70°C. Από αυτά γίνονται κρυοτομές, οι οποίες αντιμετωπίζονται με φθορίζουσα σφαιρίνη. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης IF που προέκυψαν από την αναγνώριση της VB στο δέρμα συσχετίζονται σε υψηλό βαθμό με τα δεδομένα που προέκυψαν από τη μελέτη του εγκεφάλου του ίδιου ζώου. Παρουσιάστηκε στενή συσχέτιση μεταξύ της ανίχνευσης του ιού AH σε δείγματα εγκεφάλου και ιστούς χειλιών με τη μέθοδο IF.

ΠΑΑ.Χρησιμοποιείται για την ανίχνευση του AH VB στον μη συντηρημένο εγκέφαλο ζώων που πέθαναν από λύσσα του δρόμου ή ποντικών που χρησιμοποιήθηκαν σε μια βιοδοκιμασία. Το RDP τοποθετείται με τη μικρομέθοδο σε γυάλινες αντικειμενοφόρες πλάκες χρησιμοποιώντας γέλη άγαρ 1-1,5% σύμφωνα με τη γενικά αποδεκτή μέθοδο. Το υψηλότερο ποσοστό θετικών αποτελεσμάτων ανιχνεύεται όταν χρησιμοποιείται το ακόλουθο στένσιλ: A - κέρατο αμμωνίου ( Σωστη πλευρα) Β - εγκεφαλικός φλοιός (δεξιά πλευρά). C - παρεγκεφαλίδα (δεξιά πλευρά).
D - προμήκης μυελός (δεξιά πλευρά). + (συν) - θετικός έλεγχος. - (μείον) - αρνητικός έλεγχος. 1, 2, 3, 4 - φρεάτια με αραίωση ειδικής ανοσοσφαιρίνης 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, αντίστοιχα

Με τσιμπιδάκια παρασκευάζεται από κάθε τμήμα του εγκεφάλου μια ομοιογενής μάζα που μοιάζει με πάστα, η οποία τοποθετείται στα αντίστοιχα φρεάτια. Από ποντίκια, εξετάζεται ολόκληρος ο εγκέφαλος. Από τις περιοχές του εγκεφάλου της αριστερής πλευράς παρασκευάζεται το AG με παρόμοιο τρόπο (για κάθε εξέταση απαιτούνται συνολικά 4 γυάλινες πλάκες με γέλη άγαρ). Η αντίδραση λαμβάνεται υπόψη μετά από 6, 24, 48 ώρες.Εάν υπάρχουν 1 ή 2-3 γραμμές καθίζησης μεταξύ φρεατίων που περιέχουν AG και ανοσοσφαιρίνη, η αντίδραση θεωρείται θετική.

Το RDP είναι απλό στην εκτέλεση και συγκεκριμένο, αλλά το ποσοστό ανίχνευσης του ιού AG στο υλικό δοκιμής είναι 45-70. Στη μελέτη του εγκεφάλου ποντικών που ελήφθη με θετική βιοδοκιμασία, το RDP αποκαλύπτει έως και το 100% των περιπτώσεων. Η απουσία σωμάτων Babesh-Negri, ο ειδικός φθορισμός και το αρνητικό RDP στο υλικό δοκιμής δεν δικαιολογούν τον αποκλεισμό της παρουσίας του ιού. Σε αυτή την περίπτωση, η τελική διάγνωση βασίζεται στα αποτελέσματα μιας βιοδοκιμασίας σε λευκά ποντίκια, ακολουθούμενη από ταυτοποίηση του ιού.

Βιοδοκιμασία.Είναι γενικά αποδεκτό ότι μια βιοδοκιμασία είναι περισσότερο αποτελεσματική μέθοδοςαπό τον εντοπισμό σωμάτων Babesh - Negri, IF, κλπ. Ωστόσο, σε ορισμένες περιπτώσεις αποδείχθηκε αρνητικός, παρά την επιβεβαίωση της διάγνωσης του B από την ανίχνευση σωμάτων εγκλεισμού και IF. Το ποσοστό των αρνητικών αποτελεσμάτων της βιοδοκιμασίας κυμάνθηκε από 1,3 έως 12.

Οι πληροφορίες σχετικά με τη διαφορετική αποτελεσματικότητα μιας βιοδοκιμασίας μπορούν να εξηγηθούν από διάφορους παράγοντες: την επιλογή ενός πειραματόζωου, τον αριθμό τους στο πείραμα, τη μέθοδο μόλυνσης, τη μέθοδο και την περίοδο αποθήκευσης του υλικού πριν από την είσοδο στο εργαστήριο. Το φαινόμενο της παρεμβολής μολυσματικών σωματιδίων με ανενεργά σωματίδια μπορεί επίσης να διαδραματίσει ρόλο εάν χρησιμοποιηθεί ανεπαρκώς αραιωμένο υλικό για ενοφθαλμισμό.

στον εγκέφαλο και σιελογόνων αδένωναλεπούδες και παλούδες που πέθαναν από λύσσα, βρέθηκε μια ουσία που αναστέλλει τη μολυσματικότητα του ιού, η οποία δεν επιτρέπει τη διάγνωση της νόσου σε αυτά τα ζώα με ενδοεγκεφαλική μόλυνση ποντικών. Η παρουσία μιας ανασταλτικής ουσίας στο υλικό δοκιμής δεν εμποδίζει την ανίχνευση του ιού AG με τη μέθοδο IF. για τους παλούδες και τις αλεπούδες, αυτή είναι η πιο ευαίσθητη διαγνωστική μέθοδος.

Από τα ζώα όλων των ειδών (κουνέλια, ινδικά χοιρίδια, ενήλικα λευκά ποντίκια και χάμστερ) που χρησιμοποιούνται για τη βιοδοκιμασία, τα θηλάζοντα ποντίκια προτιμώνται από πολλούς επειδή είναι πιο ευαίσθητα σε διαφορετικά στελέχη VB και λιγότερο επικίνδυνα για εργασία. Τα συριακά χάμστερ δεν είναι κατώτερα από τα ποντίκια σε ευαισθησία, αλλά είναι λιγότερο προσβάσιμα.

RSK.Η ανίχνευση της ειδικής AH σε RSK στη διάγνωση της λύσσας χρησιμοποιείται λιγότερο συχνά από άλλες μεθόδους. Το AG παρασκευάζεται από τον εγκέφαλο που αποστέλλεται για έρευνα. Για να γίνει αυτό, ο εγκεφαλικός ιστός (ιδιαίτερα πλούσιος σε AG, δέσμευση συμπληρώματος, κομμάτια του θαλάμου και του εγκεφαλικού στελέχους) λειοτριβείται σε ρυθμιστικό διάλυμα βερονάλης σε αναλογία 1:10 και αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα, μετά την οποία το εναιώρημα γίνεται αδρανοποιείται στους 56°C για 5 ώρες Μια τέτοια θεραπεία σκοτώνει τον ιό και αφαιρεί την αντισυμπληρωματικότητα του εγκεφαλικού ιστού χωρίς να βλάπτει το συγκεκριμένο αντιγόνο. Το εναιώρημα φυγοκεντρείται για 15 λεπτά στα 3500 min-1 από το υπερκείμενο, το οποίο είναι ένα υλικό για δοκιμή για την παρουσία AG, παρασκευάζονται διπλάσιες αραιώσεις από 1:2 έως 1:64 και χρησιμοποιούνται για έρευνα στο CSC. .

ELISA.Στην ELISA, ειδική χρώση AG στα εγκεφαλικά κύτταρα ζώων που πέθαναν από λύσσα ανιχνεύεται τόσο σε πρόσφατα ληφθέντα, αποθηκευμένα σε γλυκερίνη, όσο και σε δείγματα που αποθηκεύτηκαν χωρίς γλυκερίνη στους 20 ° C για 8-18 ώρες. Αυτή η δοκιμή είναι κατάλληλη για τη συνήθη διάγνωση της λύσσας σε ζώα, για την ανίχνευση AG WB σε τομές παραφίνης ιστών κατά τη μονιμοποίηση παρασκευασμάτων με διάλυμα φορμαλίνης 10% με pH 5,3 και επακόλουθη επεξεργασία σκευασμάτων ενσωματωμένων σε παραφίνη με πεψίνη.

Σε αντίθεση με το ROP σε ποντίκια και σε κυτταροκαλλιέργεια, η ELISA μπορεί να ανιχνεύσει την AT σε ζώα μέσα σε λίγες ώρες, η ELISA είναι η πιο πολλά υποσχόμενη εργαστηριακή μέθοδος για την ανίχνευση της AT και την ένδειξη του ίδιου του ιού. Μια εξπρές μέθοδος για τη διάγνωση της λύσσας είναι η τεχνική σύλληψης και η μέθοδος IF για την ανίχνευση AH BB. Έχει αποδειχθεί ότι η μέθοδος ανίχνευσης AH VB σε παραφινοποιημένες τομές με τη μέθοδο υπεροξειδάσης-αντιπεροξειδάσης είναι σημαντικά ανώτερη από τη μέθοδο ELISA. Το 1987 δημιουργήθηκε ένα κιτ Rapid Enzyme Immunodiagnosis of Rabies (RREID), κατάλληλο για επιδημιολογικές και εργαστηριακές μελέτες.

Αναγνώριση παραλλαγής με χρήση mAT. Με τη βοήθεια mAbs σε γλυκοπρωτεΐνες WB, επιλέχθηκαν παραλλαγές AG, μεταξύ των οποίων αναγνωρίστηκαν φαινοτυπικά θερμοευαίσθητες (μη λοιμογόνοι) παραλλαγές. Όταν χρησιμοποιήθηκαν 2 ομάδες mAbs, αποδείχθηκε ότι τα στελέχη αραίωσης διαφέρουν από τα τμχ. Διορθώστε τα στελέχη (Pasteur), CVS, Flury HEP, ERA και "πάπια" για καθοριστικούς παράγοντες AH. Η μελέτη 7 στελεχών που απομονώθηκαν από ασθενείς με άτομα Β που χρησιμοποιούν mAbs κατέστησε δυνατό τον εντοπισμό ορισμένων διαφορών μεταξύ αυτών και του στελέχους του εμβολίου σε σχέση με τους καθοριστικούς παράγοντες AH.

Είναι γενικά αποδεκτό ότι οι διαφορές ΑΤ μεταξύ άγριων στελεχών μπορούν να ανιχνευθούν χρησιμοποιώντας mAbs έναντι νουκλεοκαψιδίου ΑΤ Ν, που αντιδρούν με κυτταροπλασματικά εγκλείσματα κυττάρων μολυσμένων από ιό. αντι-γλυκοπρωτεΐνη (G AG), η οποία αντιδρά με τις μεμβράνες των μολυσμένων κυττάρων, λύει αυτά τα κύτταρα παρουσία συμπληρώματος και εξουδετερώνει τον ιό. Σε σχέση με την πιθανή μεταβλητότητα ΑΗ της επιφανειακής γλυκοπρωτεΐνης WB από διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές, μια ριβονουκλεοπρωτεΐνη που χαρακτηρίζεται από τον συντηρητισμό της δομής AG χρησιμοποιήθηκε ως προστατευτικό AG. Έτσι, όχι μόνο η πρωτεΐνη G, αλλά και το RNP VB έχουν προστατευτική δράση.

Οροδιάγνωση και αναδρομική διάγνωση. Αυτές οι μέθοδοι δεν είναι τυπικές για τη λύσσα, καθώς χρησιμοποιούνται μόνο για τον έλεγχο της ανοσίας μετά τον εμβολιασμό. Για την ανίχνευση και την τιτλοδότηση των αντισωμάτων μετά τον εμβολιασμό χρησιμοποιείται το pH, το οποίο ρυθμίζεται με τη γενικά αποδεκτή μέθοδο. Ένα σταθερό WB χρησιμοποιείται ως AG. Το RN στα κύτταρα BHK-21 ήταν πιο ευαίσθητο από το έμμεσο IF στην ανίχνευση ΑΤ στους ορούς των εμβολιασμένων αλεπούδων. Επιπλέον, έχουν προταθεί RTGA και ELISA.

RTGA.Δεν έχει βρει ακόμη ευρεία εφαρμογή στη διαγνωστική πρακτική λόγω της παρουσίας μη ειδικών αναστολέων στους ορούς αίματος, στους οποίους το WB είναι εξαιρετικά ευαίσθητο και το πιο σημαντικό, το GA AG, που δεν υποβλήθηκε σε επαρκή καθαρισμό, είχε χαμηλή ευαισθησία. Για την παρασκευή του HA AG WB προτείνεται η χρήση τεμ. Μόσχα αναπτύχθηκε σε κυτταρική καλλιέργεια VNK-21 μετά από επεξεργασία με σαπωνίνη που ακολουθείται από καθαρισμό και συμπύκνωση. Το ΗΑ διαχωρίζεται από άλλα συστατικά του ιού με υπερφυγοκέντρηση. Το παρασκεύασμα που προέκυψε είχε βαθμό καθαρισμού 99,92%, είχε υψηλή δραστικότητα GA (1:128), καλά διατηρημένο για 1 μήνα σε ρΗ 5-9.

Πριν από την εγκατάσταση του RTGA, θα πρέπει να πραγματοποιηθεί μια μέτρια 2-πλάσια τρυψινοποίηση των ερυθροκυττάρων χήνας για την ευαισθητοποίησή τους. Όταν χρησιμοποιείται ένα εναιώρημα 0,25% ερυθροκυττάρων που έχουν υποστεί θρυψίνη (κατά προτίμηση 107 κύτταρα ανά 1 ml), η ευαισθησία του RTGA αυξάνεται κατά 4 φορές. Για την αραίωση του AG και των ορών, χρησιμοποιείται ένα διάλυμα βορικού άλατος (pH 9) με την προσθήκη 0,4% αλβουμίνης βόειου ορού. Ένα εναιώρημα ερυθροκυττάρων παρασκευάζεται σε αλατούχο διάλυμα με όξινο pH, έτσι ώστε μετά από συνδυασμό με ένα μείγμα ιού και ορών, του οποίου το pH είναι 9, το τελικό pH θα ρυθμιστεί εντός 6,2. Μετά την προσθήκη του εναιωρήματος των ερυθροκυττάρων στα φρεάτια, το πλαίσιο ανακινείται, σφραγίζεται με διαφανές φιλμ και τοποθετείται σε πάγο. Τα αποτελέσματα του RTHA λαμβάνονται υπόψη μετά από 40-50 λεπτά και με ερυθροκύτταρα κοτόπουλων 2 ημερών ή πιθήκων ρέζους - μετά από 1-1,5 ώρα.

Αναπτύχθηκε μια ραδιοανοσοδοκιμασία που βασίζεται στην ικανότητα του ΑΤ να συνδέεται με το σημασμένο 125 1-AG WB. Η επισημασμένη IgG που απομονώθηκε από υπεράνοσο ορό κατά της λύσσας μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση του WB AG με RIA στερεάς φάσης. Τα καλύτερα αποτελέσματα λήφθηκαν χρησιμοποιώντας διάλυμα φωσφορικού άλατος (pH 6,0) με ιοντική ισχύ 0,01 Μ και επισημασμένο IgG με δραστηριότητα 200-250 χιλιάδες παλμούς / λεπτό.

Το ανταγωνιστικό RIA στερεάς φάσης εφαρμόζεται για την ανίχνευση αντισωμάτων λύσσας στον ορό και τα υπερκείμενα υβριδώματα.

Διαφορική Διάγνωση. Είναι απαραίτητο να αποκλειστεί η νόσος του Aujeszky, στην οποία τα άρρωστα ζώα δεν είναι επιθετικά, δεν υπάρχει διαστροφή της όρεξης. Στους σκύλους αποκλείεται η νευρική μορφή της πανώλης. Η λύσσα είναι ύποπτη για λοιμώδη εγκεφαλομυελίτιδα των ιπποειδών. Ένα σύμπλεγμα εργαστηριακών εξετάσεων σας επιτρέπει να κάνετε μια ακριβή διάγνωση της λύσσας. Προτεινόμενα νέα μέθοδοςδιαφοροποίηση διαφόρων στελεχών του VB, με βάση την περιοριστική διάσπαση των προϊόντων ενίσχυσης σε PCR του τμήματος γονιδίου Ν.

ΔΙΑΚΡΑΤΙΚΟ ΣΥΜΒΟΥΛΙΟ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗΣ. ΜΕΤΡΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ

ΔΙΑΚΡΑΤΙΚΟ ΣΥΜΒΟΥΛΙΟ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗΣ. ΜΕΤΡΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ

ΔΙΑΠΟΛΙΤΕΙΑΚΟΣ

ΠΡΟΤΥΠΟ

ΤΩΝ ΖΩΩΝ

Επίσημη έκδοση

Τυπική μορφή

Πρόλογος

Οι στόχοι, οι βασικές αρχές και η βασική διαδικασία για την εκτέλεση εργασιών για τη διακρατική τυποποίηση καθορίζονται από το GOST 1.0 - 92 «Διακρατικό σύστημα τυποποίησης. Βασικές αρχές των διατάξεων» και GOST 1.2-2009 «Διακρατικό σύστημα τυποποίησης. Διακρατικά πρότυπα. κανόνες και συστάσεις για διακρατική τυποποίηση. Κανόνες ανάπτυξης. αποδοχή, αίτηση, ανανέωση και ακύρωση»

Σχετικά με το πρότυπο

1 ΑΝΑΠΤΥΞΕ από το Ομοσπονδιακό Κράτος ίδρυμα προϋπολογισμού«Ολορωσικό Κρατικό Κέντροποιότητα και τυποποίηση φάρμακαγια ζώα και ζωοτροφές" (FGBU "VGNKI")

2 ΕΙΣΑΓΘΗΚΕ από την Ομοσπονδιακή Υπηρεσία Τεχνικού Κανονισμού και Μετρολογίας της Ρωσικής Ομοσπονδίας

3 ΕΓΚΡΙΘΗΚΕ από το Διακρατικό Συμβούλιο Τυποποίησης, Μετρολογίας και Πιστοποίησης (Πρακτικά της 27ης Ιουνίου 2013 Αρ. 57-Π)

Σύντομη ονομασία της χώρας σύμφωνα με το MK (ISO 3166) 004-97	Κωδικός χώρας αρ. MK (ISO 3166) 004-97	Συντομευμένη ονομασία του εθνικού οργανισμού τυποποίησης
		Υπουργείο Οικονομίας της Δημοκρατίας της Αρμενίας
Λευκορωσία		Κρατικό Πρότυπο της Δημοκρατίας της Λευκορωσίας
Κιργιζιστάν		Κιργιζιστάν
		Μολδαβία-Πρότυπο
		Gosstandart
Ουζμπεκιστάν		Uzsgandart

4 Με εντολή της Ομοσπονδιακής Υπηρεσίας Τεχνικού Κανονισμού και Μετρολογίας της 30ης Σεπτεμβρίου 2013 No. 1127-st, το διακρατικό πρότυπο GOST 26075-2013 τέθηκε σε ισχύ ως εθνικό πρότυπο της Ρωσικής Ομοσπονδίας από την 1η Ιανουαρίου 2015

5 ΑΝΤΙ GOST 26075-54

Πληροφορίες σχετικά με αλλαγές σε αυτό το πρότυπο δημοσιεύονται στον ετήσιο δημοσιευμένο ευρετήριο πληροφοριών "Εθνικά Πρότυπα" και το κείμενο των αλλαγών και τροποποιήσεων - στο μηνιαίο δημοσιευμένο ευρετήριο πληροφοριών "Εθνικά Πρότυπα". Σε περίπτωση αναθεώρησης (αντικατάστασης) ή ακύρωσης αυτού του προτύπου, θα δημοσιευθεί αντίστοιχη ειδοποίηση στο μηνιαίο δημοσιευμένο ευρετήριο πληροφοριών «Εθνικά Πρότυπα». Επίσης τοποθετούνται σχετικές πληροφορίες, ειδοποιήσεις και κείμενα σύστημα πληροφορίωνγενικής χρήσης - στον επίσημο ιστότοπο της Ομοσπονδιακής Υπηρεσίας Τεχνικού Κανονισμού και Μετρολογίας στο Διαδίκτυο

© Standartinform, 2014

Στη Ρωσική Ομοσπονδία, αυτό το πρότυπο δεν μπορεί να αναπαραχθεί πλήρως ή εν μέρει. αντιγράφεται και διανέμεται ως επίσημη δημοσίευση χωρίς την άδεια της Ομοσπονδιακής Υπηρεσίας Τεχνικού Κανονισμού και Μετρολογίας

ΔΙΑΚΡΑΤΙΚΟ ΠΡΟΤΥΠΟ

ΤΩΝ ΖΩΩΝ

Μέθοδοι εργαστηριακής διάγνωσης της λύσσας

Μέθοδοι Εργαστηριακής Διαγνωστικής Λύσσας

Ημερομηνία εισαγωγής - 2015 - 01 - 01

1 περιοχή χρήσης

Αυτό το πρότυπο ισχύει για όλα τα είδη θηλαστικών και καθιερώνει τις ακόλουθες μεθόδους για την εργαστηριακή διάγνωση της λύσσας:

Μέθοδος αντισωμάτων φθορισμού (MFA);

Μέθοδος για την απομόνωση του ιού της λύσσας σε μια κυτταρική καλλιέργεια νευροβλαστώματος ποντικού CCL-131 (ή νευρίνωμα κόμβου Gasser του αρουραίου - NGUK-1).

Βιοδοκιμή σε λευκά ποντίκια:

Μέθοδος ενζυμικής ανοσοπροσροφητικής δοκιμασίας (ELISA);

Αντίδραση κατακρήμνισης διάχυσης (RDP).

Σημειώσεις

1 Αυτές οι μέθοδοι ισχύουν για όλα τα μέλη του γένους Lyssavwus.

2 Ο ιός της λύσσας του δρόμου ανήκει σε μικροοργανισμούς 2ης κατηγορίας παθογένειας (ενέχει θανάσιμο κίνδυνο για ανθρώπους και ζώα).

3 Εάν είναι απαραίτητο, γονότυπος του ιού της λύσσας χρησιμοποιώντας έτοιμο συστήματα δοκιμήςχρησιμοποιείται η μέθοδος αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης της αντίστροφης μεταγραφάσης (RT-PCR).

2 Κανονιστικές αναφορές

Αυτό το πρότυπο χρησιμοποιεί κανονιστικές αναφορές στα ακόλουθα πρότυπα:

GOST ISO/IEC 17025 - 2009 Γενικές Προϋποθέσειςστην αρμοδιότητα των εργαστηρίων δοκιμών και βαθμονόμησης

GOST 12.0.004 - 90 Σύστημα προτύπων επαγγελματικής ασφάλειας. Οργάνωση εκπαίδευσης για την ασφάλεια της εργασίας. Γενικές προμήθειες

GOST 12.1.005-68 Σύστημα προτύπων ασφάλειας εργασίας. Γενικές απαιτήσεις υγιεινής και υγιεινής για τον αέρα του χώρου εργασίας

GOST 12.1.008 - 76 Σύστημα προτύπων επαγγελματικής ασφάλειας. βιολογική ασφάλεια. Γενικές Προϋποθέσεις

GOST 12.4.011 - 89 Σύστημα προτύπων επαγγελματικής ασφάλειας. Μέσα προστασίας των εργαζομένων. Γενικές απαιτήσεις και ταξινόμηση

GOST 17.0.0.01 - 76 Σύστημα προτύπων στον τομέα της προστασίας της φύσης και της βελτίωσης της χρήσης των φυσικών πόρων. Βασικά σημεία

GOST 177-88 Υπεροξείδιο του υδρογόνου. Προδιαγραφές GOST 2603 - 79 Αντιδραστήρια. Ακετόνη. Προδιαγραφές GOST 2768 - 84 Τεχνική ακετόνη. Προδιαγραφές GOST 4204 - 77 Αντιδραστήρια. Θειικό οξύ. Προδιαγραφές GOST 6709 - 72 Απεσταγμένο νερό. Προδιαγραφές.

GOST ISO 7218 - 2011 Μικροβιολογία τρόφιμακαι ζωοτροφές. Γενικές απαιτήσεις και συστάσεις για μικροβιολογικές μελέτες

GOST 8074 - 82 Μικροσκόπια οργάνων. Τύποι, βασικές παράμετροι και μεγέθη. Τεχνικές απαιτήσεις.

GOST 9147 - 80 Εργαστηριακά υαλικά και εξοπλισμός από πορσελάνη. Προδιαγραφές GOST 9284-75 Διαφάνειες μικροσκοπίου. Προδιαγραφές GOST 12026 - 76 Εργαστηριακό διηθητικό χαρτί. Προδιαγραφές GOST 13739-78 Λάδι εμβάπτισης για μικροσκοπία. Τεχνικές απαιτήσεις. Μέθοδοι δοκιμής

GOST 16317-87 Οικιακές ηλεκτρικές συσκευές ψύξης. Γενικά Χαρακτηριστικά

GOST 21241-69 Ιατρικές λαβίδες. Γενικά Χαρακτηριστικά.

GOST 22967 - 90 Ιατρικές σύριγγες ένεσης επαναχρησιμοποιήσιμο. Γενικές τεχνικές απαιτήσεις και μέθοδοι δοκιμής

GOST 24661 - 91 (ISO 7866 84) Σύριγγες για ένεση μιας χρήσης

GOST 25046 - 81 (ISO 7864-81) Βελόνες ένεσης μιας χρήσης. Κύριες διαστάσεις. Τεχνικές απαιτήσεις. Μέθοδοι δοκιμής

GOST 25336 - 82 Εργαστηριακά υαλικά και εξοπλισμός. Τύποι, βασικές παράμετροι και διαστάσεις

GOST 29230 - 91 (ISO 835-4-81) Εργαστηριακά υαλικά. Οι πιπέτες αποφοίτησαν. Μέρος 4. Φυσήξτε πιπέτες

Σημείωση - Όταν χρησιμοποιείτε αυτό το πρότυπο, συνιστάται να ελέγχετε την εγκυρότητα των προτύπων αναφοράς στο δημόσιο σύστημα πληροφοριών - στον επίσημο ιστότοπο της Ομοσπονδιακής Υπηρεσίας Τεχνικού Κανονισμού και Μετρολογίας στο Διαδίκτυο ή σύμφωνα με τον ετήσιο δείκτη πληροφοριών "Εθνικά πρότυπα" , το οποίο δημοσιεύτηκε την 1η Ιανουαρίου του τρέχοντος έτους, και τα τεύχη του μηνιαίου πληροφοριακού ευρετηρίου «Εθνικά Πρότυπα» για το τρέχον έτος. Εάν το πρότυπο αναφοράς αντικατασταθεί (τροποποιηθεί), τότε όταν χρησιμοποιείτε αυτό το πρότυπο, θα πρέπει να καθοδηγηθείτε από το πρότυπο αντικατάστασης (τροποποιημένο). Εάν το αναφερόμενο πρότυπο ακυρωθεί χωρίς αντικατάσταση, η διάταξη στην οποία αναφέρεται η αναφορά σε αυτό ισχύει στον βαθμό που αυτή η αναφορά δεν επηρεάζεται.

3 Όροι, ορισμοί και συντμήσεις

3.1 Οι ακόλουθοι όροι χρησιμοποιούνται σε αυτό το πρότυπο με τους αντίστοιχους ορισμούς τους:

3.1.1 λύσσα μολυσματική ασθένεια ανθρώπων και ζώων που προκαλείται από μέλη της οικογένειας Rhabdoviridae του γένους Lyssavirus (ραβδοϊός) με αποτέλεσμα θανατηφόρο αποτέλεσμαστο 100% των περιπτώσεων.

3.1.2 Ιός λύσσας: Παθογόνο μολυσματική ασθένειαάνθρωπος και ζώα.

3.1.3 Επιφανειακές πρωτεϊνικές δομές αντιγόνου ιού λύσσας του ιού της λύσσας κατά του οποίου παράγονται αντισώματα.

3.1.2 Μέθοδος αντισωμάτων φθορισμού (MFA): Μια μέθοδος για την ανίχνευση του αντιγόνου του ιού της λύσσας με αντιλυσσικά αντισώματα σημασμένα με εοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη, με το σχηματισμό χαρακτηριστικών συμπλεγμάτων φωτεινής εγκλεισμού που ανιχνεύονται στο οπτικό πεδίο ενός μικροσκοπίου φθορισμού .

3.1.3 μέθοδος απομόνωσης του ιού της λύσσας σε κυτταρική καλλιέργεια νευροβλαστώματος ποντικού CCL-131 (ή νευρίνωμα γαγγλίου Gasser αρουραίου - NGUK-1): Μέθοδος απομόνωσης αντιγόνου του ιού της λύσσας. με βάση την αναπαραγωγή του ιού σε κυτταροκαλλιέργεια και την ταυτοποίησή του με τη μέθοδο των φθοριζόντων αντισωμάτων.

3.1.3 βιοδοκιμασία: Μέθοδος απομόνωσης του ιού της λύσσας σε λευκά ποντίκια με έγχυση εναιωρήματος παθολογικού υλικού, ακολουθούμενη από ταυτοποίηση του ιού με τη μέθοδο των φθοριζόντων αντισωμάτων.

3.1.4 Μέθοδος ενζυμικής ανοσοπροσροφητικής δοκιμασίας (ELISA) για την ανίχνευση αντιγόνου του ιού της λύσσας με βάση την ειδική του αλληλεπίδραση με ένα αντίσωμα κατά της λύσσας ακινητοποιημένο σε έναν στερεό φορέα, που ακολουθείται από ανίχνευση του δεσμευμένου αντιγόνου χρησιμοποιώντας ένα δεύτερο σημασμένο με ένζυμο αντίσωμα με χρώση του προϊόντος της αντίδρασης με ένα χρωμογόνο.

3.1.5 Δοκιμή κατακρήμνισης διάχυσης (RDP): Μια μέθοδος για την ανίχνευση του ιού της λύσσας που βασίζεται στην ικανότητα των αντισωμάτων και του ιικού αντιγόνου της λύσσας να διαχέονται σε γέλη άγαρ και, μετά από ειδική αλληλεπίδραση, να σχηματίζουν ένα σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος ορατό στο γυμνό μάτι με τη μορφή γραμμής καθίζησης.

3.1.6 Μέθοδος αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφάσης (RT-PCR) για την ανίχνευση του γονιδιώματος του ιού της λύσσας με μετάφραση της συγκεκριμένης αλληλουχίας RNA του ιού σε DNA, ακολουθούμενη από επαναλαμβανόμενη αντιγραφή του DNA που προκύπτει και ανίχνευση προϊόντων αντίδρασης, που πραγματοποιείται in vitro .

3.2 Οι ακόλουθες συντομογραφίες χρησιμοποιούνται σε αυτό το πρότυπο:

FAG - φθορίζουσα ανοσοσφαιρίνη κατά της λύσσας.

ANG - αντιλυσσική σφαιρίνη.

CFG - φθορίζουσα σφαιρίνη ελέγχου.

PBS - ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών.

NGUK-1-νευρίνωμα Κόμβος Gasser του αρουραίου.

FITC - ισοθειοκινική φλουορεσκεΐνη:

RNA - ριβονουκλεϊκό οξύ:

DNA - δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ:

CCN31 - κυτταρική καλλιέργεια νευροβλαστώματος ποντικού:

OFD - ορθοφαινυλοδιαμίνη;

ΤΜΒ - τετραμεθυλοβενζιδίνη.

4 Συνθήκες έρευνας και απαιτήσεις ασφάλειας

4.1 Συνθήκες έρευνας

4.1.1 Γενικές απαιτήσεις για μικροβιολογική ανάλυση και εργασία με μικροοργανισμούς ομάδων παθογένειας I - II - σύμφωνα με το GOST ISO 7218.

4.1.2 Γενικές απαιτήσεις για χώρους - σύμφωνα με το GOST ISO 7218.

4.1.3 Απαιτήσεις για προσωπικό - σύμφωνα με GOST ISO 7218, GOST ISO / IEC 17025. (1).

Οι ειδικευμένοι υπάλληλοι με εμπειρία στην εργασία με μικροοργανισμούς ομάδων παθογένειας I-II, οι οποίοι έχουν μελετήσει τις μεθόδους μικροβιολογικής εργασίας, επιτρέπεται να διεξάγουν έρευνα. εμβολιασμένο κατά της λύσσας.

4.2 Απαιτήσεις ασφαλείας

4.2.1 Γενικές απαιτήσεις ασφάλειας για εργασία σύμφωνα με το GOST 12.1.008.

4.2.2 Ο προστατευτικός εξοπλισμός για τους εργαζόμενους πρέπει να συμμορφώνεται με τις απαιτήσεις του GOST 12.4.011.

4.2.3 Ο αέρας του χώρου εργασίας πρέπει να συμμορφώνεται με τις απαιτήσεις του GOST 12.1.005.

4.2.4 Εκπαίδευση του προσωπικού ασφάλειας εργασίας σύμφωνα με το GOST 12.0.004.

4.2.5 Απόρριψη του υλικού που ελήφθη για τη μελέτη, καθώς και του χρησιμοποιημένου εξοπλισμού ατομικής προστασίας, εργαλείων κ.λπ. διενεργείται με βρασμό για 30 λεπτά ή σε αυτόκαυστο για 15 λεπτά σε πίεση (0,11 ± 0,20) MPa.

5 Όργανα μέτρησης, εξοπλισμός, υλικά, αντιδραστήρια και ζώα

5.1 Για ερευνητική χρήση:

Φασματοφωτόμετρο σάρωσης με φασματικό εύρος μηκών κύματος από 190 έως 1100 nm με σφάλμα όχι μεγαλύτερο από ± 0,5 nm και εύρος μετρήσεων οπτικής πυκνότητας (OD) από 0,1 έως 3,0.

Πλάκες για ανοσολογικές αντιδράσεις 96 φρεατίων:

Θερμοστάτης που διατηρεί τη θερμοκρασία από 20 "-C έως 50 ° C:

Οικιακό ψυγείο, που παρέχει συντήρηση θερμοκρασίας από 0 ° C έως 10 ° C σύμφωνα με το GOST 16317:

εργαστηριακή φυγόκεντρος?

μπάνιο;

Αντεστραμμένο μικροσκόπιο φωταύγειας σύμφωνα με το GOST 8074:

Κονιάματα πορσελάνης με γουδοχέρι σύμφωνα με το GOST 9147 ή ομογενοποιητή σύμφωνα με το GOST ISO/IEC 17025.

Διαφάνειες σύμφωνα με το GOST 9284:

Γυάλινοι δοκιμαστικοί σωλήνες σύμφωνα με το GOST 25336.

Πιάτα Petri σύμφωνα με το GOST 25336.

Κουβέτα σύμφωνα με το GOST 25336.

Πιπέτες χωρητικότητας 1,0. 2,0 και 10,0 cm 3 σύμφωνα με το GOST 29230.

Αυτόματες πιπέτες χωρητικότητας 0,05 έως 0,20 cm 3 με μύτες:

Ιατρικές λαβίδες σύμφωνα με το GOST 21241:

Σύριγγες ινσουλίνης χωρητικότητας 1,0 cm 3 σύμφωνα με το GOST 22967 ή το GOST 24861.

Βελόνες ένεσης σύμφωνα με το GOST 25046:

Γυαλιά καλλιέργειας για οκτώ τρύπες.

Κλουβιά για τη διατήρηση ποντικών.

Ακετόνη σύμφωνα με GOST 2603 ή GOST 2768.

Φθορίζουσα ανοσοσφαιρίνη κατά της λύσσας (FAG);

Κατά της λύσσας σφαιρίνη (AnG);

Φθορίζουσα σφαιρίνη ελέγχου (CFG).

Μη φθορίζον λάδι εμβάπτισης σύμφωνα με το GOST 13739.

Απεσταγμένο νερό σύμφωνα με το GOST 6709.

Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών με μοριακή συγκέντρωση 0,01 mol/dm 3 (PBS). pH 7,2 - 7,4;

- στείρο διάλυμα χλωριούχου νατρίου 0,9% ισοτονικό:

Κυτταρική καλλιέργεια νευροβλαστώματος ποντικού CC31 ή μη ερυνώματος κόμβος Gasser του αρουραίου -

Πενικιλλίνη;

Στρεπτομυκίνη;

Medium Needle MEM με διπλό σετ αμινοξέων και βιταμινών (DMEM), pH 7,2;

Διάλυμα θρυψίνης 0,25%;

Ορός εμβρυϊκού αίματος βοοειδών για κυτταροκαλλιέργειες 10%;

Γλουταμίνη 3%;

Υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% σύμφωνα με το GOST 177.

Ένα σύνολο παρασκευασμάτων για την εργαστηριακή διάγνωση της λύσσας των ζώων με ELISA.

Διάλυμα θειικού οξέος με μοριακή συγκέντρωση 2 mol / dm 3 σύμφωνα με το GOST 4204.

Διηθητικό χαρτί σύμφωνα με το GOST 12026.

Σφραγίδα για την κατασκευή φρεατίων.

Merthiolate;

Άγαρ "Difko" ή παρόμοιο?

Διάλυμα μεθυλ πορτοκάλι 1% σε 50% αιθανόλη:

Αντιγόνα θετικά και αρνητικά.

Ορός κατά της λύσσας ή ανοσοσφαιρίνη.

Κλινικά υγιή λευκά ποντίκια βάρους 6-8 γρ.

5.2 Επιτρέπεται η χρήση άλλων οργάνων μέτρησης με μετρολογικά χαρακτηριστικά και εξοπλισμός με τεχνικά χαρακτηριστικά όχι χειρότερα, καθώς και αντιδραστήρια και υλικά ποιότητας όχι κατώτερης από αυτά που αναφέρονται παραπάνω. Επιτρέπονται τα επιτραπέζια σκεύη μιας χρήσης.

6 Δειγματοληψία

6.1 Για τη διεξαγωγή έρευνας σχετικά με την παρουσία του ιού της λύσσας, αποστέλλεται παθολογικό υλικό στο εργαστήριο - ένα φρέσκο ​​πτώμα ή κεφάλι μικρών ζώων, το κεφάλι ή ο εγκέφαλος μεγάλων ζώων.

6.2 Το παθολογικό υλικό που επιλέγεται για έρευνα συσκευάζεται σε δοχείο ανθεκτικό στην υγρασία και παραδίδεται στο εργαστήριο σε μεταλλικά δοχεία. Το κατεψυγμένο υλικό τοποθετείται σε κρυοδοχείο.

6.3 Το παθολογικό υλικό συνοδεύεται από έγγραφο που περιέχει τα ακόλουθα στοιχεία. όνομα και διεύθυνση του αποστολέα, τύπος ζώου, αναμνηστικά και κλινικά και ελειοτολογικά δεδομένα.

6.4 Οι εργαστηριακές μελέτες διενεργούνται αμέσως μετά την παραλαβή του παθολογικού υλικού.

6.5 Για έρευνα, κομμάτια ιστού από κάθε μέρος του εγκεφάλου (κέρατα Ammon, παρεγκεφαλίδα, εγκεφαλικός φλοιός, προμήκη μυελός) μεγέθους 0,5 - 1,0 cm λαμβάνονται από μεγάλα ζώα. Ο εγκέφαλος μικρών ζώων, όπως ποντικών, εξετάζεται ως ένα ολόκληρο.

Μόνο φρέσκα ή φρέσκα κατεψυγμένα δείγματα εγκεφαλικού ιστού είναι κατάλληλα για τη μελέτη του MFA και της μεθόδου απομόνωσης του ιού της λύσσας σε κυτταρική καλλιέργεια νευροβλαστώματος ποντικού CCL-131 (ή NGUK-1). Δείγματα εγκεφάλου ζώων που αποσυντίθενται (στο στάδιο της αποσύνθεσης), συντηρούνται με γλυκερίνη, στερεώνονται με μεθυλική αλκοόλη, φορμαλίνη ή άλλα μέσα που προάγουν την εμφάνιση μη ειδικού φθορισμού δεν επιτρέπονται για έρευνα.

Για τη δημιουργία μιας βιοδοκιμασίας, επιτρέπεται η χρήση δειγμάτων εγκεφάλου διατηρημένα σε διάλυμα γλυκερίνης 30% -50% *. Δεν επιτρέπεται η χρήση άλλων συντηρητικών. Για συντήρηση, το παθολογικό υλικό μπορεί να καταψυχθεί σε θερμοκρασία που δεν υπερβαίνει τους μείον 10 C.

7 Μέθοδος αντισωμάτων φθορισμού (MFA)

7.1 Η ουσία της μεθόδου

Η ουσία της μεθόδου των φθοριζόντων αντισωμάτων έγκειται στην ειδική αλληλεπίδραση των φθοριζόντων αντισωμάτων κατά της λύσσας με το ομόλογο αντιγόνο του ιού της λύσσας. Το προκύπτον σύμπλοκο αντιγόνου-αντισώματος σημασμένο με FITC. ανιχνεύεται οπτικά από μια χαρακτηριστική λάμψη στο οπτικό πεδίο όταν παρατηρείται σε μικροσκόπιο φθορισμού.

7.2 Προετοιμασία για τη μελέτη

7.2.1 Προετοιμασία δείγματος

7.2.1.1 Τουλάχιστον τρία παρασκευάσματα (αποτυπώματα ή κηλίδες) από κάθε μέρος του εγκεφάλου παρασκευάζονται από τα κομμάτια ιστού που επιλέχθηκαν σύμφωνα με το 6.5 σε προσεκτικά απολιπασμένες γυάλινες πλάκες. Εάν η κατάσταση του παθολογικού υλικού το επιτρέπει, τότε προετοιμάζονται εκτυπώσεις, σε άλλες περιπτώσεις γίνονται επιχρίσματα.

7.2.1.2 Προετοιμασία εκτυπώσεων

Κομμάτια υφάσματος επιλεγμένα σύμφωνα με το 6.5. βάλτε σε διηθητικό χαρτί διπλωμένο σε τέσσερις έως έξι στρώσεις. Ο εγκέφαλος των μικρών ζώων κόβεται κατά μήκος, καταγράφοντας όλα τα τμήματα του και τον τοποθετεί με μια κομμένη πλευρά προς τα πάνω σε διηθητικό χαρτί διπλωμένο σε τέσσερα έως έξι στρώματα. Η κομμένη επιφάνεια αγγίζεται με μια γυάλινη διαφάνεια, πιέζοντάς την ελαφρά μέχρι να ληφθεί ένα λεπτό αποτύπωμα στο γυαλί.

7.2.1.3 Προετοιμασία επιχρισμάτων

Ένα κομμάτι ιστού από κάθε μέρος του εγκεφάλου (σε μικρά ζώα ολόκληρος ο εγκέφαλος), επιλεγμένο σύμφωνα με το 6.5. τρίβονται σε γουδί πορσελάνης με γουδοχέρι μέχρι να σχηματιστεί μια ομοιογενής μάζα, από την οποία γίνονται επαλείψεις σε γυάλινες πλάκες.

7.2.1.4 Ως έλεγχος, γίνονται επιχρίσματα ή αποτυπώματα από τους εγκεφάλους υγιών, απαλλαγμένων από λύσσα και μη εμβολιασμένων λευκών ποντικών, όπως περιγράφεται στα σημεία 7.3.1.2 και 7.3.1.3.

7.2.1.5 Μετά την προετοιμασία, τα επιχρίσματα ή τα αποτυπώματα στεγνώνουν στον αέρα για 20-30 λεπτά. στερεώνεται σε παγωμένη ακετόνη σε θερμοκρασία 4'C για 4 - 12 ώρες ή σε θερμοκρασία μείον 20 * C για 1 ώρα, μετά την οποία αφαιρείται από την ακετόνη και ξηραίνεται στον αέρα για 10 - 15 mJ.

7.2.2 Προετοιμασία αντιδραστηρίων

ΠΟΥΣΤΗΣ. Το Ang και το KFG διαλύονται με απεσταγμένο νερό στον αρχικό όγκο που αναγράφεται στην ετικέτα της αμπούλας. Διάρκεια ζωής των διαλυμένων FA. AnH και CFG σε θερμοκρασία (5 ± 2) C - όχι περισσότερο από δύο εβδομάδες.

Απευθείας για τη μελέτη, η απαιτούμενη ποσότητα διαλυμένου FAG. Τα AnG και KFG αραιώνονται με το FBI στην αραίωση εργασίας που υποδεικνύεται στην ετικέτα της αμπούλας. Αραιώσεις εργασίας διαλυμένων FAG. Το Ang και το CFG χρησιμοποιούνται την ημέρα της προετοιμασίας.

7.3 Διεξαγωγή της μελέτης

Οι αντικειμενοφόρες πλάκες με παρασκευάσματα (επιχρίσματα ή αποτυπώματα) σύμφωνα με το 7.2.1 τοποθετούνται σε υγρό θάλαμο (τρυβλίο Petri ή κυψελίδα με βρεγμένο πάτο). Στη συνέχεια, ένα από τα τρία παρασκευασμένα παρασκευάσματα επικαλύπτεται με FAG σε αραίωση εργασίας ομοιόμορφα σε ολόκληρη την επιφάνεια του επιχρίσματος ή του αποτυπώματος χρησιμοποιώντας μια πιπέτα. Η αραίωση εργασίας του KFG εφαρμόζεται στο δεύτερο παρασκεύασμα. Κλείστε το θάλαμο με φάρμακα. τοποθετείται σε θερμοστάτη σε θερμοκρασία (37 ± 1) * C και διατηρείται για 30

ελάχ. Τα παρασκευάσματα ελέγχου βάφονται παράλληλα. Στο τέλος της χρώσης, τα παρασκευάσματα πλένονται τρεις φορές, βυθίζοντάς τα κάθε φορά για 10 λεπτά σε δοχείο με PBS. Ξεπλύνετε με απεσταγμένο νερό και στεγνώστε στον αέρα για 20-30 λεπτά.

Η αραίωση εργασίας του Ang εφαρμόζεται στο τρίτο παρασκεύασμα. τοποθετείται σε θερμοστάτη σε θερμοκρασία (37 ± 1) * C και επωάζεται για 30 λεπτά. Στη συνέχεια το παρασκεύασμα πλένεται τρεις φορές, βυθίζοντας κάθε φορά για 10 λεπτά σε δοχείο με PBS. ξεπλένεται με απεσταγμένο νερό, ξηραίνεται στον αέρα για 20 - 30 λεπτά και βάφεται με αραίωση εργασίας FAG. όπως περιγράφεται παραπάνω.

7.4 Αποτελέσματα χειρισμού

Στα χρωματισμένα παρασκευάσματα, ο εγκεφαλικός ιστός που δεν έχει προσβληθεί από τον ιό της λύσσας λάμπει αμυδρά. γκριζοκίτρινο.

Το αντιγόνο του ιού της λύσσας ανιχνεύεται σε νευρώνες και εξωτερικά κύτταρα με τη μορφή λαμπερών πράσινων κόκκων διαφόρων σχημάτων και μεγεθών - από ελάχιστα αισθητά έως με διάμετρο 15-20 μικρά. Μερικές φορές υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός μικρών φωτεινών πράσινων σωματιδίων (μέγεθος έως 1 micron) στρογγυλού και ωοειδούς σχήματος.

Η διάγνωση της λύσσας θεωρείται τεκμηριωμένη εάν βρεθούν τυπικοί κιτρινοπράσινοι κόκκοι στο μελετημένο παρασκεύασμα σε διάφορα οπτικά πεδία του μικροσκοπίου. Ταυτόχρονα, σε σκευάσματα ελέγχου (σε επιχρίσματα ή αποτυπώματα από τον εγκέφαλο υγιών λευκών ποντικών χωρίς λύσσα, χρωματισμένα με FAG), καθώς και στα σκευάσματα που μελετήθηκαν, χρωματισμένα με CFG και προεπεξεργασμένα με AnG και χρωματισμένα με FAG. τέτοιοι σχηματισμοί δεν πρέπει να υπάρχουν.

Τα αποτελέσματα της μελέτης αναφέρονται στις αρμόδιες αρχές σύμφωνα με τη διαδικασία που ισχύει στην επικράτεια του κράτους που υιοθέτησε το πρότυπο.

8 περίπτωση αρνητικού αποτελέσματος, οι μελέτες πραγματοποιούνται στις 8 ή 9.

8 Μέθοδος για την απομόνωση του ιού της λύσσας σε κυτταρική καλλιέργεια νευροβλαστώματος ποντικού CCL-131

8.1 Η ουσία της μεθόδου

Η ουσία της μεθόδου έγκειται στην απομόνωση του ιού της λύσσας σε κυτταρική καλλιέργεια ποντικού.

νευροβλάστωμα CCL-131 ή NGUK-1 με την επακόλουθη ταυτοποίησή του με τη μέθοδο των φθοριζόντων αντισωμάτων.

Η μέθοδος είναι μια εναλλακτική λύση στη βιοδοκιμασία σε λευκά ποντίκια σύμφωνα με το 9.

8.2 Προετοιμασία για τη μελέτη

8.2.1 Προετοιμασία δείγματος

Ίσα μέρη ιστού που λαμβάνονται στείρα από κάθε μέρος του εγκεφάλου ενός μικρού ζώου (κέρατα Ammon, παρεγκεφαλίδα, εγκεφαλικός φλοιός, προμήκης μυελός) ή κομμάτια ιστού από κάθε τμήμα του εγκεφάλου ενός μεγάλου ζώου, που λαμβάνονται σύμφωνα με το 6.5. συνθλίβεται με ψαλίδι και αλέθεται σε γουδί ή ομογενοποιητή, προσθέτοντας σταδιακά ένα στείρο διάλυμα 0,9% ισοτονικού χλωριούχου νατρίου μέχρι να ληφθεί ένα εναιώρημα 10%. Στο εναιώρημα εγκεφάλου προστίθενται πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη σύμφωνα με τις μονάδες ΗΠΑ/cm 3 και 1 mg/cm 3 αντίστοιχα.

Το προκύπτον εναιώρημα αναμιγνύεται επιμελώς και φυγοκεντρείται για 5-10 λεπτά με ταχύτητα 2000 rpm. Το παραπάνω ιζηματογενές υγρό μεταφέρεται σε αποστειρωμένο δοκιμαστικό σωλήνα και αποθηκεύεται σε θερμοκρασία που δεν υπερβαίνει τους 4 °C μέχρι τη χρήση.

8.2.2 Προετοιμασία πλακών καλλιέργειας

Μια ημερήσια καλλιέργεια κυττάρων νευροβλαστώματος ποντικού CCL-131 (ή NGUK-1) αφαιρείται από τη φιάλη καλλιέργειας χρησιμοποιώντας διάλυμα θρυψίνης 0,25% και αραιώνεται με μέσο DMEM με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και 3% γλουταμίνη σε συγκέντρωση 2 * 10 s κύτταρα /cm 3. 0,1 cm 3 του προκύπτοντος αιωρήματος κυττάρων προστίθεται στα γυάλινα φρεάτια καλλιέργειας, καλύπτεται με καπάκι και τοποθετείται σε επωαστήρα υγρού CO g με περιεκτικότητα CO 5% σε θερμοκρασία (37 ± 1) ° C για 18- 20 ώρες

8.3 Διεξαγωγή της μελέτης

0,05 cm 3 εναιωρήματος από κάθε τμήμα του εγκεφάλου προστίθενται σε δύο φρεάτια γυαλιού καλλιέργειας σύμφωνα με το 8.2.2. Δύο φρεάτια αφήνονται σε κάθε αντικειμενοφόρο πλάκα για θετικό και αρνητικό έλεγχο. Ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιείται εναιώρημα του εγκεφάλου ενός ποντικού που έχει μολυνθεί με τον ιό της λύσσας - στέλεχος CVS. Ένα εναιώρημα του εγκεφάλου ενός κλινικά υγιούς ποντικιού εισάγεται ως αρνητικός μάρτυρας. Το γυαλί καλλιέργειας τοποθετείται σε επωαστήρα υγρού CO2 με περιεκτικότητα CO2 5% σε θερμοκρασία (37 ± 1) *C για 42–48 ώρες.

Στο τέλος της επώασης, το μέσο αφαιρείται από τα φρεάτια του γυαλιού καλλιέργειας χρησιμοποιώντας μια αυτόματη πιπέτα, τα κύτταρα πλένονται μία φορά με PBS (με τη χρήση αυτόματης πιπέτας, προστίθεται διάλυμα 0,2 cm 3 σε κάθε φρεάτιο) και ξηραίνονται σε στρωτή ροή αέρα για 20 - 30 λεπτά. Στη συνέχεια, 0,1 cm 3 ακετόνης που έχει ψυχθεί σε θερμοκρασία μείον 20 * C προστίθεται σε κάθε φρεάτιο και αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά.

Μετά τη στερέωση των κυττάρων, το γυαλί καλλιέργειας αναποδογυρίζεται και ανακινείται για να αφαιρεθεί η ακετόνη και στη συνέχεια ξηραίνεται σε στρωτή ροή αέρα για 20-30 λεπτά. Χρησιμοποιώντας ένα νυστέρι και ένα τσιμπιδάκι, αφαιρέστε το πλαστικό ακροφύσιο και στεγνώστε το ποτήρι για άλλα 5-10 λεπτά. 0,05 - 0,10 cm 3 FAG προστίθενται σε κάθε φρεάτιο σε αραίωση εργασίας (επιλεγμένη εμπειρικά) που παρασκευάζεται στο FBI. τοποθετείται σε υγρό τρυβλίο Petri και επωάζεται στους (37 ± 1) C για 30 λεπτά.

Στο τέλος της χρώσης, οι αντικειμενοφόρες πλάκες πλένονται τρεις φορές, βυθίζοντάς τις για 10 λεπτά κάθε φορά σε δοχείο με PBS. Στη συνέχεια τα σκευάσματα ξεπλένονται με απεσταγμένο νερό και στεγνώνουν στον αέρα για 20-30 λεπτά.

Το μη φθορίζον έλαιο εμβάπτισης εφαρμόζεται σε χρωματισμένα παρασκευάσματα και παρατηρείται κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού.

8.4 Αποτελέσματα χειρισμού

Σε χρωματισμένα παρασκευάσματα, μια κυτταρική καλλιέργεια που δεν επηρεάζεται από τον ιό της λύσσας λάμπει αμυδρά. γκριζοκίτρινο χρώμα (αρνητικός έλεγχος). Το αντιγόνο του ιού της λύσσας ανιχνεύεται στο κυτταρόπλασμα της κυτταρικής καλλιέργειας με τη μορφή λαμπερών πράσινων κόκκων διαφόρων σχημάτων και μεγεθών με καθαρά καθορισμένα άκρα (θετικός έλεγχος).

Η διάγνωση της λύσσας θεωρείται τεκμηριωμένη εάν βρεθούν τυπικοί κιτρινοπράσινοι κόκκοι στο παρασκεύασμα της δοκιμής σε διάφορα οπτικά πεδία του μικροσκοπίου.

Εάν ο ιός της λύσσας δεν ανιχνευθεί στην κυτταροκαλλιέργεια, τότε γίνεται αρνητική διάγνωση.

Τα αποτελέσματα της απομόνωσης του ιού της λύσσας σε κυτταρική καλλιέργεια είναι οριστικά, δεν πραγματοποιούνται περαιτέρω μελέτες.

9 Bistlerob σε λευκά ποντίκια

9.1 Η ουσία της μεθόδου

Η ουσία της μεθόδου έγκειται στην απομόνωση του ιού της λύσσας με ενδοεγκεφαλική έγχυση παθολογικού υλικού σε λευκά ποντίκια, ακολουθούμενη από ταυτοποίηση του ιού με τη μέθοδο των φθοριζόντων αντισωμάτων σύμφωνα με το 7.

9.2 Προετοιμασία δειγμάτων για εξέταση - σύμφωνα με το 6.2.1.

9.3 Διεξαγωγή της μελέτης

Πέντε-έξι λευκά ποντίκια μολύνονται με ένα εναιώρημα 10% παθολογικού υλικού im-tracerebral σε όγκο 0,02 - 0,03 cm3. Τα μολυσμένα ποντίκια τοποθετούνται σε ξεχωριστό κλουβί, στο οποίο επικολλάται μια ετικέτα που δείχνει την ημερομηνία μόλυνσης, τον αριθμό των ποντικών, τη μέθοδο μόλυνσης και τον αριθμό εξέτασης του παθολογικού υλικού. Τα ζώα παρατηρούνται για τουλάχιστον 30 ημέρες. Ο αριθμός των υγιών, ασθενών και νεκρών ποντικών καταγράφεται στο περιοδικό.

9.4 Αποτελέσματα χειρισμού

Κατά την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων, λαμβάνεται υπόψη η παρουσία κλινικών σημείων σε μολυσμένα ποντίκια (ζωηρό τρίχωμα, λήψη τροφής, μειωμένος συντονισμός κινήσεων, παράλυση, τρόμος, κατάπτωση). Ο θάνατος των ποντικών τις πρώτες δύο ημέρες μετά τη μόλυνση δεν λαμβάνεται υπόψη. Τα δείγματα εγκεφάλου από άρρωστα και νεκρά ζώα, ξεκινώντας από την τρίτη ημέρα, εξετάζονται από το MFA έως τις 7.

Μια βιοδοκιμασία θεωρείται θετική εάν, ξεκινώντας από την τρίτη ημέρα μετά τη μόλυνση, τουλάχιστον ένα ποντίκι αρρώστησε και πέθανε και ανιχνεύθηκαν συγκεκριμένα εγκλείσματα του ιού της λύσσας στο δείγμα του εγκεφάλου χρησιμοποιώντας MFA.

Αρνητική διάγνωση μπορεί να δοθεί μόνο μετά από 30 ημέρες παρατήρησης, υπό την προϋπόθεση ότι όλα τα μολυσμένα ζώα παραμένουν ζωντανά και υγιή.

Τα αποτελέσματα της βιοδοκιμασίας θεωρούνται οριστικά, δεν πραγματοποιείται περαιτέρω έρευνα.

10 Μέθοδος ενζυμικής ανοσοδοκιμασίας (ELISA)

10.1 Η ουσία της μεθόδου

8 Η ELISA βασίζεται στην ειδική αλληλεπίδραση του αντιγόνου του ιού της λύσσας με το αντιήλιο. ακινητοποιημένος σε στερεό φορέα. Το δεσμευμένο αντιγόνο ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας ένα δεύτερο σημασμένο με υπεροξειδάση αντίσωμα λύσσας. το προϊόν της αντίδρασης του οποίου χρωματίζεται με την προσθήκη ενός χρωμογόνου. Η ένταση της χρώσης του προϊόντος αντίδρασης είναι ευθέως ανάλογη με την ποσότητα του αντιγόνου.

10.2 Προετοιμασία για τη μελέτη

10.2.1 Ως υλικό δοκιμής (αντιγόνο), χρησιμοποιούνται δείγματα εγκεφαλικού ιστού νεκρών, αναγκαστικά θανατωμένων, ύποπτων λύσσας ή πειραματικά μολυσμένων ζώων με τον ιό της λύσσας.

10.2.2 Παρασκευή του δοκιμαστικού αντιγόνου

Δείγματα εγκεφαλικού ιστού που ελήφθησαν σύμφωνα με το 6.5 συνθλίβονται, αλέθονται σε γουδί και παρασκευάζονται εναιωρήματα 10% σε ισοτονικό διάλυμα χλωριούχου νατρίου C,9%, θερμαίνονται σε υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 60 * C για 15 λεπτά και φυγοκεντρούνται για 5-10 λεπτά στις 2000 rpm. Το υπερκείμενο χρησιμοποιείται ως το δοκιμαστικό αντιγόνο.

10.2.3 Παρασκευή αντιδραστηρίων

Όλα τα διαλύματα και τα αντιδραστήρια πριν από την έναρξη της αντίδρασης πρέπει να διατηρούνται για τουλάχιστον 30 λεπτά σε θερμοκρασία (22 ± 1) * C.

Η προετοιμασία των εξαρτημάτων του κιτ πραγματοποιείται σύμφωνα με τις οδηγίες χρήσης.

10.3 Διεξαγωγή της μελέτης

10.3.1 Η ELISA πραγματοποιείται σε έκδοση σάντουιτς χρησιμοποιώντας τα συστατικά που περιλαμβάνονται στο κιτ για την ανίχνευση του αντιγόνου του παθογόνου της λύσσας σε παθολογικό υλικό.

Για την ELISA, χρησιμοποιούνται πλάκες για ανοσολογικές αντιδράσεις με επίπεδο πυθμένα.

Ο όγκος των συστατικών που εισάγονται σταδιακά στα φρεάτια του δισκίου είναι ίσος μεταξύ τους και είναι

10.3.2 Ευαισθητοποίηση της πλάκας

6 φρεάτια μιας πλάκας πολυστυρενίου φορτώνονται με ANG στην αραίωση εργασίας που υποδεικνύεται στην ετικέτα. Η πλάκα με ANG καλύπτεται με καπάκι και επωάζεται σε θερμοστάτη σε θερμοκρασία (37 ± 0,5) * C για 3 ώρες ή σε θερμοκρασία 4 * C για 18 ώρες. Μετά την επώαση, τα φρεάτια της πλάκας πλένονται τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης. Ανακινήστε τα περιεχόμενα των πηγαδιών με κάθε πλύση. και το υπόλοιπο διάλυμα αφαιρείται χτυπώντας σε διηθητικό χαρτί.

10.3.3 Εφαρμογή αντιγόνων

8 σειρές πλάκας Α. 8 και Γ προσθέτουμε ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης. Τα θετικά αντιγόνα ελέγχου (φρεάτιο Α1) και αρνητικά (πηγαδάκι Α2) που περιλαμβάνονται στο κιτ, καθώς και τα δείγματα δοκιμής (φρεάτια ΑΖ. Α4 κ.λπ.) εισάγονται στα φρεάτια του δισκίου και τιτλοδοτούνται κατακόρυφα, λαμβάνοντας αραιώσεις από 1 : 2 έως 1: 8. Πότε σε μεγάλους αριθμούςτα δείγματα συμπληρώνονται σε άλλες σειρές του tablet. Η πλάκα καλύπτεται με ένα καπάκι και επωάζεται σε ερμοστάτη σε θερμοκρασία (37 ± 0,5) *C για 1 ώρα. Στο τέλος της επώασης, τα φρεάτια της πλάκας πλένονται τρεις φορές από αντιγόνα που δεν συνδέονται με ανοσοσφαιρίνη, όπως περιγράφεται στο 10.3.2.

10.3.4 Εφαρμογή συζυγούς λεροοξειδάσης λύσσας

Η αραίωση εργασίας του συζεύγματος κατά της λύσσας υπεροξειδάσης προστίθεται στα φρεάτια της πλάκας, στη συνέχεια καλύπτεται με ένα καπάκι και επωάζεται σε θερμοστάτη σε θερμοκρασία (37 ± 0,5) C για 1 ώρα. Στη συνέχεια τα φρεάτια της πλάκας επωάζονται πλύθηκε τρεις φορές όπως περιγράφεται στο 10.3.2.

10.3.5 Άπλωμα του μείγματος υποστρώματος

Για την εκδήλωση της αντίδρασης, το παρασκευασμένο μείγμα υποστρώματος προστίθεται στα φρεάτια του δισκίου. Η αντίδραση παρουσιάζεται για 15 - 30 λεπτά σε θερμοκρασία (22 ± 0,5) *C στο σκοτάδι. Η αντίδραση διακόπτεται με την προσθήκη διαλύματος θειικού οξέος με μοριακή συγκέντρωση 2 mol/DM3.

10.4 Αποτελέσματα χειρισμού

Η καταμέτρηση της αντίδρασης πραγματοποιείται οπτικά ή σε φασματοφωτόμετρο σάρωσης σύμφωνα με τις οδηγίες χρήσης του κιτ.

Εάν το OPD χρησιμοποιείται ως χρωμογόνο στο μείγμα του υποστρώματος. τότε η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας πραγματοποιείται στα 490 nm. εάν χρησιμοποιείτε TMB. τότε στα 450 χλμ.

Η αντίδραση θεωρείται μόνο εάν δεν υπάρχει ειδική χρώση στα φρεάτια με αρνητικό αντιγόνο μάρτυρα, ενώ εντατική χρώση στα φρεάτια με έλεγχο θετικό αντιγόνο. Κατά την οπτική μέτρηση, το δείγμα θεωρείται θετικό εάν τουλάχιστον μία (πρώτη) αραίωση εμφανίζει ειδική χρώση.

Όταν λαμβάνεται υπόψη φασματοφωτομετρικά το αποτέλεσμα της ELISA, πραγματοποιείται ο υπολογισμός του συντελεστή ειδικότητας K sp. η οποία είναι ίση με την αναλογία της οπτικής πυκνότητας (OD) του προϊόντος αντίδρασης στα φρεάτια με το θετικό αντιγόνο ελέγχου ή το υλικό δοκιμής (OD) προς την οπτική πυκνότητα του μείγματος υποστρώματος στα φρεάτια με το αρνητικό αντιγόνο ελέγχου (OD) . Η αντίδραση θεωρείται θετική. εάν ο συντελεστής ειδικότητας είναι μεγαλύτερος από 2,1 και αρνητικός εάν είναι μικρότερος από 2,1.

OP1 * 0,641, OPg a 0,120, Ksp \u003d 5,34 - η αντίδραση είναι θετική ή OP1 \u003d 0,180, OPg σε 0,120 K με „ * 1,5 - η αντίδραση είναι αρνητική.

Σε περίπτωση θετικής αντίδρασης, η διάγνωση θεωρείται τεκμηριωμένη. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα πρέπει να επιβεβαιωθεί με άλλες μεθόδους σύμφωνα με το 7 - 9.

11 Αντίδραση καθίζησης διάχυσης (RDP)

11.1 Ουσία μεθόδου

Η ουσία της μεθόδου RDP έγκειται στην ικανότητα των αντισωμάτων και ενός ιικού αντιγόνου να διαχέονται σε ένα πήκτωμα άγαρ και, μετά από ειδική αλληλεπίδραση, να σχηματίζουν ένα σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος, το οποίο είναι ορατό με γυμνό μάτι με τη μορφή μιας γραμμής καθίζησης.

11.2 Προετοιμασία εξετάσεων

11.2.1 Προετοιμασία δείγματος

Προετοιμασία δειγμάτων για έρευνα - σύμφωνα με το 8.2.1.

Επιτρέπονται δείγματα εγκεφάλου ζώων που έχουν μολυνθεί με βακτηριακή μικροχλωρίδα για έρευνα.

11.2.2 Παρασκευή άγαρ

Για να παρασκευάσετε άγαρ, αναμίξτε 1,5 g άγαρ Difko. 1 cm 3 1% διάλυμα μεθυλ πορτοκαλιού σε 50% αιθανόλη. 0,01 g μερθειολικού. 100 cm 3 ισοτονικό διάλυμα χλωριούχου νατρίου. Το προκύπτον μείγμα βράζεται μέχρι να λιώσει τελείως το άγαρ, χύνεται σε δοκιμαστικούς σωλήνες, αποστειρώνεται σε αυτόκλειστο σε πίεση 0,5 atm για 30 λεπτά και φυλάσσεται σε ψυγείο σε θερμοκρασία 4°C.

11.2.3 Προετοιμασία διαφανειών (πιάτα Petri)

Η αντίδραση τοποθετείται είτε σε γυάλινες πλάκες είτε σε τρυβλία Petri. Μια σταγόνα λιωμένου άγαρ εφαρμόζεται σε ένα απολιπασμένο γυαλί, κατανέμεται ομοιόμορφα στο γυαλί και αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου για 20-30 λεπτά για να στερεοποιηθεί το άγαρ. Στη συνέχεια, 2,5 cm 3 λιωμένου άγαρ εφαρμόζονται στο ποτήρι, σχηματίζοντας ένα στρώμα πάχους περίπου 2 mm. και αφήνουμε για 20-30 λεπτά. Οι τρύπες γίνονται σε ένα κατεψυγμένο στρώμα άγαρ χρησιμοποιώντας ειδική σφραγίδα ή μεταλλικό σωλήνα με λεπτό τοίχωμα διαμέτρου 4–5 mm. Οι στήλες άγαρ αφαιρούνται προσεκτικά, χωρίς να καταστρέψουν ή να αφήσουν ένα λεπτό στρώμα γέλης άγαρ να ξεκολλήσει από το γυαλί, χρησιμοποιώντας τσιμπιδάκια ματιών ή άλλο εργαλείο.

Τα τρυβλία Petri παρασκευάζονται με παρόμοιο τρόπο, προσθέτοντας 10 - 15 cm 3 τετηγμένου άγαρ σε αυτά για να ληφθεί ένα στρώμα πάχους 2-3 mm.

11.3 Διεξαγωγή της μελέτης

Αμέσως πριν από την έναρξη της αντίδρασης, παρασκευάζονται αραιώσεις ορού κατά της λύσσας (ανοσοσφαιρίνη), για τις οποίες προστίθενται 1,0 cm 3 ισοτονικού διαλύματος χλωριούχου νατρίου σε τέσσερις δοκιμαστικούς σωλήνες. Προσθέστε 1,0 cm 3 ορού κατά της λύσσας στον πρώτο δοκιμαστικό σωλήνα, λαμβάνοντας αραίωση 1:2.

αναμειγνύεται και μεταφέρεται 1,0 cm 3 του μείγματος σε δεύτερο δοκιμαστικό σωλήνα κ.λπ. Έτσι, λαμβάνονται τέσσερις δοκιμαστικοί σωλήνες με αραιώσεις 1: 2,1: 4,1: 8 και 1:16.

8 προετοιμασμένα φρεάτια συνεισφέρουν 0,05 - 0,07 cm 3 δείγματος εγκεφάλου (κάθε δείγμα σε ξεχωριστό φρεάτιο), που ελήφθη σύμφωνα με το 8.2.1. και αραιώσεις ορού κατά της λύσσας ή ανοσοσφαιρίνης (1:2; 1:4; 1:8:1:16) σύμφωνα με το σχήμα 1.

Εικόνα 1 - Σχέδιο εφαρμογής υλικού

Ar - το κέρατο του Emmon. Pm - προμήκης μυελός; A+ - αντιγόνο θετικού ελέγχου. M - παρεγκεφαλίδα? Κ - εγκεφαλικός φλοιός; A- - αντιγόνο αρνητικού ελέγχου.

είναι δυνατή η χρήση άλλων σχημάτων για την εισαγωγή υλικού, αλλά η χρήση θετικών και αρνητικών αντιγόνων είναι υποχρεωτική.

Οι αντικειμενοφόρες πλάκες με το υλικό δοκιμής τοποθετούνται σε δίσκους Petri με βρεγμένο πάτο ή υγρό ξηραντήρα και στη συνέχεια σε θερμοστάτη σε θερμοκρασία (37 ± 1) * C για 48 ώρες (τα τρυβλία Petri καλύπτονται με καπάκι και τοποθετούνται σε θερμοστάτης).

Η αντίδραση λαμβάνεται υπόψη μετά από 6,24 και 48 ώρες.

11.4 Αποτελέσματα χειρισμού

Η αντίδραση θεωρείται θετική όταν εμφανίζεται έστω και μία γραμμή καθίζησης οποιασδήποτε έντασης μεταξύ των φρεατίων που περιέχουν το υλικό δοκιμής και ορό κατά της λύσσας (ανοσοσφαιρίνη).

Σε αυτή την περίπτωση, θα πρέπει να παρατηρηθεί μια αξιοσημείωτη γραμμή καθίζησης μεταξύ του θετικού αντιγόνου και του ορού κατά της λύσσας (ανοσοσφαιρίνη) και δεν θα πρέπει να υπάρχει γραμμή καθίζησης μεταξύ του αρνητικού αντιγόνου και του ορού κατά της λύσσας (ανοσοσφαιρίνη).

Σε 8 περιπτώσεις θετικής αντίδρασης η διάγνωση θεωρείται τεκμηριωμένη. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα πρέπει να επιβεβαιωθεί με άλλες μεθόδους σύμφωνα με το 7-10.

βιβλιογραφία

Οδηγός ΕΕ για την ορθή παρασκευαστική πρακτική για φαρμακευτικά προϊόντα για ανθρώπινη και κτηνιατρική χρήση

UDC 619:616.98:579.852.1:615371 MKS 11.220

Λέξεις-κλειδιά: λύσσα, διαγνωστικά, μέθοδος αντισωμάτων φθορισμού, συνδεδεμένη ανοσοπροσροφητική δοκιμασία, βιοδοκιμασία, αντίδραση καθίζησης διάχυσης

Υπεγράφη για δημοσίευση στις 01/04/2014. Φόρμα 60x84V

Uel. pvc. μεγάλο. 1,40. Κυκλοφορία 31 εξ. Zach. 1363.

Συντάχθηκε με βάση την ηλεκτρονική έκδοση που παρέχεται από τον προγραμματιστή του προτύπου

FSUE "STANDARTINFORM"

123995 Μόσχα. Λωρίδα γρανάτης, 4.

ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΚΕΣ ΟΔΗΓΙΕΣ
ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΛΥΣΣΗΣ

1. Η διάγνωση της λύσσας γίνεται με βάση ένα σύμπλεγμα επιζωοτολογικών, κλινικών, παθοανατομικών δεδομένων και κυρίως με βάση εργαστηριακές εξετάσεις.

2. Για έρευνα, αποστέλλονται στο εργαστήριο με κούριερ: φρέσκο ​​πτώμα ή κεφάλι από σκύλο (γάτα, αλεπού, αρκτική αλεπού, πρόβατο, μοσχάρι κ.λπ.), από μεγάλα ζώα - κεφάλι ή εγκέφαλο (φρέσκο ​​ή κονσέρβα σε διάλυμα γλυκερίνης 30 - 50%). Μόνο οι μη συντηρημένοι εγκέφαλοι είναι κατάλληλοι για ορολογικές μελέτες.

3. Η εργαστηριακή διάγνωση της λύσσας συνίσταται σε μικροσκοπική εξέταση του εγκεφάλου (για την ανίχνευση σωμάτων Babes-Negri), ορολογική εξέταση (ανίχνευση συγκεκριμένου αντιγόνου λύσσας), καθώς και στη ρύθμιση βιολογικού τεστ σε λευκά ποντίκια ή κουνέλια .

Εντολή έρευνας.

4. Από τον εγκέφαλο που λήφθηκε για τη μελέτη, σπέρνονται πρώτα σε θρεπτικά μέσα. Μέρος του εγκεφάλου τοποθετείται αμέσως στο ψυγείο και αποθηκεύεται σε περίπτωση ανάγκης επανεξέτασης. Λαμβάνεται υλικό από τον υπόλοιπο εγκέφαλο για μικροσκοπική εξέταση, ορολογικές αντιδράσεις και βιολογικά δείγματα.

Σημείωση. Η αυτοψία, η αφαίρεση του εγκεφάλου και άλλες εργασίες γίνονται υπό στείρες συνθήκες με αυστηρή τήρηση των ατομικών μέτρων πρόληψης (ισχυρή στερέωση του κεφαλιού του ζώου, προστασία των χεριών με δύο ζεύγη γαντιών: χειρουργικά και ανατομικά, τοποθετούνται γυαλιά προστατέψτε τα μάτια και η μύτη και το στόμα καλύπτονται με επίδεσμο γάζας).

Ι. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ

5. Για μικροσκοπική εξέταση γίνονται αποτυπώματα και επιχρίσματα από διάφορα μέρη του εγκεφάλου.

6. Για την προετοιμασία ενός αποτυπώματος, κομμάτια του εγκεφάλου (κέρατο του Άμμωνα, εγκεφαλικός φλοιός, παρεγκεφαλίδα, προμήκης μυελός) τοποθετούνται σε διηθητικό χαρτί διπλωμένο σε 4-6 στρώσεις. Η επιφάνεια κοπής αγγίζεται πολλές φορές (3 - 4) στη σειρά με μια καθαρή γυάλινη τσουλήθρα, πιέζοντας ελαφρά για να γίνει ένα λεπτό αποτύπωμα στο γυαλί.

7. Τα επιχρίσματα γίνονται από τις ίδιες περιοχές του εγκεφάλου. Για να γίνει αυτό, κομμάτια του εγκεφάλου αλέθονται σε ένα γουδί πορσελάνης με γουδοχέρι ή σε δοκιμαστικό σωλήνα με γυάλινη ράβδο μέχρι να σχηματιστεί μια ομοιογενής μάζα, από την οποία γίνονται τραχιά επιχρίσματα σε μια απολιπασμένη γυάλινη πλάκα.

Μπορείτε να κάνετε επιχρίσματα με άλλο τρόπο. Για να γίνει αυτό, ένα μικρό κομμάτι του εγκεφάλου τοποθετείται στην άκρη μιας γυάλινης διαφάνειας και συνθλίβεται με ένα άλλο ποτήρι και λερώνεται από τη μια άκρη στην άλλη, με αποτέλεσμα να λαμβάνεται ένα λεπτό ομοιόμορφο επίχρισμα στην επιφάνεια του ποτήρι.

8. Οι κηλίδες ή τα αποτυπώματα που προκύπτουν βάφονται με έναν από τους ακόλουθους τρόπους:

α) χρώση σύμφωνα με τον Muromtsev. Τα φτιαγμένα, ακόμα υγρά επιχρίσματα ή αποτυπώματα στερεώνονται αμέσως σε αιθυλική ή μεθυλική αλκοόλη ή σε μείγμα αλκοόλης στη μέση με αιθέρα ή ακετόνη (χημικά καθαρή) για 1-2 ώρες και στη συνέχεια πλένονται με νερό. Το δοχείο σταθεροποίησης πρέπει να είναι καλά σφραγισμένο για να αποφευχθεί η εξάτμιση του στερεωτικού υγρού. Μετά το πλύσιμο με νερό, τα υγρά επιχρίσματα τοποθετούνται για 5-10 λεπτά σε διάλυμα βαφής Munson, αραιωμένο με νερό 1:40. Στη συνέχεια το χρώμα στραγγίζεται και αμέσως τα επιχρίσματα βυθίζονται σε υδατικό διάλυμα τανίνης 10% για 8-10 λεπτά μέχρι να εμφανιστεί ένα γαλαζωπό χρώμα. Μετά από αυτό, τα επιχρίσματα πλένονται με νερό, στεγνώνουν με διηθητικό χαρτί, περνούν από μείγμα ίσων μερών αλκοόλης με ακετόνη (χημικά καθαρή) ή αλκοόλης με ξυλόλιο και στεγνώνουν ξανά με διηθητικό χαρτί. Το χρωματισμένο επίχρισμα πρέπει να έχει ανοιχτό μπλε φόντο, ενώ οι πυρήνες των νευρικών κυττάρων είναι χρωματισμένοι μπλε και τα σώματα Babesh-Negri είναι ανοιχτό μωβ με σκούρα εγκλείσματα.

β) Λεκές πωλητών. Στην προετοιμασμένη υγρή εκτύπωση ή επίχρισμα, εφαρμόστε για 4 δευτερόλεπτα ένα μείγμα αντιδραστηρίου "Α" (μπλε του μεθυλενίου - 2 g, μεθυλική αλκοόλη χωρίς ακετόνη - 100 ml) και αντιδραστήριο "Β" (βασική φουξίνη - 0,5 g, αιθυλική αλκοόλη χωρίς ίχνη ακετόνης - 100 ml). Το διάλυμα εργασίας της βαφής αποτελείται από 15 ml αντιδραστηρίου «Α», 2 - 4 ml αντιδραστηρίου «Β» και 25 ml μεθυλικής αλκοόλης. Μετά τη χρώση, το παρασκεύασμα πλένεται με τρεχούμενο νερό και στεγνώνει. Στο χρωματισμένο επίχρισμα, το κυτταρόπλασμα των νευρώνων είναι φωτεινό μπλε, οι πυρήνες είναι σκούρο μπλε, τα ερυθροκύτταρα είναι κόκκινο από τούβλα, τα σώματα του Babesh-Negri είναι μωβ-κόκκινα με μια σαφώς ορατή βασεόφιλη δομή των σωμάτων.

γ) χρώση κατά Mikhin. Οι κηλίδες ή τα αποτυπώματα στερεώνονται σε μείγμα αλκοόλης και αιθέρα (εξίσου) για 5-10 λεπτά, στη συνέχεια στεγνώνουν με διηθητικό χαρτί και βάφονται για 30-40 λεπτά με βαφή Giemsa (1-2 σταγόνες ανά 1 ml απεσταγμένου νερού ), πλύθηκε γρήγορα με οξινισμένη αλκοόλη (1 σταγόνα παγόμορφου οξικού οξέος ανά 30 ml αλκοόλης 96 °), και στη συνέχεια με νερό, στέγνωσε με διηθητικό χαρτί και υποβλήθηκε σε έρευνα. Εάν το υλικό ήταν σε γλυκερίνη, τότε προ-πλένεται καλά σε νερό και στεγνώνεται με διηθητικό χαρτί.

Σε ένα χρωματισμένο παρασκεύασμα, κάτω από μικροσκοπική εξέταση, το κύριο φόντο πρέπει να είναι κόκκινο με μωβ απόχρωση. Με την επικράτηση ενός μπλε τόνου, το επίχρισμα πλένεται ξανά με οξινισμένο οινόπνευμα και πλένεται με νερό. Τα πυραμιδικά νευρικά κύτταρα έχουν γαλαζωπό χρώμα με έντονο μαύρο πυρήνα και τα σώματα Babesh-Negri είναι ροζ-κόκκινα με διακεκομμένα εγκλείσματα σκούρου μπλε.

δ) χρώση κατά Bormann-Gainullina. Λεπτές κηλίδες ή εκτυπώσεις στερεώνονται για 5 λεπτά σε ένα μείγμα της ακόλουθης σύνθεσης: αλκοόλ και αιθέρας (εξίσου) - 98 ml, παγόμορφο οξικό οξύ - 2 ml. μετά τη στερέωση, βυθίζονται για 5 λεπτά σε διάλυμα κρυσταλλικής σόδας 10% και στη συνέχεια πλένονται με νερό και στεγνώνουν στον αέρα. Τα σταθεροποιημένα επιχρίσματα βάφονται για 2 λεπτά με το χρώμα που έχει παρασκευαστεί πριν από τη χρήση του (κεκορεσμένο υδατικό διάλυμα κυανού του μεθυλενίου - 3 σταγόνες, κορεσμένο βασικό διάλυμα φουξίνης - 2 σταγόνες, νερό βρύσης- 20 ml). Το διάλυμα βαφής χύνεται σε ένα επίχρισμα, στερεώνεται σε φλόγα καυστήρα, στη συνέχεια το χρώμα αφήνεται για άλλο ένα λεπτό, μετά το οποίο πλένεται με νερό και στεγνώνει με διηθητικό χαρτί. Σε ένα λεκιασμένο επίχρισμα, το κύριο φόντο πρέπει να είναι έντονο κόκκινο, το πρωτόπλασμα των νευρικών κυττάρων είναι χρωματισμένο κοκκινωπό-μπλε και οι πυρήνες τους είναι σκούρο μπλε, τα σώματα Babes-Negri είναι βαμμένα με κόκκινο χρώμα φράουλας με τυπική κοκκώδη δομή. Τα ερυθροκύτταρα μοιάζουν με μη λεκιασμένους κύκλους.

II. ΟΡΙΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ

9. Διάχυτη αντίδραση καθίζησης σε γέλη άγαρ. Η αντίδραση χρησιμοποιείται για την ανίχνευση ενός συγκεκριμένου αντιγόνου λύσσας στον μη συντηρημένο εγκέφαλο ζώων που πέθαναν από λύσσα του δρόμου, καθώς και σε ζώα στα οποία πραγματοποιήθηκε βιοδοκιμασία. Για την αντίδραση, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε έναν μπαγιάτικο (έως 1 μήνα) εγκέφαλο.

Η αντίδραση πραγματοποιείται σε αντικειμενοφόρους γυάλινες πλάκες, στις οποίες 2,5 ml λειωμένου και ψύχεται στους 60 ° C γέλη άγαρ, που παρασκευάζεται σύμφωνα με τη συνταγή: ξηρό άγαρ-άγαρ - 12 - 15 g. χημικά καθαρό χλωριούχο νάτριο - 8,6 g. Διάλυμα 1% (διηθημένο) μεθυλοπορτοκάλι σε αλκοόλη 50 ° - 5 - 10 ml. μερθειολικό - 0,01 g; αποσταγμένο νερό - 1 λίτρο.

Σημείωση. Για να ρυθμίσετε την αντίδραση, είναι καλύτερο να χρησιμοποιήσετε άγαρ-άγαρ Difko, διαλύεται πλήρως, δεν απαιτείται διήθηση του μέσου. Άλλες ποικιλίες άγαρ-άγαρ απαιτούν προσεκτική διήθηση.

Αφού στερεοποιηθεί το άγαρ, γίνονται τρύπες σε αυτό χρησιμοποιώντας ένα μεταλλικό ή γυάλινο σωλήνα λεπτού τοιχώματος με εσωτερική διάμετρο 4–5 mm, τοποθετώντας τα σύμφωνα με το στένσιλ (βλ. Εικ. -).

Για την αντίδραση σε μεγάλα ζώα, χρησιμοποιούνται κομμάτια του εγκεφάλου - το κέρας της αμμωνίας, ο φλοιός των ημισφαιρίων, η παρεγκεφαλίδα, ο προμήκης μυελός. σε αρουραίους, γοφάρια, ινδικά χοιρίδια, χάμστερ, κ.λπ. - οποιαδήποτε τρία μέρη του εγκεφάλου. τα ποντίκια έχουν ολόκληρο τον εγκέφαλο.

Σχέδιο ρύθμισης μικροκατακρήμνισης:
ΑΛΛΑ - φλοιός (αριστερό ημισφαίριο); ΣΤΟ- φλοιός (δεξί ημισφαίριο); ΑΠΟ- κέρατο αμμωνίου (αριστερά).
ρε- κέρατο αμμωνίου (δεξιά). μι- παρεγκεφαλίτιδα; ΚΑΙ- μυελός;
1 , 2 , 3 , 4 - αραιώσεις σφαιρίνης, αντίστοιχα 1:2, 1:4, 1:8, 1:16.

Θετική RP με όλες τις αραιώσεις σφαιρίνης
(εγκεφαλικός φλοιός προβάτου, λύσσα του δρόμου)

Θετική RP με αραιώσεις σφαιρίνης 1:4. 1:8, 1:16
(ammon κέρατο σκύλου, λύσσα του δρόμου)

Θετική RP με αραιώσεις σφαιρίνης 1:16,
δεν υπάρχουν γραμμές υετού με αραιώσεις 1:2, 1:4,
(προμήκης μυελός σκύλου, λύσσα του δρόμου)

Ο εγκέφαλος αλέθεται σε ένα γουδί πορσελάνης με ένα γουδοχέρι ή στο ίδιο το κρανίο σε μια «πάστα», η οποία είναι γεμάτη με πηγάδια για το αντιγόνο. Τα υπόλοιπα φρεάτια γεμίζονται με καταβυθιζόμενη αντιλυσσική σφαιρίνη σε αραίωση 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. Ο όγκος των συστατικών που χρησιμοποιήθηκαν είναι 0,02 ml.

Οι έλεγχοι με θετικά και αρνητικά αντιγόνα τοποθετούνται ταυτόχρονα σε ξεχωριστή αντικειμενοφόρο πλάκα χρησιμοποιώντας το ίδιο άγαρ χρησιμοποιώντας το ίδιο στένσιλ.

Αφού τα συστατικά της αντίδρασης τοποθετηθούν στα κατάλληλα φρεάτια, οι γυάλινες πλάκες μεταφέρονται σε έναν υγρό θάλαμο (τρυβλία Petri με υγρό διηθητικό χαρτί ή βαμβάκι) και τοποθετούνται σε θερμοστάτη για 6 ώρες σε θερμοκρασία 37-38 °C. Στη συνέχεια τα πιάτα αφήνονται σε θερμοκρασία δωματίου για άλλες 18 ώρες.

Η καταμέτρηση της αντίδρασης πραγματοποιείται 3, 6 και 24 ώρες μετά την πήξη της. Για να αποτραπεί η ξήρανση του άγαρ, οι αντικειμενοφόρες πλάκες τοποθετούνται στα ίδια τρυβλία Petri που περιέχουν βρεγμένο βαμβάκι μετά από κάθε προβολή.

Με μια θετική αντίδραση κατακρήμνισης άγαρ, μπορεί να σχηματιστούν μία, δύο και πολύ σπάνια τρεις παράλληλες γραμμές καθίζησης μεταξύ των φρεατίων με σφαιρίνη και αντιγόνο. Οι γραμμές βροχόπτωσης που προκύπτουν είναι οπτικά ορατές όταν τα γυαλιά φωτίζονται με ένα φωτιστικό από κάτω προς τα πάνω σε γωνία περίπου 45°.

Με αρνητικές ενδείξεις της αντίδρασης καθίζησης, τοποθετείται βιοδοκιμασία.

10. Αντίδραση ανοσοφθορισμού. Βασίζεται στην ανίχνευση με ειδικά μικροσκόπια (ML-1, ML-2, ML-3, κ.λπ.) ενός ιικού αντιγόνου που έχει αντιδράσει με έναν ειδικό ορό κατά της λύσσας σημασμένο με φθορίζουσα χρωστική ουσία.

Για την αντίδραση, γίνονται εκτυπώσεις λεπτών και ίσων στρωμάτων σε προσεκτικά απολιπανμένα ποτήρια από φρέσκο ​​ή φρέσκο ​​κατεψυγμένο εγκέφαλο. Τα αποτυπώματα παρασκευάζονται από κομμάτια του εγκεφάλου (κέρατο του Άμμωνα, εγκεφαλικός φλοιός, παρεγκεφαλίδα, προμήκης μυελός) με τον ίδιο τρόπο όπως για τη μικροσκοπική εξέταση. Τουλάχιστον 4 παρασκευάσματα παρασκευάζονται από κάθε κομμάτι εγκεφάλου. Για τον έλεγχο, τα φάρμακα παράγονται ομοίως από τον εγκέφαλο ενός υγιούς ζώου.

Μετά την ξήρανση στον αέρα, τα παρασκευάσματα στερεώνονται σε ακετόνη για 4 ώρες σε θερμοκρασία που δεν υπερβαίνει τους 4 °C. Το δοχείο σταθεροποίησης πρέπει να είναι καλά σφραγισμένο για να αποφευχθεί η εξάτμιση του στερεωτικού υγρού. Μετά τη στερέωση με ακετόνη, μερικές σταγόνες του συζυγούς (φθορισμού κατά της λύσσας γ-σφαιρίνη) εφαρμόζονται στα παρασκευάσματα σε αραίωση εργασίας. Στη συνέχεια τοποθετούνται σε υγρό θάλαμο (τρυβλίο Petri ή κλειστή εμαγιέ κυβέτα με βρεγμένο πάτο) για 20 - 30 λεπτά σε θερμοκρασία 25 °C.

Μετά από αυτό, τα παρασκευάσματα πλένονται με νερό ή ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (pH 7,2 - 7,4) για 1 ώρα, στη συνέχεια ξεπλένονται με απεσταγμένο νερό, ξηραίνονται στον αέρα και υποβάλλονται σε έρευνα. Τα παρασκευάσματα εξετάζονται υπό το σύστημα εμβάπτισης. Για εμβάπτιση χρησιμοποιείται λάδι που δεν φωτίζει.

Σε ένα χρωματισμένο παρασκεύασμα, σε μικροσκόπιο φθορισμού, ο εγκεφαλικός ιστός φθορίζει (λάμπει) με ένα θαμπό γκριζοκίτρινο χρώμα. Το αντιγόνο του ιού της λύσσας ανιχνεύεται σε παρασκευάσματα με τη μορφή λαμπερών κιτρινοπράσινων ή πράσινων κόκκων διαφόρων σχημάτων και μεγεθών - από ελάχιστα αισθητά έως 15-20 μικρά σε διάμετρο.

Στο παρασκεύασμα ελέγχου, δεν παρατηρούνται κιτρινοπράσινα έντονα φωτεινά κοκκία.

Στη μελέτη που χρησιμοποιεί τη μέθοδο των αντισωμάτων φθορισμού, η διάγνωση της λύσσας θεωρείται τεκμηριωμένη εάν βρεθεί επαρκής αριθμός (τουλάχιστον 10) τυπικών κόκκων με λαμπερή πρασινωπή λάμψη διαφόρων μεγεθών σε διάφορα οπτικά πεδία του μικροσκοπίου. Στον έλεγχο τέτοιων σχηματισμών δεν πρέπει να είναι.

Ελλείψει θετικού φθορισμού, τοποθετείται βιολογικό δείγμα.

III. ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΔΕΙΓΜΑ

11. Βιολογικό τεστ για λύσσα γίνεται εάν προκύψει αρνητικό αποτέλεσμα κατά τη μικροσκοπική εξέταση (δεν ανιχνεύονται σώματα Babes-Negri), με ορολογικές αντιδράσεις (δεν ανιχνεύεται ειδικό αντιγόνο λύσσας), καθώς και όταν ανιχνεύονται άτυπα εγκλείσματα. Η βιολογική δοκιμή πραγματοποιείται σε λευκά ποντίκια ή κουνέλια.

12. Τα πειραματικά ποντίκια ή κουνέλια μολύνονται με ένα εναιώρημα 10% από τον εγκέφαλο δοκιμής σε φυσιολογικό ορό ή ζωμό κρέατος-πεπτόνης με pH 7,2 - 7,4. Για την παρασκευή του εναιωρήματος χρησιμοποιούνται τα ίδια μέρη του εγκεφάλου, από τα οποία ελήφθη το υλικό για μικροσκοπικές και ορολογικές μελέτες.

Τα αποκομμένα μέρη του εγκεφάλου συλλέγονται σε έναν αποστειρωμένο δοκιμαστικό σωλήνα και ζυγίζονται, και στη συνέχεια αλέθονται επιμελώς σε ένα γουδί με γουδοχέρι, μετά από το οποίο προστίθεται φυσιολογικός ορός ή ζωμός κρέατος-πεπτόνης για να ληφθεί ένα εναιώρημα 10%. Το προκύπτον εναιώρημα αφήνεται να παραμείνει για 10 λεπτά και το υπερκείμενο χρησιμοποιείται για μόλυνση.

Εάν το παθολογικό υλικό ήταν μολυσμένο, τότε το υπερκείμενο χύνεται σε άλλο δοχείο (δοκιμαστικό σωλήνα) και προστίθενται σε αυτό 500-1000 IU πενικιλίνης και στρεπτομυκίνης ανά 1 ml υγρού, μετά το οποίο αφήνεται να παραμείνει για άλλα 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια χρησιμοποιείται για μόλυνση. Το εναιώρημα πρέπει να παρασκευάζεται υπό στείρες συνθήκες και με αυστηρή τήρηση των κανόνων προσωπικής πρόληψης.

Βιολογικό τεστ σε λευκά ποντίκια. Για μόλυνση, χρησιμοποιούνται λευκά ποντίκια βάρους 8-10 γρ. Για κάθε μελέτη λαμβάνονται 6 ποντίκια, εκ των οποίων τα 3 είναι μολυσμένα στον εγκέφαλο και 3 - υποδόρια. Όταν μολυνθεί στον εγκέφαλο, η βελόνα εισάγεται σε ένα σημείο πίσω από τη γραμμή που συνδέει τις πίσω γωνίες και ελαφρώς μακριά από τη γραμμή που τρέχει στη μέση του κεφαλιού. Το σημείο της μόλυνσης σκουπίζεται με αλκοόλ. Το εναιώρημα χορηγείται σε δόση 0,03 ml. Για να αποφευχθεί η βαθιά διείσδυση της βελόνας στον εγκέφαλο, τοποθετείται ένας περιοριστής στην άκρη της - ένα μικρό κομμάτι ελαστικού σωλήνα, το οποίο στερεώνεται σε απόσταση 2-3 mm από το άκρο της βελόνας. Σε περίπτωση υποδόριας λοίμωξης, το εναιώρημα εγχέεται στην περιοχή του άκρου της μύτης (σε άνω χείλος) σε δόση 0,05 ml. Ένα μικρό οίδημα σχηματίζεται στο σημείο της ένεσης. Τα μολυσμένα ποντίκια τοποθετούνται σε γυάλινα βάζα και παρατηρούνται για 30 ημέρες. Στο θετικό αποτέλεσμαβιολογικά δείγματα σε ποντίκια, συνήθως την 7η - 15η ημέρα μετά τη μόλυνση, αναπτύσσεται κλινική παραλυτικής λύσσας.

Αρχικά, παρατηρείται λήθαργος, ατημέλητο παλτό και ένα είδος καμπούρας, καθώς και διαταραχή του συντονισμού των κινήσεων. Στη συνέχεια έρχεται η παράλυση των πίσω άκρων, και αργότερα - το μπροστινό μέρος, μετατρέπεται σε γενική παράλυση, καταλήγοντας σε θάνατο. Η διάρκεια της νόσου είναι 2-3 ημέρες.

Με την ανάπτυξη γενικής παράλυσης, τα ποντίκια θυσιάζονται χρησιμοποιώντας αναισθησία με αιθέρα ή χλωροφόρμιο. Σε νεκρούς και νεκρούς ποντικούς, η κρανιακή κοιλότητα ανοίγει, ο εγκέφαλος ενοφθαλμίζεται σε θρεπτικά μέσα, μετά τον οποίο αφαιρείται ο εγκέφαλος, από τον οποίο παρασκευάζονται παρασκευάσματα για μικροσκοπικές και ανοσοβιολογικές μελέτες.

Με απουσία κλινικές ΕΚΔΗΛΩΣΕΙΣΗ λύσσα σε μολυσμένα ποντίκια καταστρέφεται εντός 30 ημερών. Τα βάζα στα οποία φυλάσσονταν απολυμαίνονται σχολαστικά.

Βιολογικό τεστ σε κουνέλια. Για τη δημιουργία ενός βιολογικού δείγματος λαμβάνονται 4 κουνέλια βάρους τουλάχιστον 1,5 kg το καθένα. 2 κουνέλια μολύνονται στον εγκέφαλο και 2 ενδομυϊκά στην περιοχή των μηρών. Το εναιώρημα χορηγείται ενδοεγκεφαλικά σε δόση 0,2 ml και ενδομυϊκά σε δόση 2 ml.

Με θετικό αποτέλεσμα του βιολογικού τεστ, τα κουνέλια αρρωσταίνουν μέσα σε 16 έως 21 ημέρες. Η νόσος της λύσσας εμφανίζεται σε κουνέλια σε σιωπηλή παραλυτική μορφή με μοιραίος. Στα νεκρά κουνέλια, ο εγκέφαλος αφαιρείται και περαιτέρω έρευνα διεξάγεται με τον ίδιο τρόπο όπως όταν μολύνονται ποντίκια. Τα κουνέλια παρατηρούνται για 45-50 ημέρες. Μετά την καθορισμένη περίοδο, τα κουνέλια καταστρέφονται. Τα κλουβιά στα οποία κρατούνταν τα πειραματόζωα απολυμαίνονται.

IV. ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ 1

1 Ως πρόσθετη μέθοδος χρησιμοποιείται η ιστολογική εξέταση

Για ιστολογική εξέταση λαμβάνονται κομμάτια από το κέρας του Άμμωνα, τον εγκεφαλικό φλοιό, την παρεγκεφαλίδα, τον προμήκη μυελό και στερεώνονται σε μία ή δύο δόσεις ακετόνης, ώστε η διάρκεια της στερέωσης να είναι εντός 6-18 ωρών.

Είναι καλύτερα να αφήσετε τη στερέωση σε ασετόν όλη τη νύχτα. Στη συνέχεια, το παθολογικό υλικό διέρχεται από δύο μερίδες ξυλολίου, κρατώντας για 30 λεπτά το καθένα, και μέσω δύο μερίδων παραφίνης - 1 ώρα το καθένα. Τα έτοιμα τμήματα αποπαραφινώνονται με τη συνήθη μέθοδο και βάφονται σύμφωνα με το Lenz ή το Turevich:

Χρωματισμός σύμφωνα με τη Lenz. Οι τομές χρωματίζονται με διάλυμα ηωσίνης για 1-3 λεπτά (0,5 g ηωσίνης διαλύονται σε 100 ml των 60 ° εθυλική αλκοόλη). Η ηωσίνη ξεπλένεται γρήγορα με νερό και χρωματίζεται με μπλε του μεθυλενίου Lefleur για 1 λεπτό, πλένεται με νερό, ξηραίνεται προσεκτικά με διηθητικό χαρτί και διαφοροποιείται με ένα διάλυμα μονάδων. νάτριο σε απόλυτη αλκοόλη (5 σταγόνες καυστικής σόδας ανά 30 ml αλκοόλης) σε ανοιχτό ροζ χρώμα. Ένα διάλυμα οξικού οξέος χύνεται πάνω στο παρασκεύασμα (1 σταγόνα παγόμορφου οξικού οξέος ανά 60 ml απόλυτης αλκοόλης) και διατηρείται μέχρι να εμφανιστεί ένα αχνό μπλε χρώμα, ξεπλένεται γρήγορα με αλκοόλη και διαυγάζεται με ξυλόλιο για 4-5 λεπτά. Τα σώματα του Babesh-Negri είναι χρωματισμένα με έντονο κόκκινο χρώμα με μπλε εγκλείσματα, το κυτταρόπλασμα των γαγγλιακών κυττάρων είναι ανοιχτό μπλε.

Χρωματισμός σύμφωνα με τον Turevich. Τα αποπαραφινωμένα τμήματα αμέσως μετά τη διέλευση από αλκοόλες και απεσταγμένο νερό χρωματίζονται με αιματοξυλίνη Weigert's ή Ehrlich, πλένονται με απεσταγμένο νερό. Στη συνέχεια χρωματίζεται με 1% υδατικό διάλυμα όξινου φούξιν για 1 λεπτό και πλένεται καλά με απεσταγμένο νερό μέχρι να εμφανιστεί μια απαλή ροζ απόχρωση. Μετά το πλύσιμο, υποβάλλεται σε επεξεργασία με μείγμα (σε ίσα μέρη) κορεσμένου υδατικού διαλύματος πικρικού οξέος (25-30 g πικρικού οξέος ανά 1 λίτρο ζεστού απεσταγμένου νερού) και αλκοόλης 96%. Κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας, παρατηρείται εκκένωση νεφών κόκκινου χρώματος και τα τμήματα αποκτούν κίτρινη απόχρωση μετά από 10-20 δευτερόλεπτα. Τα τμήματα ξεπλένονται γρήγορα σε νερό και στεγνώνονται ελαφρά με διηθητικό χαρτί. Στη συνέχεια, εξίσου γρήγορα, περνά από απόλυτο ή 96° αλκοόλ, καρβόλ-ξυλένιο, καθαρό ξυλόλιο και τοποθετείται σε βάλσαμο. Τα σώματα του Babesh-Negri είναι κόκκινο του κερασιού, οι πυρήνες των κυττάρων είναι μαύροι ή μπλε, ανάλογα με το ποια αιματοξυλίνη έχουν χρωματιστεί. Το σχήμα και το μέγεθος των σωμάτων του Babesh-Negri είναι πολύ διαφορετικά, βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα και τις διεργασίες των νευρικών κυττάρων με τη μορφή πολυάριθμων ή μεμονωμένων αντιγράφων. Πιο συχνά, τα σώματα Babes-Negri βρίσκονται σε μεγάλα γαγγλιακά κύτταρα και τα κύτταρα που τα περιέχουν δεν έχουν έντονα σημάδια εκφυλισμού.

Συχνά εντοπίζονται και άλλα εγκλείσματα, τα οποία, λόγω ορισμένων παρόμοιων χαρακτηριστικών, μερικές φορές μπερδεύονται με σώματα Negri. Θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι οι εγκέφαλοι υγιών γατών και λευκών ποντικών μερικές φορές περιέχουν μη ειδικά οξεόφιλα σωμάτια εγκλεισμού. Αυτά τα σώματα μπορούν να διαφοροποιηθούν από τα σώματα Negri λόγω της απουσίας εσωτερικών κόκκων και της ομοιογένειας της κύριας ουσίας.

Η λύσσα χαρακτηρίζεται επίσης από σημάδια οξείας εγκεφαλομυελίτιδας: κυρίως γύρω από μικρές φλέβες, εντοπίζονται περιαγγειακές διηθήσεις, που αποτελούνται κυρίως από λεμφοειδή κύτταρα που μοιάζουν με κυτταρικά μούφα.

Στα γαγγλιακά κύτταρα του εγκεφάλου, μπορεί να υπάρξει χρωματόλυση, κενοτοπίωση και οξεία διόγκωση των κυττάρων, καθώς και θάνατος μεμονωμένων κυττάρων. Στην περιοχή των κατεστραμμένων νευρικών κυττάρων, η πολλαπλασιαστική αντίδραση της γλοίας είναι αρκετά σταθερή, παίρνοντας τη μορφή πραγματικής νευροφαγίας, ακολουθούμενη από αντικατάσταση των νευρικών κυττάρων με στοιχεία πολλαπλασιασμένης γλοίας. Μια τέτοια συσσώρευση πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων στη θέση των αποσυντιθέμενων νευρικό κύτταροονομάζεται "οζίδιο λύσσας" - στην τομή, μερικές φορές είναι δυνατό να εντοπιστεί η ανάπτυξη του όζου (1).

ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΚΕΣ ΟΔΗΓΙΕΣ
ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΛΥΣΣΗΣ

1. Η διάγνωση της λύσσας γίνεται με βάση ένα σύμπλεγμα επιζωοτολογικών, κλινικών, παθοανατομικών δεδομένων και κυρίως με βάση εργαστηριακές εξετάσεις.

2. Για έρευνα, αποστέλλονται στο εργαστήριο με κούριερ: φρέσκο ​​πτώμα ή κεφάλι από σκύλο (γάτα, αλεπού, αρκτική αλεπού, πρόβατο, μοσχάρι κ.λπ.), από μεγάλα ζώα - κεφάλι ή εγκέφαλο (φρέσκο ​​ή κονσέρβα σε διάλυμα γλυκερίνης 30 - 50%). Μόνο οι μη συντηρημένοι εγκέφαλοι είναι κατάλληλοι για ορολογικές μελέτες.

3. Η εργαστηριακή διάγνωση της λύσσας συνίσταται σε μικροσκοπική εξέταση του εγκεφάλου (για την ανίχνευση σωμάτων Babes-Negri), ορολογική εξέταση (ανίχνευση συγκεκριμένου αντιγόνου λύσσας), καθώς και στη ρύθμιση βιολογικού τεστ σε λευκά ποντίκια ή κουνέλια .

Εντολή έρευνας.

4. Από τον εγκέφαλο που λήφθηκε για τη μελέτη, σπέρνονται πρώτα σε θρεπτικά μέσα. Μέρος του εγκεφάλου τοποθετείται αμέσως στο ψυγείο και αποθηκεύεται σε περίπτωση ανάγκης επανεξέτασης. Λαμβάνεται υλικό από τον υπόλοιπο εγκέφαλο για μικροσκοπική εξέταση, ορολογικές αντιδράσεις και βιολογικά δείγματα.

Σημείωση. Η αυτοψία, η αφαίρεση του εγκεφάλου και άλλες εργασίες γίνονται υπό στείρες συνθήκες με αυστηρή τήρηση των ατομικών μέτρων πρόληψης (ισχυρή στερέωση του κεφαλιού του ζώου, προστασία των χεριών με δύο ζεύγη γαντιών: χειρουργικά και ανατομικά, τοποθετούνται γυαλιά προστατέψτε τα μάτια και η μύτη και το στόμα καλύπτονται με επίδεσμο γάζας).

Ι. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ

5. Για μικροσκοπική εξέταση γίνονται αποτυπώματα και επιχρίσματα από διάφορα μέρη του εγκεφάλου.

6. Για την προετοιμασία ενός αποτυπώματος, κομμάτια του εγκεφάλου (κέρατο του Άμμωνα, εγκεφαλικός φλοιός, παρεγκεφαλίδα, προμήκης μυελός) τοποθετούνται σε διηθητικό χαρτί διπλωμένο σε 4-6 στρώσεις. Η επιφάνεια κοπής αγγίζεται πολλές φορές (3 - 4) στη σειρά με μια καθαρή γυάλινη τσουλήθρα, πιέζοντας ελαφρά για να γίνει ένα λεπτό αποτύπωμα στο γυαλί.

7. Τα επιχρίσματα γίνονται από τις ίδιες περιοχές του εγκεφάλου. Για να γίνει αυτό, κομμάτια του εγκεφάλου αλέθονται σε ένα γουδί πορσελάνης με γουδοχέρι ή σε δοκιμαστικό σωλήνα με γυάλινη ράβδο μέχρι να σχηματιστεί μια ομοιογενής μάζα, από την οποία γίνονται τραχιά επιχρίσματα σε μια απολιπασμένη γυάλινη πλάκα.

Μπορείτε να κάνετε επιχρίσματα με άλλο τρόπο. Για να γίνει αυτό, ένα μικρό κομμάτι του εγκεφάλου τοποθετείται στην άκρη μιας γυάλινης διαφάνειας και συνθλίβεται με ένα άλλο ποτήρι και λερώνεται από τη μια άκρη στην άλλη, με αποτέλεσμα να λαμβάνεται ένα λεπτό ομοιόμορφο επίχρισμα στην επιφάνεια του ποτήρι.

8. Οι κηλίδες ή τα αποτυπώματα που προκύπτουν βάφονται με έναν από τους ακόλουθους τρόπους:

α) χρώση σύμφωνα με τον Muromtsev. Τα φτιαγμένα, ακόμα υγρά επιχρίσματα ή αποτυπώματα στερεώνονται αμέσως σε αιθυλική ή μεθυλική αλκοόλη ή σε μείγμα αλκοόλης στη μέση με αιθέρα ή ακετόνη (χημικά καθαρή) για 1-2 ώρες και στη συνέχεια πλένονται με νερό. Το δοχείο σταθεροποίησης πρέπει να είναι καλά σφραγισμένο για να αποφευχθεί η εξάτμιση του στερεωτικού υγρού. Μετά το πλύσιμο με νερό, τα υγρά επιχρίσματα τοποθετούνται για 5-10 λεπτά σε διάλυμα βαφής Munson, αραιωμένο με νερό 1:40. Στη συνέχεια το χρώμα στραγγίζεται και αμέσως τα επιχρίσματα βυθίζονται σε υδατικό διάλυμα τανίνης 10% για 8-10 λεπτά μέχρι να εμφανιστεί ένα γαλαζωπό χρώμα. Μετά από αυτό, τα επιχρίσματα πλένονται με νερό, στεγνώνουν με διηθητικό χαρτί, περνούν από μείγμα ίσων μερών αλκοόλης με ακετόνη (χημικά καθαρή) ή αλκοόλης με ξυλόλιο και στεγνώνουν ξανά με διηθητικό χαρτί. Το χρωματισμένο επίχρισμα πρέπει να έχει ανοιχτό μπλε φόντο, ενώ οι πυρήνες των νευρικών κυττάρων είναι χρωματισμένοι μπλε και τα σώματα Babesh-Negri είναι ανοιχτό μωβ με σκούρα εγκλείσματα.

β) Λεκές πωλητών. Στην προετοιμασμένη υγρή εκτύπωση ή επίχρισμα, εφαρμόστε για 4 δευτερόλεπτα ένα μείγμα αντιδραστηρίου "Α" (μπλε του μεθυλενίου - 2 g, μεθυλική αλκοόλη χωρίς ακετόνη - 100 ml) και αντιδραστήριο "Β" (βασική φουξίνη - 0,5 g, αιθυλική αλκοόλη χωρίς ίχνη ακετόνης - 100 ml). Το διάλυμα εργασίας της βαφής αποτελείται από 15 ml αντιδραστηρίου «Α», 2 - 4 ml αντιδραστηρίου «Β» και 25 ml μεθυλικής αλκοόλης. Μετά τη χρώση, το παρασκεύασμα πλένεται με τρεχούμενο νερό και στεγνώνει. Στο χρωματισμένο επίχρισμα, το κυτταρόπλασμα των νευρώνων είναι φωτεινό μπλε, οι πυρήνες είναι σκούρο μπλε, τα ερυθροκύτταρα είναι κόκκινο από τούβλα, τα σώματα του Babesh-Negri είναι μωβ-κόκκινα με μια σαφώς ορατή βασεόφιλη δομή των σωμάτων.

γ) χρώση κατά Mikhin. Οι κηλίδες ή τα αποτυπώματα στερεώνονται σε μείγμα αλκοόλης και αιθέρα (εξίσου) για 5-10 λεπτά, στη συνέχεια στεγνώνουν με διηθητικό χαρτί και βάφονται για 30-40 λεπτά με βαφή Giemsa (1-2 σταγόνες ανά 1 ml απεσταγμένου νερού ), πλύθηκε γρήγορα με οξινισμένη αλκοόλη (1 σταγόνα παγόμορφου οξικού οξέος ανά 30 ml αλκοόλης 96 °), και στη συνέχεια με νερό, στέγνωσε με διηθητικό χαρτί και υποβλήθηκε σε έρευνα. Εάν το υλικό ήταν σε γλυκερίνη, τότε προ-πλένεται καλά σε νερό και στεγνώνεται με διηθητικό χαρτί.

Σε ένα χρωματισμένο παρασκεύασμα, κάτω από μικροσκοπική εξέταση, το κύριο φόντο πρέπει να είναι κόκκινο με μωβ απόχρωση. Με την επικράτηση ενός μπλε τόνου, το επίχρισμα πλένεται ξανά με οξινισμένο οινόπνευμα και πλένεται με νερό. Τα πυραμιδικά νευρικά κύτταρα έχουν γαλαζωπό χρώμα με έντονο μαύρο πυρήνα και τα σώματα Babesh-Negri είναι ροζ-κόκκινα με διακεκομμένα εγκλείσματα σκούρου μπλε.

δ) χρώση κατά Bormann-Gainullina. Λεπτές κηλίδες ή εκτυπώσεις στερεώνονται για 5 λεπτά σε ένα μείγμα της ακόλουθης σύνθεσης: αλκοόλ και αιθέρας (εξίσου) - 98 ml, παγόμορφο οξικό οξύ - 2 ml. μετά τη στερέωση, βυθίζονται για 5 λεπτά σε διάλυμα κρυσταλλικής σόδας 10% και στη συνέχεια πλένονται με νερό και στεγνώνουν στον αέρα. Τα σταθεροποιημένα επιχρίσματα βάφονται για 2 λεπτά με το χρώμα που παρασκευάστηκε πριν από τη χρήση του (κεκορεσμένο υδατικό διάλυμα κυανού του μεθυλενίου - 3 σταγόνες, κορεσμένο βασικό διάλυμα φουξίνης - 2 σταγόνες, νερό βρύσης - 20 ml). Το διάλυμα βαφής χύνεται σε ένα επίχρισμα, στερεώνεται σε φλόγα καυστήρα, στη συνέχεια το χρώμα αφήνεται για άλλο ένα λεπτό, μετά το οποίο πλένεται με νερό και στεγνώνει με διηθητικό χαρτί. Σε ένα λεκιασμένο επίχρισμα, το κύριο φόντο πρέπει να είναι έντονο κόκκινο, το πρωτόπλασμα των νευρικών κυττάρων είναι χρωματισμένο κοκκινωπό-μπλε και οι πυρήνες τους είναι σκούρο μπλε, τα σώματα Babes-Negri είναι βαμμένα με κόκκινο χρώμα φράουλας με τυπική κοκκώδη δομή. Τα ερυθροκύτταρα μοιάζουν με μη λεκιασμένους κύκλους.

II. ΟΡΙΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ

9. Διάχυτη αντίδραση καθίζησης σε γέλη άγαρ. Η αντίδραση χρησιμοποιείται για την ανίχνευση ενός συγκεκριμένου αντιγόνου λύσσας στον μη συντηρημένο εγκέφαλο ζώων που πέθαναν από λύσσα του δρόμου, καθώς και σε ζώα στα οποία πραγματοποιήθηκε βιοδοκιμασία. Για την αντίδραση, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε έναν μπαγιάτικο (έως 1 μήνα) εγκέφαλο.

Η αντίδραση πραγματοποιείται σε αντικειμενοφόρους γυάλινες πλάκες, στις οποίες 2,5 ml λειωμένου και ψύχεται στους 60 ° C γέλη άγαρ, που παρασκευάζεται σύμφωνα με τη συνταγή: ξηρό άγαρ-άγαρ - 12 - 15 g. χημικά καθαρό χλωριούχο νάτριο - 8,6 g. Διάλυμα 1% (διηθημένο) μεθυλοπορτοκάλι σε αλκοόλη 50 ° - 5 - 10 ml. μερθειολικό - 0,01 g; αποσταγμένο νερό - 1 λίτρο.

Σημείωση. Για να ρυθμίσετε την αντίδραση, είναι καλύτερο να χρησιμοποιήσετε άγαρ-άγαρ Difko, διαλύεται πλήρως, δεν απαιτείται διήθηση του μέσου. Άλλες ποικιλίες άγαρ-άγαρ απαιτούν προσεκτική διήθηση.

Αφού στερεοποιηθεί το άγαρ, γίνονται τρύπες σε αυτό χρησιμοποιώντας ένα μεταλλικό ή γυάλινο σωλήνα λεπτού τοιχώματος με εσωτερική διάμετρο 4–5 mm, τοποθετώντας τα σύμφωνα με το στένσιλ (βλ. Εικ. -).

Για την αντίδραση σε μεγάλα ζώα, χρησιμοποιούνται κομμάτια του εγκεφάλου - το κέρας της αμμωνίας, ο φλοιός των ημισφαιρίων, η παρεγκεφαλίδα, ο προμήκης μυελός. σε αρουραίους, γοφάρια, ινδικά χοιρίδια, χάμστερ κ.λπ. - οποιαδήποτε τρία μέρη του εγκεφάλου. τα ποντίκια έχουν ολόκληρο τον εγκέφαλο.

Σχέδιο ρύθμισης μικροκατακρήμνισης:
ΑΛΛΑ - φλοιός (αριστερό ημισφαίριο); ΣΤΟ- φλοιός ( δεξί ημισφαίριο); ΑΠΟ- κέρατο αμμωνίου (αριστερά).
ρε- κέρατο αμμωνίου (δεξιά). μι- παρεγκεφαλίτιδα; ΚΑΙ- μυελός;
1 , 2 , 3 , 4 - αραιώσεις σφαιρίνης, αντίστοιχα 1:2, 1:4, 1:8, 1:16.

Θετική RP με όλες τις αραιώσεις σφαιρίνης
(εγκεφαλικός φλοιός προβάτου, λύσσα του δρόμου)

Θετική RP με αραιώσεις σφαιρίνης 1:4. 1:8, 1:16
(ammon κέρατο σκύλου, λύσσα του δρόμου)

Θετική RP με αραιώσεις σφαιρίνης 1:16,
δεν υπάρχουν γραμμές υετού με αραιώσεις 1:2, 1:4,
(προμήκης μυελός σκύλου, λύσσα του δρόμου)

Ο εγκέφαλος αλέθεται σε ένα γουδί πορσελάνης με ένα γουδοχέρι ή στο ίδιο το κρανίο σε μια «πάστα», η οποία είναι γεμάτη με πηγάδια για το αντιγόνο. Τα υπόλοιπα φρεάτια γεμίζονται με καταβυθιζόμενη αντιλυσσική σφαιρίνη σε αραίωση 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. Ο όγκος των συστατικών που χρησιμοποιήθηκαν είναι 0,02 ml.

Οι έλεγχοι με θετικά και αρνητικά αντιγόνα τοποθετούνται ταυτόχρονα σε ξεχωριστή αντικειμενοφόρο πλάκα χρησιμοποιώντας το ίδιο άγαρ χρησιμοποιώντας το ίδιο στένσιλ.

Αφού τα συστατικά της αντίδρασης τοποθετηθούν στα κατάλληλα φρεάτια, οι γυάλινες πλάκες μεταφέρονται σε έναν υγρό θάλαμο (τρυβλία Petri με υγρό διηθητικό χαρτί ή βαμβάκι) και τοποθετούνται σε θερμοστάτη για 6 ώρες σε θερμοκρασία 37-38 °C. Στη συνέχεια τα πιάτα αφήνονται σε θερμοκρασία δωματίου για άλλες 18 ώρες.

Η καταμέτρηση της αντίδρασης πραγματοποιείται 3, 6 και 24 ώρες μετά την πήξη της. Για να αποτραπεί η ξήρανση του άγαρ, οι αντικειμενοφόρες πλάκες τοποθετούνται στα ίδια τρυβλία Petri που περιέχουν βρεγμένο βαμβάκι μετά από κάθε προβολή.

Με μια θετική αντίδραση κατακρήμνισης άγαρ, μπορεί να σχηματιστούν μία, δύο και πολύ σπάνια τρεις παράλληλες γραμμές καθίζησης μεταξύ των φρεατίων με σφαιρίνη και αντιγόνο. Οι γραμμές βροχόπτωσης που προκύπτουν είναι οπτικά ορατές όταν τα γυαλιά φωτίζονται με ένα φωτιστικό από κάτω προς τα πάνω σε γωνία περίπου 45°.

Με αρνητικές ενδείξεις της αντίδρασης καθίζησης, τοποθετείται βιοδοκιμασία.

10. Αντίδραση ανοσοφθορισμού. Βασίζεται στην ανίχνευση με ειδικά μικροσκόπια (ML-1, ML-2, ML-3, κ.λπ.) ενός ιικού αντιγόνου που έχει αντιδράσει με έναν ειδικό ορό κατά της λύσσας σημασμένο με φθορίζουσα χρωστική ουσία.

Για την αντίδραση, γίνονται εκτυπώσεις λεπτών και ίσων στρωμάτων σε προσεκτικά απολιπανμένα ποτήρια από φρέσκο ​​ή φρέσκο ​​κατεψυγμένο εγκέφαλο. Τα αποτυπώματα παρασκευάζονται από κομμάτια του εγκεφάλου (κέρατο του Άμμωνα, εγκεφαλικός φλοιός, παρεγκεφαλίδα, προμήκης μυελός) με τον ίδιο τρόπο όπως για τη μικροσκοπική εξέταση. Τουλάχιστον 4 παρασκευάσματα παρασκευάζονται από κάθε κομμάτι εγκεφάλου. Για τον έλεγχο, τα φάρμακα παράγονται ομοίως από τον εγκέφαλο ενός υγιούς ζώου.

Μετά την ξήρανση στον αέρα, τα παρασκευάσματα στερεώνονται σε ακετόνη για 4 ώρες σε θερμοκρασία που δεν υπερβαίνει τους 4 °C. Το δοχείο σταθεροποίησης πρέπει να είναι καλά σφραγισμένο για να αποφευχθεί η εξάτμιση του στερεωτικού υγρού. Μετά τη στερέωση με ακετόνη, μερικές σταγόνες του συζυγούς (φθορισμού κατά της λύσσας γ-σφαιρίνη) εφαρμόζονται στα παρασκευάσματα σε αραίωση εργασίας. Στη συνέχεια τοποθετούνται σε υγρό θάλαμο (τρυβλίο Petri ή κλειστή εμαγιέ κυβέτα με βρεγμένο πάτο) για 20 - 30 λεπτά σε θερμοκρασία 25 °C.

Μετά από αυτό, τα παρασκευάσματα πλένονται με νερό ή ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (pH 7,2 - 7,4) για 1 ώρα, στη συνέχεια ξεπλένονται με απεσταγμένο νερό, ξηραίνονται στον αέρα και υποβάλλονται σε έρευνα. Τα παρασκευάσματα εξετάζονται υπό το σύστημα εμβάπτισης. Για εμβάπτιση χρησιμοποιείται λάδι που δεν φωτίζει.

Σε ένα χρωματισμένο παρασκεύασμα, σε μικροσκόπιο φθορισμού, ο εγκεφαλικός ιστός φθορίζει (λάμπει) με ένα θαμπό γκριζοκίτρινο χρώμα. Το αντιγόνο του ιού της λύσσας ανιχνεύεται σε παρασκευάσματα με τη μορφή λαμπερών κιτρινοπράσινων ή πράσινων κόκκων διαφόρων σχημάτων και μεγεθών - από ελάχιστα αισθητά έως 15-20 μικρά σε διάμετρο.

Στο παρασκεύασμα ελέγχου, δεν παρατηρούνται κιτρινοπράσινα έντονα φωτεινά κοκκία.

Στη μελέτη που χρησιμοποιεί τη μέθοδο των αντισωμάτων φθορισμού, η διάγνωση της λύσσας θεωρείται τεκμηριωμένη εάν βρεθεί επαρκής αριθμός (τουλάχιστον 10) τυπικών κόκκων με λαμπερή πρασινωπή λάμψη διαφόρων μεγεθών σε διάφορα οπτικά πεδία του μικροσκοπίου. Στον έλεγχο τέτοιων σχηματισμών δεν πρέπει να είναι.

Ελλείψει θετικού φθορισμού, τοποθετείται βιολογικό δείγμα.

III. ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΔΕΙΓΜΑ

11. Βιολογικό τεστ για λύσσα γίνεται εάν προκύψει αρνητικό αποτέλεσμα κατά τη μικροσκοπική εξέταση (δεν ανιχνεύονται σώματα Babes-Negri), με ορολογικές αντιδράσεις (δεν ανιχνεύεται ειδικό αντιγόνο λύσσας), καθώς και όταν ανιχνεύονται άτυπα εγκλείσματα. Η βιολογική δοκιμή πραγματοποιείται σε λευκά ποντίκια ή κουνέλια.

12. Τα πειραματικά ποντίκια ή κουνέλια μολύνονται με ένα εναιώρημα 10% από τον εγκέφαλο δοκιμής σε φυσιολογικό ορό ή ζωμό κρέατος-πεπτόνης με pH 7,2 - 7,4. Για την παρασκευή του εναιωρήματος χρησιμοποιούνται τα ίδια μέρη του εγκεφάλου, από τα οποία ελήφθη το υλικό για μικροσκοπικές και ορολογικές μελέτες.

Τα αποκομμένα μέρη του εγκεφάλου συλλέγονται σε έναν αποστειρωμένο δοκιμαστικό σωλήνα και ζυγίζονται, και στη συνέχεια αλέθονται επιμελώς σε ένα γουδί με γουδοχέρι, μετά από το οποίο προστίθεται φυσιολογικός ορός ή ζωμός κρέατος-πεπτόνης για να ληφθεί ένα εναιώρημα 10%. Το προκύπτον εναιώρημα αφήνεται να παραμείνει για 10 λεπτά και το υπερκείμενο χρησιμοποιείται για μόλυνση.

Εάν το παθολογικό υλικό ήταν μολυσμένο, τότε το υπερκείμενο χύνεται σε άλλο δοχείο (δοκιμαστικό σωλήνα) και προστίθενται σε αυτό 500-1000 IU πενικιλίνης και στρεπτομυκίνης ανά 1 ml υγρού, μετά το οποίο αφήνεται να παραμείνει για άλλα 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια χρησιμοποιείται για μόλυνση. Το εναιώρημα πρέπει να παρασκευάζεται υπό στείρες συνθήκες και με αυστηρή τήρηση των κανόνων προσωπικής πρόληψης.

Βιολογικό τεστ σε λευκά ποντίκια. Για μόλυνση, χρησιμοποιούνται λευκά ποντίκια βάρους 8-10 γρ. Για κάθε μελέτη λαμβάνονται 6 ποντίκια, εκ των οποίων τα 3 είναι μολυσμένα στον εγκέφαλο και 3 - υποδόρια. Όταν μολυνθεί στον εγκέφαλο, η βελόνα εισάγεται σε ένα σημείο πίσω από τη γραμμή που συνδέει τις πίσω γωνίες και ελαφρώς μακριά από τη γραμμή που τρέχει στη μέση του κεφαλιού. Το σημείο της μόλυνσης σκουπίζεται με αλκοόλ. Το εναιώρημα χορηγείται σε δόση 0,03 ml. Για να αποφευχθεί η βαθιά διείσδυση της βελόνας στον εγκέφαλο, τοποθετείται ένας περιοριστής στην άκρη της - ένα μικρό κομμάτι ελαστικού σωλήνα, το οποίο στερεώνεται σε απόσταση 2-3 mm από το άκρο της βελόνας. Στο υποδόρια λοίμωξητο εναιώρημα εγχέεται στην περιοχή της άκρης της μύτης (άνω χείλος) σε δόση 0,05 ml. Ένα μικρό οίδημα σχηματίζεται στο σημείο της ένεσης. Τα μολυσμένα ποντίκια τοποθετούνται σε γυάλινα βάζα και παρατηρούνται για 30 ημέρες. Με θετικό αποτέλεσμα βιολογικού τεστ σε ποντίκια, συνήθως την 7η - 15η ημέρα μετά τη μόλυνση, αναπτύσσεται κλινική παραλυτικής λύσσας.

Αρχικά, παρατηρείται λήθαργος, ατημέλητο παλτό και ένα είδος καμπούρας, καθώς και διαταραχή του συντονισμού των κινήσεων. Στη συνέχεια έρχεται η παράλυση των πίσω άκρων, και αργότερα - το μπροστινό μέρος, μετατρέπεται σε γενική παράλυση, καταλήγοντας σε θάνατο. Η διάρκεια της νόσου είναι 2-3 ημέρες.

Με την ανάπτυξη γενικής παράλυσης, τα ποντίκια θυσιάζονται χρησιμοποιώντας αναισθησία με αιθέρα ή χλωροφόρμιο. Σε νεκρούς και νεκρούς ποντικούς, η κρανιακή κοιλότητα ανοίγει, ο εγκέφαλος ενοφθαλμίζεται σε θρεπτικά μέσα, μετά τον οποίο αφαιρείται ο εγκέφαλος, από τον οποίο παρασκευάζονται παρασκευάσματα για μικροσκοπικές και ανοσοβιολογικές μελέτες.

Ελλείψει κλινικών εκδηλώσεων της λύσσας σε μολυσμένα ποντίκια, καταστρέφονται εντός 30 ημερών. Τα βάζα στα οποία φυλάσσονταν απολυμαίνονται σχολαστικά.

Βιολογικό τεστ σε κουνέλια. Για τη δημιουργία ενός βιολογικού δείγματος λαμβάνονται 4 κουνέλια βάρους τουλάχιστον 1,5 kg το καθένα. 2 κουνέλια μολύνονται στον εγκέφαλο και 2 ενδομυϊκά στην περιοχή των μηρών. Το εναιώρημα χορηγείται ενδοεγκεφαλικά σε δόση 0,2 ml και ενδομυϊκά σε δόση 2 ml.

Με θετικό αποτέλεσμα του βιολογικού τεστ, τα κουνέλια αρρωσταίνουν μέσα σε 16 έως 21 ημέρες. Η νόσος της λύσσας εμφανίζεται σε κουνέλια σε σιωπηλή παραλυτική μορφή με θανατηφόρο κατάληξη. Στα νεκρά κουνέλια, ο εγκέφαλος αφαιρείται και περαιτέρω έρευνα διεξάγεται με τον ίδιο τρόπο όπως όταν μολύνονται ποντίκια. Τα κουνέλια παρατηρούνται για 45-50 ημέρες. Μετά την καθορισμένη περίοδο, τα κουνέλια καταστρέφονται. Τα κλουβιά στα οποία κρατούνταν τα πειραματόζωα απολυμαίνονται.

IV. ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ 1

1 Ως πρόσθετη μέθοδος χρησιμοποιείται η ιστολογική εξέταση

Για ιστολογική εξέταση λαμβάνονται κομμάτια από το κέρας του Άμμωνα, τον εγκεφαλικό φλοιό, την παρεγκεφαλίδα, τον προμήκη μυελό και στερεώνονται σε μία ή δύο δόσεις ακετόνης, ώστε η διάρκεια της στερέωσης να είναι εντός 6-18 ωρών.

Είναι καλύτερα να αφήσετε τη στερέωση σε ασετόν όλη τη νύχτα. Στη συνέχεια, το παθολογικό υλικό διέρχεται από δύο μερίδες ξυλολίου, κρατώντας για 30 λεπτά το καθένα, και μέσω δύο μερίδων παραφίνης - 1 ώρα το καθένα. Τα έτοιμα τμήματα αποπαραφινώνονται με τη συνήθη μέθοδο και βάφονται σύμφωνα με το Lenz ή το Turevich:

Χρωματισμός σύμφωνα με τη Lenz. Οι τομές χρωματίζονται με διάλυμα ηωσίνης για 1-3 λεπτά (0,5 g ηωσίνης διαλύονται σε 100 ml αιθυλικής αλκοόλης 60%). Η ηωσίνη ξεπλένεται γρήγορα με νερό και χρωματίζεται με μπλε του μεθυλενίου Lefleur για 1 λεπτό, πλένεται με νερό, ξηραίνεται προσεκτικά με διηθητικό χαρτί και διαφοροποιείται με ένα διάλυμα μονάδων. νάτριο σε απόλυτη αλκοόλη (5 σταγόνες καυστικής σόδας ανά 30 ml αλκοόλης) σε ανοιχτό ροζ χρώμα. Ένα διάλυμα οξικού οξέος χύνεται πάνω στο παρασκεύασμα (1 σταγόνα παγόμορφου οξικού οξέος ανά 60 ml απόλυτης αλκοόλης) και διατηρείται μέχρι να εμφανιστεί ένα αχνό μπλε χρώμα, ξεπλένεται γρήγορα με αλκοόλη και διαυγάζεται με ξυλόλιο για 4-5 λεπτά. Τα σώματα του Babesh-Negri είναι χρωματισμένα με έντονο κόκκινο χρώμα με μπλε εγκλείσματα, το κυτταρόπλασμα των γαγγλιακών κυττάρων είναι ανοιχτό μπλε.

Χρωματισμός σύμφωνα με τον Turevich. Τα αποπαραφινωμένα τμήματα αμέσως μετά τη διέλευση από αλκοόλες και απεσταγμένο νερό χρωματίζονται με αιματοξυλίνη Weigert's ή Ehrlich, πλένονται με απεσταγμένο νερό. Στη συνέχεια χρωματίζεται με 1% υδατικό διάλυμα όξινου φούξιν για 1 λεπτό και πλένεται καλά με απεσταγμένο νερό μέχρι να εμφανιστεί μια απαλή ροζ απόχρωση. Μετά το πλύσιμο, υποβάλλεται σε επεξεργασία με μείγμα (σε ίσα μέρη) κορεσμένου υδατικού διαλύματος πικρικού οξέος (25-30 g πικρικού οξέος ανά 1 λίτρο ζεστού απεσταγμένου νερού) και αλκοόλης 96%. Κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας, παρατηρείται εκκένωση νεφών κόκκινου χρώματος και τα τμήματα αποκτούν κίτρινη απόχρωση μετά από 10-20 δευτερόλεπτα. Τα τμήματα ξεπλένονται γρήγορα σε νερό και στεγνώνονται ελαφρά με διηθητικό χαρτί. Στη συνέχεια, εξίσου γρήγορα, περνά από απόλυτο ή 96° αλκοόλ, καρβόλ-ξυλένιο, καθαρό ξυλόλιο και τοποθετείται σε βάλσαμο. Τα σώματα του Babesh-Negri είναι κόκκινο του κερασιού, οι πυρήνες των κυττάρων είναι μαύροι ή μπλε, ανάλογα με το ποια αιματοξυλίνη έχουν χρωματιστεί. Το σχήμα και το μέγεθος των σωμάτων του Babesh-Negri είναι πολύ διαφορετικά, βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα και τις διεργασίες των νευρικών κυττάρων με τη μορφή πολυάριθμων ή μεμονωμένων αντιγράφων. Πιο συχνά, τα σώματα Babes-Negri βρίσκονται σε μεγάλα γαγγλιακά κύτταρα και τα κύτταρα που τα περιέχουν δεν έχουν έντονα σημάδια εκφυλισμού.

Συχνά εντοπίζονται και άλλα εγκλείσματα, τα οποία, λόγω ορισμένων παρόμοιων χαρακτηριστικών, μερικές φορές μπερδεύονται με σώματα Negri. Θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι οι εγκέφαλοι υγιών γατών και λευκών ποντικών μερικές φορές περιέχουν μη ειδικά οξεόφιλα σωμάτια εγκλεισμού. Αυτά τα σώματα μπορούν να διαφοροποιηθούν από τα σώματα Negri λόγω της απουσίας εσωτερικών κόκκων και της ομοιογένειας της κύριας ουσίας.

Η λύσσα χαρακτηρίζεται επίσης από σημάδια οξείας εγκεφαλομυελίτιδας: κυρίως γύρω από μικρές φλέβες, εντοπίζονται περιαγγειακές διηθήσεις, που αποτελούνται κυρίως από λεμφοειδή κύτταρα που μοιάζουν με κυτταρικά μούφα.

Στα γαγγλιακά κύτταρα του εγκεφάλου, μπορεί να υπάρξει χρωματόλυση, κενοτοπίωση και οξεία διόγκωση των κυττάρων, καθώς και θάνατος μεμονωμένων κυττάρων. Στην περιοχή των κατεστραμμένων νευρικών κυττάρων, η πολλαπλασιαστική αντίδραση της γλοίας είναι αρκετά σταθερή, παίρνοντας τη μορφή πραγματικής νευροφαγίας, ακολουθούμενη από αντικατάσταση των νευρικών κυττάρων με στοιχεία πολλαπλασιασμένης γλοίας. Μια τέτοια συσσώρευση πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων στη θέση ενός αποσαθρωμένου νευρικού κυττάρου ονομάζεται «όζος λύσσας» - μερικές φορές η διαδικασία ανάπτυξης όζων μπορεί να εντοπιστεί σε ένα τμήμα (1).