Reversión de nanobacterias a sus formas originales. Formas L de bacterias. Diversidad de sistemas que regulan la formación de biopelículas.

Introducción

Durante muchos siglos, los científicos han estado estudiando las poblaciones microbianas y los mecanismos de su formación, y solo a fines del siglo pasado encontraron una forma especial de organización de cultivos bacterianos: una comunidad de microorganismos capaces de colonizar objetos. ambiente y existen no sólo en forma de microplancton, sino también en forma de biopelículas organizadas específicamente. Las biopelículas son comunidades heterogéneas móviles y en constante cambio (Chebotar, 2012), que pueden estar formadas por bacterias de una o más especies y constan tanto de células que funcionan activamente como de células latentes o no cultivadas. La formación de comunidades tan altamente especializadas es una de las principales estrategias para la supervivencia de cultivos bacterianos no sólo en el medio ambiente, sino también en el cuerpo humano. En general, las biopelículas son un grupo de células microbianas rodeadas por una capa mucosa espesa y de alto peso molecular.

Mecanismo de formación de biopelículas.

Por lo general, los microorganismos existen en forma de masas que flotan libremente o colonias individuales, pero algunos representantes del reino bacteriano tienden a adherirse a una superficie de sustrato específica y forman una biopelícula, cuyo mecanismo de formación es complejo, estrictamente regulado e incluye cuatro etapas sucesivas.

Etapa 1: fijación reversible (primaria) a la superficie. La primera etapa de la formación de biopelículas se caracteriza por una adhesión reversible asociada a la acción de fuerzas fisicoquímicas inespecíficas entre moléculas y estructuras en la superficie de los microorganismos (elementos de la pared celular, flagelos, pelos) y el sustrato sólido debido a diversas interacciones: van der Wals, hidrófobo, iónico, electrostático;

Etapa 2: fijación irreversible a la superficie. Después de la adsorción, la célula bacteriana se mueve a lo largo de la superficie del sustrato, uniéndose firmemente a él mediante factores de adhesión, así como con la ayuda de adhesinas no poliméricas, que distinguen los elementos estructurales de las superficies del tejido huésped: colágeno, elastina, glicoproteínas. , ácido hialurónico. En la misma etapa, además de una fuerte unión al sustrato, ocurre lo siguiente: pérdida de la motilidad bacteriana, interacciones intercelulares, intercambio de genes entre microorganismos del mismo y diferentes tipos.

Etapa 3: maduración - maduración 1 . Después de adherirse firmemente al sustrato e intercambiar genes, las bacterias adheridas comienzan a sintetizar una matriz circundante de exopolisacárido conocida como sustancia polimérica extracelular. extracelular polimerico sustancia), que es un “moco” protector y constituye el 85% de toda la biopelícula madura (Chebotar, 2012; Frolova, 2015). Esta matriz promueve la formación de una biopelícula inicial de pequeñas colonias bacterianas. Los componentes de un exopolisacárido varían dependiendo de qué microorganismos formen parte de él.

Etapa 4: crecimiento - maduración 2 . En esta etapa se forma una biopelícula madura, tras lo cual llega el momento de los colonizadores secundarios, es decir, células que se adhieren a bacterias ya localizadas en la superficie (Afinogenova, 2011).

Las biopelículas maduras son capaces de perder fragmentos únicos que, al extenderse por todo el macroorganismo, se adhieren a los sustratos y forman nuevas biopelículas. Además, en las biopelículas maduras, las bacterias no se dividen, ya que están rodeadas por una matriz densa y conservan una alta viabilidad.

La formación de biopelículas ocurre con bastante rapidez. La unión de las bacterias entre sí ocurre en unos pocos minutos, se forman colonias estrechamente unidas en 2 a 4 horas y la producción de una sustancia polimérica extracelular ocurre en 6 a 12 horas, después de lo cual las bacterias que forman la biopelícula se vuelven en gran medida tolerantes a antibióticos y desinfectantes, antisépticos. Además, las biopelículas se recuperan rápidamente después del impacto mecánico (Chebotar, 2012).

Ultraestructura de biopelículas.

La ultraestructura de las biopelículas se determinó mediante microscopía láser de barrido confocal. La matriz extracelular de las células microbianas tiene una estructura específica y está formada por estructuras tridimensionales en forma de hongo o de columnas. El exopolisacárido liberado en la etapa de maduración de la biopelícula está representado por un heteropolisacárido bicapa, universal para cada tipo de microorganismo. Su capa externa contiene polisacáridos en estado hidratado (dextrano, ácido hialurónico, celulosa) y la capa interna está llena de vesículas de membrana que pueden actuar como factores de patogenicidad (dichas vesículas contienen fosfatasa alcalina C, proteasas, lisozima). Las sustancias vesiculares también realizan la función de lisis de debilitados. células bacterianas, cuyos fragmentos se convierten posteriormente en factor de crecimiento y fuente de nutrición para los miembros restantes de la biopelícula.

Todos los componentes de la matriz están separados por canales a través de los cuales se realiza el transporte de nutrientes y oxígeno, así como la liberación de los productos metabólicos finales de las células bacterianas. Las estructuras superficiales, los ramnolípidos, que consisten en una mezcla de polisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos y otras sustancias, son responsables de la formación y el mantenimiento de dichos canales de transporte.

La matriz del biofilm también contiene ADN extracelular, que participa en procesos de adhesión, interacciones intercelulares y determina la existencia específica de comunidades de biofilm (Tets, 2012).

Morfología de las células que forman el biofilm.

Usando microscopía electrónica se encontró que etapas iniciales Durante la formación de una biopelícula, la morfología de los microorganismos no cambia (Frolova, 2015). En etapas posteriores, las estructuras bacterianas adquieren especificidad morfológica asociada con el estado adjunto y la coexistencia colectiva. Además, las células dentro de la biopelícula sufren el reemplazo de estructuras superficiales, aumenta la frecuencia del intercambio de material genético entre individuos de la comunidad y se deforma la organización ultraestructural.

Propiedades y papel en la protección de poblaciones bacterianas.

Las biopelículas son uno de los factores protectores más importantes, ya que aumentan significativamente la tolerancia de las bacterias a situaciones estresantes (falta de oxígeno y nutrientes en condiciones de inanición), a factores sistema inmunitario cuerpo humano, a la acción de condiciones externas (antibióticos, desinfectantes, esterilización). Esta tolerancia contribuye a la adquisición de una resistencia absoluta a factores que podrían destruir las bacterias si estuvieran en estado libre.

El papel protector de las biopelículas consta de las siguientes propiedades:

1. Propiedad de barrera. Las biopelículas evitan que las moléculas y células grandes que causan inflamación penetren profundamente en su matriz y sirven como barrera de difusión para pequeños agentes antimicrobianos;
2. Propiedades protectoras acumulativas. Las bacterias (tanto de la misma como de diferentes especies) son capaces de intercambiar factores protectores (productos metabólicos o genes), es decir, llevar a cabo una protección mutua. Así, las bacterias de una especie que son resistentes a los antibióticos pueden transferir genes responsables de la resistencia a bacterias de otra especie que son sensibles a un determinado antibiótico, aumentando así su resistencia a la acción del factor;
3. Propiedad de intercambio que asegura la transferencia de genes y productos de desecho entre microorganismos que forman parte de una misma biopelícula (Chebotar, 2012; Tets, 2012);
4. La propiedad de inactividad, es decir, la formación de subpoblaciones inmóviles (inactivas, no metabolizadas, latentes), es una propiedad clave inherente exclusivamente a las biopelículas. Para que un antibiótico actúe sobre un microorganismo, éste debe ser metabólicamente activo. Por tanto, las bacterias inactivas en las biopelículas son las más resistentes a este tipo de influencia (Tets, 2012; Frolova, 2015).

Diversidad de sistemas que regulan la formación de biopelículas.

Las células dentro de la matriz intercelular tienen « sentido de quórum" ( quórum sintiendo) - la capacidad de transmitir información y regular el comportamiento debido a la secreción de moléculas de señalización. En otras palabras, es un sistema regulador ubicado dentro de la biopelícula. Hay tres sistemas conocidos que se diferencian entre sí por la naturaleza de los autoinductores:

1. Lo utilizan predominantemente bacterias gramnegativas y las moléculas de señal son la homoserina lactona acilada, que se une a una proteína reguladora que interactúa con dos enzimas reguladoras: la luciferasa y la homoserina lactona sintasa. La activación de proteínas reguladoras induce la creación de grupos de biopelículas por parte de microbios (Tets, 2012; Turkutyukov, 2013).
2. Es característico de las bacterias grampositivas y funciona utilizando formas lineales y cíclicas de péptidos, furanos, lactonas y sus derivados, secretados al ambiente externo. Algunos de ellos interactúan con las quinasas sensoras de unión a la membrana, que transmiten señales a través de la membrana, mientras que otras son transportadas al interior de la célula mediante permeasas, donde se unen a receptores intracelulares. El mecanismo de señalización de tales sistemas es la cascada de fosforilación-desfosforilación. Las moléculas de información interactúan con sistemas de dos componentes, que incluyen una proteína quinasa señal asociada con la membrana. La quinasa detecta el péptido mensajero y luego fosforila y activa una proteína reguladora que se une al ADN y regula la transcripción. Los péptidos señal de este sistema están codificados en el cromosoma y las proteínas receptoras están codificadas en plásmidos. Así, con la ayuda de dicha comunicación, se translocan los plásmidos que portan genes de resistencia a antibióticos, genes de hemolisina, bacteriocinas y genes de virulencia.
3. Se encuentra en todos los microorganismos y las moléculas de señalización están representadas por butirolactona, quinol, hidroxicetonas y luciferasa. Las bacterias tienen proteínas receptoras sensoras que se unen a autoinductores, formando un complejo que interactúa con una quinasa unida a la membrana. La quinasa se fosforila, el fosfato se transfiere a una proteína citoplasmática y luego a una proteína reguladora que se une al ADN. Posteriormente, se activan los genes que codifican los ARN reguladores, lo que conduce al cese de la expresión de los componentes de las estructuras celulares que implementan las comunicaciones intercelulares intraespecíficas.

Un sistema regulador tan complejo, basado en la producción de moléculas inductoras de señales, se lleva a cabo en diferentes niveles de influencia: transcripcional, traslacional y postraduccional. Gracias a la "detección de quórum", en la población de biopelículas ocurren constantemente dos tipos de selección: positiva y negativa, es decir, se conservan las células con propiedades ventajosas y se destruyen las bacterias con fenotipos "innecesarios" (Tets, 2012).

Participación del sistema TA (sistema toxina-antitoxina) en la formación de biopelículas.

Hablando de biopelículas, cabe señalar que no todos los microorganismos son capaces de formarlas. El proceso de síntesis de la matriz de exopolisacárido está determinado por ciertos factores. Según los últimos resultados de una investigación de la Universidad de Estrasburgo. Louis Pasteur puede argumentar que para la formación de una biopelícula es necesaria la presencia de una proteína especializada. Por ejemplo, para formar una comunidad. Estafilococo aureus Se requiere la presencia de proteína SasG (en complejo con Zn 2+). La proteína SasG es una proteína de unión a ARN que activa:

1) crecimiento de estructuras superficiales de bacterias: flagelos, pili;

2) síntesis de polisacáridos extracelulares;

3) asegura la formación de tolerancia.

Un conjunto de dos o más genes estrechamente relacionados, que juntos codifican tanto la proteína como el bloqueador correspondiente, es responsable de la secreción de la proteína SasG.

Este sistema se llama módulo TA. Está localizado en un plásmido. Se trata de un sistema bastante complejo que garantiza no sólo la capacidad de las bacterias para formar biopelículas, sino que también garantiza su viabilidad en su conjunto. Según el trabajo de (Yamaguchi, 2011), si la célula hija se priva del plásmido, entonces la antitoxina inestable (bloqueador) heredada del citoplasma de la célula madre se destruye y la proteína tóxica estable mata la célula.

Además, el módulo TA se encarga de:

1) regulación genética: algunas toxinas actúan como represores generales de la expresión genética, mientras que otras son más específicas;

2) control del crecimiento: como se señaló, las toxinas bacteriostáticas no matan la célula huésped, pero limitan su crecimiento;

3) resistencia celular: en algunas poblaciones bacterianas existe una subpoblación de células que son resistentes a múltiples clases de antibióticos. La subpoblación está controlada por sistemas de toxina-antitoxina. Estas células resistentes y de crecimiento lento protegen a la población de la extinción total.

4) muerte celular programada y supervivencia de sus “parientes cercanos” - nivel diferente resistencia de las células de la población a condiciones estresantes, provocando la muerte programada de algunas células, lo que impide la extinción de toda la población (la célula muerta se convierte en fuente de nutrición para el resto).

5) contrarrestar los bacteriófagos: cuando un bacteriófago altera la transcripción y traducción de proteínas celulares, la activación de los sistemas toxina-antitoxina limita la replicación de los fagos.

Aspecto clínico del estudio de biopelículas.

Actualmente, el papel de las biopelículas microbianas en la aparición y desarrollo de muchos enfermedades infecciosas. Se trata de infecciones de válvulas cardíacas y prótesis articulares, infecciones de superficies de heridas. Las heridas son un sustrato ideal para la contaminación microbiana con la posterior formación de biopelículas. Las biopelículas en la herida crean un ambiente con un determinado microclima, que se caracteriza por un bajo contenido de oxígeno. Las biopelículas retrasan la migración y proliferación de los queratinocitos, inhibiendo así los mecanismos inmunológicos protectores, y en el exterior crean una capa protectora impenetrable para antimicrobianos acción local(Chebotar, 2012a).

Biopelícula característica patologías infecciosas son la gingivitis (inflamación de las encías), la estomatitis (inflamación de la mucosa oral) y la formación de sarro. La otitis, el problema otorrinolaringológico más común, también se acompaña de la formación de biopelículas, no solo bacterianas sino también fúngicas.

Además de en las infecciones de las heridas, las biopelículas desempeñan un papel en la cronización de enfermedades del sistema urinario, infecciones asociadas a catéteres e implantes (catéteres, marcapasos, válvulas cardíacas, dispositivos ortopédicos) y enfermedades cardiovasculares (sinusitis, endocarditis). En otras palabras, las biopelículas desempeñan un papel fundamental en la patogénesis. amplia gama Enfermedades infecciosas tanto superficiales como profundas. Todas estas enfermedades son difíciles de tratar y tienen frecuencia alta recaídas y algunas de ellas pueden provocar la muerte.

Si se sospecha la presencia de microorganismos formadores de biopelículas en vivo Se tienen en cuenta los siguientes factores:

1) el desprendimiento de biopelículas en el torrente sanguíneo o en el tracto urinario puede provocar la formación de émbolos;

2) las biopelículas de bacterias gramnegativas pueden producir endotoxina (lipopolisacárido), lo que provoca un shock infeccioso-tóxico y un síndrome de coagulación intravascular diseminada;

3) las bacterias en las biopelículas pueden intercambiar plásmidos de resistencia (transferencia de resistencia de una especie a otra);

4) las bacterias de la biopelícula no son susceptibles al sistema inmunológico del huésped;

5) las biopelículas pueden reducir la sensibilidad de las bacterias a un agente antimicrobiano.

Los últimos tres puntos indican que las biopelículas son altamente resistentes a los antibióticos. Sin embargo, respecto a ellos es más apropiado utilizar el término tolerancia. Un ejemplo del surgimiento del fenómeno de la tolerancia es la proteína SasG. Estafilococo áureo. Su biosíntesis provoca una falla en el ciclo posterior a la replicación, lo que altera el funcionamiento de la enzima bacteriana girasa (un análogo de la topoisomerasa-4 en las bacterias). Esto conduce a la aparición de persistentes.

Los persistentes son células únicas de comunidades bacterianas que, al tener el mismo conjunto de genes que otros microorganismos de la comunidad, son muchas veces resistentes a factores externos, a diferencia de las células que las rodean (Ulyanov, 2014). Los persistentes se diferencian de las bacterias comunes en su fisiología: incluso en condiciones favorables, forman una matriz de exopolisacárido a su alrededor, a menudo crecen mucho más lentamente que las bacterias comunes y, como ya se mencionó, son altamente resistentes a factores externos. Los persistentes constituyen una pequeña parte de la comunidad bacteriana, pero su número aumenta durante la fase de crecimiento estacionario. Curiosamente, las células hijas tienen la misma resistencia a factores externos que las células persistentes madre.

Consideremos el mecanismo de resistencia persistente. Supongamos que una colonia bacteriana se ve afectada por un factor externo, por ejemplo, un antibiótico. El antibiótico inhibe la actividad de la girasa (topoisomerasa-4), como resultado de lo cual se producen roturas del ADN de doble cadena en la célula bacteriana, pero solo en aquellas áreas donde la girasa está activa, es decir, en el área de la " bifurcación de replicación”. Si las células están protegidas por una sustancia polimérica extracelular y el número de esos lugares no es más de dos o cuatro, entonces los sistemas celulares protegen a la bacteria de la muerte reparando el daño. En las células bacterianas ordinarias de rápido crecimiento hay muchas roturas de este tipo y el ADN se degrada cuando se utiliza un antibiótico, mientras que el ADN de las persistentes se conserva. Los efectos de los antibióticos pueden variar, pero todos enfrentan el mismo problema: los persistentes de crecimiento lento y bien protegidos son menos susceptibles al estrés y tienen tiempo para ser "apagados" antes de que se les cause un daño irreversible.

La información proporcionada no agota los datos sobre las características de las biopelículas microbianas. Cabe señalar que, a pesar de la gran cantidad de material teórico y la importancia del problema, las cuestiones relacionadas con la actividad formadora de biopelículas de microorganismos patógenos y condicionalmente patógenos en la microflora nosocomial de los hospitales médicos de diversos perfiles siguen sin resolverse. No existen fármacos que sean eficaces contra las biopelículas y la microflora en matrices extracelulares, así como medios para combatir las biopelículas maduras. Este problema requiere un mayor desarrollo.

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Se ha acumulado material experimental que demuestra la capacidad de NF para reanudar el crecimiento en condiciones favorables. Las condiciones de reversión incluyen el uso de diversos inductores de reversión (físicos, químicos, bióticos), pero también pueden implicar únicamente la supresión de efectos adversos, como se muestra, por ejemplo, en el caso de los microorganismos expuestos a los rayos gamma.

Entre los factores físicos, la causa más común de reversión es un aumento de la temperatura de 0,5-6°C a 20-22°C o hasta 37°C, o un calentamiento breve de hasta 45°C. El rápido aumento de UFC en los microcosmos se considera una confirmación de la reversión más que del recrecimiento de las pocas células supervivientes.

En algunos casos, la optimización de la temperatura no logra estimular la reversión. V. parahaemolyticus se revierte cuando la temperatura aumenta a 25°C en combinación con el uso de un ambiente mínimo de sal. Las NP de V. harveyi y V. fischeri reanudan su crecimiento cuando se complementan con fuentes orgánicas o inorgánicas de descomponedores de nitrógeno, carbono o peróxido de hidrógeno.

Entre los inductores químicos de la reversión del NF se conoce un grupo de compuestos que destruyen el peróxido de hidrógeno (antioxidantes). Dichos compuestos incluyen piruvato de sodio, catalasa y vitamina E. Se introducen directamente en microcosmos como protectores o en medios nutritivos destinados a la reversión. Esto hizo posible obtener la reversión de E. coli, V. parahaemolyticus. La eficiencia de la reversión se ve afectada por composición química medio y su estado de agregación (preferiblemente medios nutritivos líquidos).

Para revertir la NF, se añaden factores bióticos de crecimiento al medio nutritivo: suero fetal, el sobrenadante del cultivo en crecimiento o la proteína Rpf recombinante aislada del mismo. Se ha informado de la influencia de las citocinas en la reversión de la NF. Se revirtieron cepas virulentas de Salmonella no cultivadas in vitro e in vivo en presencia de factor de necrosis tumoral (TNF).

A veces lo único manera efectiva la reversión es un paso a través de un organismo susceptible. Por ejemplo, el recultivo de cepas patógenas de Salmonella NF cuando se introducen en el cuerpo de animales sensibles siempre ha dado resultados positivos. La recuperación paralela de las mismas suspensiones in vitro no produjo resultados positivos.

La verdad de la reversión, más que la reanudación del crecimiento de las células supervivientes, sigue siendo la cuestión más controvertida. El crecimiento a partir de un pequeño inóculo se utiliza como prueba de reversión. El crecimiento de un cultivo a partir de una pequeña cantidad de células vegetativas se produce mucho más lentamente que en las variantes con NF.

Estructuras celulares Definitivamente no fueron estudiados, ya que las células en sí no fueron cultivadas, sino que se conocen únicamente a partir de fragmentos de ADN. Al parecer, todavía será necesario separar a los “incultos” en culturas puras. Sin embargo, esto requiere métodos que sean baratos, rápidos y accesibles para cualquier laboratorio. análisis genético. Luego, por ejemplo, al descubrir ADN "incultivable" en una muestra, se puede comenzar a seleccionar los medios y las condiciones, comprobando cada vez con métodos genéticos: ¿la colonia cultivada es el "microorganismo no cultivable" deseado o no? Si no, variar nuevamente el ambiente y las condiciones hasta que, finalmente, lo “incultivable” pase a ser cultivado. Otro manera posible“mirarlos a la cara” es intentar poner algún tipo de etiqueta fluorescente o radiactiva en ADN aislado “no cultivado”, liberarlo en la naturaleza y ver con quién se hibrida según el principio de complementariedad. En cuanto a la organización del ADN, generalmente no se utiliza todo el ADN para el diagnóstico, sino sólo la región que codifica el ARN ribosómico 16S, y aquí no existen diferencias fundamentales entre bacterias, arqueas y “no cultivadas”. El ARN 16S se seleccionó de acuerdo con una serie de criterios completamente biológicos. razones justificadas. Pero este enfoque también sirve para “salir de la pobreza”: analizar el ADN completo es muy costoso y requiere mucha mano de obra; se ha realizado la secuenciación completa del genoma de muy pocos procariotas (recordemos cuánto esfuerzo y laboratorios de todo el mundo se dedicaron al genoma humano, mientras que las bacterias tienen sólo 10 veces menos genes que nosotros).

Un estudio de la reversión de protoplastos de bacterias y hongos reveló similitudes en el curso de este proceso en ellos. Convencionalmente, se puede dividir en tres etapas: 1) regeneración de la pared celular, 2) reversión, aparición de células revertidas, 3) restauración de la citocinesis normal y aparición de células de la forma original.

Al mismo tiempo, cada grupo de microorganismos tiene sus propias características de reversión de protoplastos, asociadas con la estructura de las células y paredes celulares, la naturaleza del metabolismo y la citocinesis.

Reversión de protoplastos bacterianos.. Si, cuando se trata con lisozima o penicilina en un ambiente isotónico, la pared celular de la célula bacteriana no se elimina por completo, cuando estos agentes se excluyen del ambiente, recuperación rápida células. Si la pared celular se elimina por completo, el verdadero protoplasto resultante no puede regenerarla en condiciones normales. Una de las condiciones que permite que dichas formas vuelvan a su estado original es la presencia de una base sólida o semisólida en el medio de cultivo. Puede ser gelatina (5-30%), agar (0,7-2%), filtros de membrana, células bacterianas muertas o paredes celulares. Además, es preferible el uso de un sustrato sólido.

Reversión de protoplastos de hongos filamentosos.. La reversión a formas miceliales en los protoplastos de hongos ocurre tanto en líquido como en la superficie de un medio sólido, o en una capa de agar semilíquido. Muchos investigadores han demostrado que la reversión de los protoplastos de los hongos puede ocurrir de tres maneras, que se diferencian en la naturaleza de la formación del micelio primario. Con el primer método Los protoplastos inicialmente forman una cadena de células similares a levaduras (hasta 20 células). Luego la terminal, ya osmóticamente estable, produce una hifa primaria que forma micelio. Segunda forma la reversión comienza con la regeneración de la pared celular por parte de los protoplastos, como resultado de lo cual se vuelven resistentes al shock osmótico. Luego, el protoplasto forma un tubo germinal. Tercera vía La reversión de los protoplastos fúngicos es inusual. El protoplasto, manteniendo su forma esférica, forma una nueva capa en forma de estante, luego el contenido del protoplasto madre se transfiere allí. Si aparece una cadena de tales membranas, entonces el citoplasma se mueve a lo largo de esta cadena, dejando "sombras" de las paredes celulares. La última célula de la cadena forma la hifa primaria. Los protoplastos de los hongos pueden revertirse de tres maneras, o una especie exhibe los tres modos de reversión. Es difícil decir qué influye en la elección del método de reversión, quizás las características específicas del organismo, el tipo de citocinesis, el método de obtención y las condiciones de incubación de los protoplastos o la composición del medio de regeneración.

Los protoplastos en crecimiento y reversión son un buen modelo para estudiar la biosíntesis de la pared celular y la relación entre el crecimiento celular y la división nuclear.

4.2. Cultivo de células vegetales

La idea de la posibilidad de cultivar células fuera del cuerpo se expresó a finales del siglo XIX. Período de 1892 a 1902 Puede considerarse la prehistoria del desarrollo del método de cultivo de células y tejidos vegetales. En ese momento, los científicos alemanes H. Fechting, K. Rechinger y G. Haberlandt intentaron cultivar trozos de tejido, grupos de células y pelos aislados de plantas. Sin lograr éxito experimental, estos primeros investigadores, sin embargo, expresaron una serie de ideas que luego se implementaron.

Durante los siguientes 20 años, se obtuvieron los primeros resultados del cultivo de tejidos animales en medios nutritivos con la adición de suero. Pero en el mundo vegetal no se ha logrado ningún éxito significativo, a pesar de los intentos de crear medios nutritivos óptimos capaces de garantizar la existencia y reproducción a largo plazo de las células vegetales in vitro.

En 1922, V. Robbins y Cotte demostraron de forma independiente la posibilidad de cultivar células meristemáticas de las puntas de las raíces de tomate y maíz en medios nutritivos sintéticos. Estos experimentos marcaron el comienzo del uso del método de cultivo de células y órganos vegetales aislados.

En los años 30-60, gracias al trabajo de un gran número de científicos (F. White, R. Gautre y otros), el número de especies de plantas cuyas células y tejidos se cultivaron in vitro alcanzó un número significativo (más de 150). . Se describieron las composiciones de los medios nutritivos, se determinaron las necesidades de los cultivos en vitaminas y estimulantes del crecimiento, se desarrollaron métodos para obtener y cultivar grandes masas de suspensiones celulares, así como cultivar una sola célula aislada de una suspensión. F. Steward, trabajando con un cultivo de floema de zanahoria aislado, obtuvo plantas enteras en 1958. La investigación de R. G. Butenko y sus colaboradores, que utilizaron estos métodos para estudiar la fisiología de las células vegetales y la morfogénesis de las plantas, hicieron una contribución significativa al desarrollo del cultivo de células y tejidos vegetales.

En los años siguientes, se propusieron métodos para obtener protoplastos aislados a partir de tejidos vegetales y se encontraron condiciones de cultivo en las que son capaces de formar nuevos. pared celular, se dividen y dan lugar a líneas celulares. Utilizando protoplastos aislados, se han desarrollado métodos para la hibridación de células somáticas fusionando protoplastos con PEG (polietilenglicol) e introduciendo en ellos ARN viral, orgánulos celulares y células bacterianas. Mediante el método de cultivo de meristemas se obtuvieron plantas libres de virus, económicamente importantes y con altas tasas de reproducción.

Actualmente, continúa activamente el desarrollo de métodos para el cultivo celular profundo, métodos de electrofusión de protoplastos aislados, etc.

El uso de métodos para obtener variantes somaclonales, haploides experimentales y la detección de mutantes bioquímicos ha llevado a la aparición de cepas celulares más productivas adaptadas a las condiciones de cultivo, que se utilizan para crear nuevas formas y variedades de plantas agrícolas, medicinales, ornamentales y otras.

Los agentes causantes de la tuberculosis son las micobacterias acidorresistentes, descubiertas por R. Koch en 1882. Se conocen varios tipos de Mycobacterium tuberculosis: Mycobacterium tuberculosis (especie humana), Mycobacterium africanum (especie intermedia) y Mycobacterium bovis (especie bovina), que pertenecen al género Mycobacterium, familia Mycobacteriacae, orden Actinomycetalis. Los agentes causantes de la tuberculosis en humanos con mayor frecuencia (en el 92% de los casos) son las micobacterias de la tuberculosis de la especie humana; las micobacterias bovinas y intermedias causan el desarrollo de la tuberculosis en humanos en el 5 y el 3% de los casos, respectivamente. En la clasificación microbiológica moderna, las micobacterias de la especie aviar (M. avium) se clasifican como micobacterias no tuberculosas del complejo avium - intracelular, que pueden ser agentes causantes de micobacteriosis en humanos y animales.

Mycobacterium tuberculosis: bastoncillos delgados, rectos o ligeramente curvados de 1 a 10 (generalmente de 1 a 4) micrones de largo, de 0,2 a 0,6 micrones de ancho, homogéneos o granulares con extremos ligeramente redondeados (Figura 1.1). Son inmóviles y no forman endosporas. conidios y cápsulas. La morfología y el tamaño de las células bacterianas varían significativamente, lo que depende de la edad de las células y, especialmente, de las condiciones de vida y la composición del medio nutritivo. Mediante microscopía electrónica se identificaron los principales elementos estructurales de Mycobacterium tuberculosis: la pared celular, la membrana citoplasmática y su derivado: mesosoma, citoplasma, sustancia nuclear: nucleótido.

La pared celular limita el exterior de la célula, proporcionando protección mecánica y osmótica. Al microscopio electrónico se distinguen tres capas de 10 nm de espesor en la pared celular; la capa superficial, la microcápsula, está formada por polisacáridos y desempeña un papel importante en la vida de las micobacterias, incluido su resistencia a los efectos adversos. La pared celular contiene antígenos específicos de cada especie. Las vacunas preparadas a partir de las paredes celulares de Mycobacterium tuberculosis tienen diferente virulencia e inmunogenicidad. La inmunidad más pronunciada la provocan las vacunas elaboradas a partir de las paredes celulares de micobacterias muy virulentas. Las paredes celulares provocan el desarrollo de hipersensibilidad de tipo retardado (DHT) y la formación de anticuerpos en el cuerpo de animales sanos. Sin embargo, sus fuertes propiedades sensibilizantes y la presencia de un factor de cordón tóxico (factor de virulencia) en ellos complican significativamente la hiperinmunización de Mycobacterium tuberculosis con esta fracción.

Fig 11 Mycobacterium tuberculosis Contraste negativo x 35 000

kulosis [Averbakh M. M. et al., 1976; Romanova R. Yu., 1981]. La tarea consiste en aislar componentes con alta actividad protectora de las fracciones de la pared celular.

Según los conceptos modernos, la membrana citoplasmática ubicada debajo de la pared celular incluye complejos de lipoproteínas. A él se asocian varios sistemas enzimáticos, en particular los redox. Los procesos responsables de

Especificidad de las reacciones de las células micobacterianas al medio ambiente.

La membrana citoplasmática de Mycobacterium tuberculosis, por invaginación en el citoplasma, forma un sistema de membrana intracitoplasmática o mesosoma. Los mesosomas son multifuncionales. A ellos está asociada la localización de muchos sistemas enzimáticos; participan en la síntesis del material de la pared celular y actúan como intermediario entre el núcleo y el citoplasma. Se ha observado un desarrollo débil o ausencia de mesosomas en cepas avirulentas de Mycobacterium tuberculosis y sus formas L [Katz L.N., Volk A.V., 1974]. El citoplasma de Mycobacterium tuberculosis está formado por gránulos y vacuolas de varios tamaños. La mayor parte de las inclusiones de granulado fino está representada por ribosomas, en los que se sintetiza una proteína específica.

La sustancia nuclear de Mycobacterium tuberculosis determina las propiedades específicas de la célula, las más importantes de las cuales son la síntesis de proteínas y la transmisión de características hereditarias a la descendencia. Se ha establecido que el principal método de reproducción de estas bacterias es la división de las células madre en dos células hijas.

Se ha establecido que el portador de información genética bacteriana no son solo los cromosomas, sino también los elementos no cromosómicos: los plásmidos. La principal diferencia entre cromosomas y plásmidos es su tamaño. El cromosoma es muchas veces más grande que el plásmido y, en consecuencia, lleva gran número información genética. Es posible la interacción de plásmidos con el cromosoma. Los plásmidos, debido a su pequeño tamaño, están bien adaptados para la transferencia de una célula a otra. La investigación sobre plásmidos no es sólo teórica, sino también significado práctico. Existe la opinión de que los genes de resistencia de Mycobacterium tuberculosis a la quimioterapia se localizan tanto en el cromosoma como en el plásmido.

Se han descrito numerosas variantes morfológicas de las micobacterias: formas gigantes con ramas engrosadas en forma de matraz, formas filamentosas, miceliformes y en forma de maza, difteroides y actinomicóticas. Mycobacterium tuberculosis puede ser más largo o más corto, más grueso o más delgado de lo habitual, homogéneo o granular. En ocasiones aparecen como cadenas o racimos individuales de granos cocoides.

El fenómeno de la variabilidad en Mycobacterium tuberculosis se descubrió poco después de su descubrimiento. Ya en 1888, I. I. Mechnikov informó que en los cultivos, además de los típicos bacilos de Koch, se encuentran formas polimórficas de estos microorganismos en forma de eslabones cortos conectados en pares y formaciones gigantes con ramas en forma de matraz. El primer informe sobre la posibilidad de existencia de formas filtrables en Mycobacterium tuberculosis se remonta a 1910 (A. Fontes). Durante la quimioterapia de la tuberculosis destructiva experimental, así como después de su cese, en homogeneizados de la pared de la cavidad se pasan a través de filtros bacterianos con un tamaño de poro de 0,2 μm.

Formas muy pequeñas, con una estructura simplificada, del agente causante de la tuberculosis, llamadas ultrapequeñas (Fig. 1.2). Luego se demostró que estas formas, a través de repetidos pasajes biológicos, son capaces de revertirse a la forma clásica en forma de bastón [KhomenkoA. G. et al., 1982, 1989]. Uno de los tipos de variabilidad de muchas bacterias es la formación de formas L. La capacidad de formar formas L también se ha demostrado en Mycobacterium tuberculosis [Dorozhkova I. R., 1974; Shmelev N. A., Zemskova Z. S, 1974]. Se ha descubierto que la transformación de las micobacterias en formas L aumenta bajo la influencia de fármacos antituberculosos. El esputo de pacientes "abacilares" con formas destructivas de tuberculosis puede contener formas L de micobacterias que pueden permanecer en el cuerpo durante mucho tiempo y posteriormente, en condiciones apropiadas, volver a la variante en forma de bastón [KhomenkoA. G. et al., 1980]. En consecuencia, la abacilación de las caries de estos pacientes no significa su esterilización contra Mycobacterium tuberculosis.

Además de la variabilidad morfológica, Mycobacterium tuberculosis se caracteriza por una amplia variabilidad de otras características, en particular la acidez. Este último se manifiesta por la capacidad de conservar el color incluso con decoloración intensa con alcohol ácido y es un rasgo característico de todo tipo de micobacterias, por su alto contenido en ácido micólico y lípidos. La pérdida parcial o total de la resistencia a los ácidos conduce a la formación de una población mixta formada por individuos resistentes y no resistentes a los ácidos, o una población completamente no resistente a los ácidos.

Mycobacterium tuberculosis es muy resistente a los factores ambientales. En condiciones naturales, en ausencia de luz solar, su viabilidad puede persistir durante varios meses en luz difusa, los patógenos mueren después de 1 a 42 meses; Mycobacterium tuberculosis persiste en el polvo de la calle hasta 10 días, en las páginas de libros hasta 3 meses, en el agua hasta 5 meses. Al mismo tiempo, un cultivo de microorganismos irradiados por la luz solar muere en IV2 horas y menos. la influencia de los rayos ultravioleta - después de 2-3 minutos . Al hervir el esputo húmedo, las micobacterias mueren después de 5 minutos, el esputo seco, después de 25 minutos. Los compuestos que liberan cloro activo libre (soluciones de cloramina al 3-5%, soluciones de lejía al 10-20%, etc.) provocan la muerte de Mycobacterium tuberculosis en 3-5 horas.

Mycobacterium tuberculosis se considera aerobios, aunque existe evidencia de que algunas de sus especies pueden considerarse anaerobios facultativos. Estas micobacterias se reproducen muy lentamente (una división celular ocurre en 14 a 18 horas). El crecimiento microscópicamente visible de microcolonias cultivadas en medios líquidos a una temperatura de 37 °C se detecta en los días 5 a 7, y el crecimiento visible de colonias en medios sólidos cultivados a la misma temperatura se detecta en los días 14 a 20.

Para el desarrollo normal de Mycobacterium tuberculosis, se requieren medios nutritivos especiales que contengan carbono, nitrógeno, oxígeno, hidrógeno, fósforo, magnesio, potasio, sodio, hierro, cloro y azufre. Estos microorganismos también necesitan algunos factores de crecimiento, que incluyen compuestos relacionados con la vitamina B, biotina, nicotina, riboflavina, etc. Todos estos factores se incluyen en los medios nutritivos especiales utilizados para el cultivo de Mycobacterium tuberculosis, de los cuales se aíslan los medios que contienen glicerol. medios proteicos (huevo, suero, patata) y medios libres de proteínas (sintéticos), que incluyen sales minerales. Según su consistencia se pueden clasificar en medios sólidos, semilíquidos y líquidos. Los más utilizados son los medios de huevo densos de Levenstein-Jensen, Ogawa, Petragnani y Gelber, varios medios de agar de Middlebrook, medios sintéticos y semisintéticos de Soton, Dubos, Proskauer-Heck, Shula, Shkolnikova, etc.

En medios nutritivos líquidos, las microbacterias de la tuberculosis crecen en forma de una película seca y arrugada (forma P), de color crema, que se eleva hasta las paredes del recipiente, mientras que el medio permanece transparente. Durante el desarrollo intracelular de las micobacterias, así como cuando se cultivan en medios líquidos, se libera claramente un factor característico del cordón (trehalosa-6,6-dimicolato). Se encuentra en la superficie de las células de muchas micobacterias y, según algunos investigadores, está relacionado con su virulencia, favoreciendo la convergencia de las células microbianas y su crecimiento en forma de trenzas serpentinas.

En medios sólidos, Mycobacterium tuberculosis crece en forma de una capa ligera, cremosa, arrugada o escamosa seca, formando colonias de bordes irregulares, elevadas en el centro, a medida que crecen adquieren un aspecto verrugoso, que recuerda a la coliflor;

Bajo la influencia de sustancias antibacterianas, Mycobacterium tuberculosis puede adquirir resistencia a los medicamentos. Los cultivos de estas micobacterias no siempre son típicos; pueden ser húmedos, blandos (variante S) y, en ocasiones, contener colonias individuales lisas o pigmentadas.

1.2. PATOGENESIA

Mycobacterium tuberculosis puede ingresar al cuerpo de varias maneras: aerógena, enteral (a través de tracto gastrointestinal), a través de la piel y las membranas mucosas dañadas, a través de la placenta durante el desarrollo fetal. Sin embargo, la principal vía de infección es la aerogénica.

Un cierto papel protector en la infección aerogénica lo desempeña el sistema de limpieza mucociliar, que permite eliminar parcialmente partículas de polvo, gotas de moco, saliva y esputo que contienen microorganismos que han entrado en los bronquios. En caso de infección enteral, la función de absorción del intestino puede tener cierta importancia.

Los cambios locales en el sitio de penetración de la micobacteria se deben principalmente a la reacción de las células polinucleares, que se reemplaza por una forma más avanzada de reacción protectora con la participación de macrófagos que llevan a cabo la fagocitosis y la destrucción de la micobacteria. El proceso de interacción de los macrófagos pulmonares con diversos microorganismos, incluido Mycobacterium tuberculosis, es complejo y no se comprende completamente. El resultado de la interacción entre macrófagos y micobacterias está determinado por el estado del sistema inmunológico, el nivel de PCTI que se desarrolla durante la infección por tuberculosis, así como por una serie de otros factores, incluidos los que determinan la capacidad digestiva de los macrófagos.

La fagocitosis consta de tres fases: la fase de contacto, cuando los macrófagos, utilizando receptores en la membrana celular, fijan las micobacterias; fases de penetración de la micobacteria en el macrófago mediante invaginación de la pared del macrófago y "envoltura" de la micobacteria; Fases de digestión, cuando los lisosomas de los macrófagos se fusionan con los fagosomas que contienen micobacterias. Las enzimas liberadas en los fagolisosomas destruyen las micobacterias. En el proceso de fagocitosis, los mecanismos de peroxidación también juegan un papel importante.

Mycobacterium tuberculosis, como algunos otros microorganismos, cuando ingresa a los macrófagos, puede persistir e incluso continuar reproduciéndose. En los casos en que se bloquea el proceso de digestión de las micobacterias, los macrófagos se destruyen y las micobacterias se liberan de las células que las han absorbido.

Los macrófagos, que han fagocitado las micobacterias y las han digerido, liberan en el espacio extracelular fragmentos de micobacterias destruidas, enzimas proteolíticas, mediadores (incluida la interleucina-1), que activan los linfocitos T, en particular los T-helpers. Las células T auxiliares activadas liberan mediadores: linfocinas (incluida la interleucina-2), bajo cuya influencia nuevos macrófagos migran a la ubicación de la micobacteria. Al mismo tiempo, se suprime la síntesis del factor de inhibición de la migración y actividad enzimática macrófagos bajo la influencia del factor de activación de macrófagos. Los linfocitos activados también secretan un factor reactivo de la piel, que provoca una reacción inflamatoria y un aumento de la permeabilidad vascular. A este factor se asocia la supresión de PCZT y la reacción positiva a la tuberculina [Medunitsyn N.V. et al., 1980]. Además de los T-helpers, el estado de inmunidad está significativamente influenciado por los T-supresores y los monocitos supresores, que inhiben la respuesta inmune.

Además de los linfocitos T y los macrófagos, un papel importante en la patogénesis del proceso tuberculoso lo desempeñan las sustancias liberadas durante la destrucción de las micobacterias. Estas sustancias (fracciones) se han estudiado en detalle. Se ha demostrado que el factor del cordón (el factor de virulencia de Mycobacterium tuberculosis, que determina su crecimiento en un medio nutritivo denso en forma de "trenzas") provoca un proceso inflamatorio agudo, y las sulfátidas aumentan la toxicidad del factor del cordón y, Lo más importante es suprimir la formación de fagolisosomas en los macrófagos, lo que protege de la destrucción a las micobacterias ubicadas intracelularmente.

Con la proliferación intensiva de micobacterias en el cuerpo humano, debido a una fagocitosis ineficaz, se libera una gran cantidad de sustancias tóxicas, se induce una PCI pronunciada, lo que contribuye a la aparición de un componente exudativo de la inflamación con el desarrollo de necrosis caseosa y su proliferación. . Durante este período, la cantidad de T-supresores aumenta y la cantidad de T-helper disminuye, lo que conduce a la inhibición de la PCRT. Esto provoca la progresión del proceso tuberculoso.

Con una población bacteriana relativamente pequeña, en condiciones de PCZT y fagocitosis eficaz, se observa la formación de granulomas tuberculosos. Este granuloma se desarrolla como resultado de reacciones de PCZT [Averbakh M. M. et al., 1974]. La acumulación de células mononucleares alrededor de los neutrófilos que contienen antígeno y su posterior transformación se producen bajo la influencia reguladora de las linfocinas producidas por los linfocitos T (en particular, las células T colaboradoras) y son mediadores de la reacción granulomatosa. Dado que el tamaño de la población bacteriana, así como la naturaleza del curso de las reacciones inmunológicas en las diferentes etapas de la infección tuberculosa, cambian, las reacciones morfológicas en pacientes con tuberculosis se caracterizan por una gran diversidad.

Dependiendo del lugar de introducción de Mycobacterium tuberculosis, se puede formar un foco inflamatorio o afecto primario en los pulmones. cavidad bucal, amígdalas, intestinos, etc. En respuesta a la formación del afecto primario, se desarrolla un proceso específico en la región ganglios linfáticos y se forma el complejo primario de tuberculosis. Se ha establecido que la tuberculosis primaria, que se desarrolla como resultado del primer contacto de un macroorganismo con un patógeno, puede manifestarse no solo en forma de un complejo de tuberculosis primaria, como se pensaba anteriormente. Como resultado de la infección primaria, es posible el desarrollo de tuberculosis de los ganglios linfáticos intratorácicos, pleuresía, tuberculoma y proceso focal.

La tuberculosis primaria como resultado de una infección "fresca" se desarrolla sólo en el 7-10% de las personas infectadas, el resto sufre una infección tuberculosa primaria sin manifestaciones clínicas. Una vez que se produce la infección, se manifiesta sólo en cambios en las reacciones a la tuberculina.

Incluso V.I. sin provocar una reacción inflamatoria. En este caso, las micobacterias se encuentran con mayor frecuencia en los ganglios linfáticos, especialmente en los intratorácicos. En estos casos, los cambios locales en los pulmones u otros órganos en forma de focos de tuberculosis primaria ocurren en el último período de la infección primaria y no en el lugar de penetración de la micobacteria en el cuerpo, sino en las áreas más favorables para el desarrollo de la tuberculosis. inflamación.

La ausencia de manifestaciones clínicas y morfológicas de la infección tuberculosa primaria puede explicarse por el alto nivel de resistencia natural a la tuberculosis y también puede ser consecuencia de una infección adquirida. vacunación BCG inmunidad.

En presencia de manifestaciones locales, la tuberculosis primaria puede ocurrir con el desarrollo de un proceso generalizado de tipo complicado o, que actualmente se observa con mucha más frecuencia, de tipo no complicado con una reacción inflamatoria limitada.

Como regla general, la tuberculosis primaria se cura con cambios residuales menores, lo que aparentemente se debe a una alta resistencia natural y a la vacunación y revacunación masiva con BCG.

Las micobacterias que permanecen en focos residuales o sus formas alteradas deben considerarse como un antígeno de tuberculosis, cuya presencia es necesaria para el mantenimiento de la inmunidad específica por parte de los linfocitos sensibilizados. Un papel determinado, aunque todavía poco comprendido, en el mantenimiento de la inmunidad antituberculosa pertenece a la inmunidad de las células B y a los mecanismos genéticos.

Se han obtenido pruebas del papel de la herencia durante el proceso de berculosis. Los factores genéticos influyen en la respuesta del sistema inmunológico durante la proliferación de Mycobacterium tuberculosis en el cuerpo humano y, en particular, determinan la interacción entre macrófagos, linfocitos T y B, la producción de linfocinas, monocinas y otras citocinas por parte de los linfocitos T y B y macrófagos, y la respuesta inmune compleja, que determina la sensibilidad o resistencia al desarrollo de la tuberculosis. La vinculación de los genotipos HLA con la tuberculosis se reveló en familias en las que padres e hijos padecen tuberculosis.

La acumulación de algunos tipos específicos de HLA en grupos de pacientes con un curso desfavorable de la enfermedad indica la asociación de ciertos genes del complejo HLA (principalmente los loci B y DR con predisposición a la tuberculosis) [Khomenko A. G., 1985].

El período de infección primaria puede terminar en curación con cambios residuales mínimos (pequeños) o bastante pronunciados. Estas personas desarrollan inmunidad adquirida. La persistencia de micobacterias persistentes en focos residuales no solo respalda la inmunidad adquirida, sino que también crea simultáneamente el riesgo de reactivación endógena del proceso tuberculoso debido a la reversión de formas alteradas del patógeno de la tuberculosis a una forma bacteriana y la proliferación de la población de micobacterias.

La reversión de formas persistentes de micobacterias a formas multiplicadas ocurre en condiciones de reactivación endógena de focos de tuberculosis y otros cambios residuales. El mecanismo de reactivación endógena, así como el desarrollo del proceso tuberculoso, no han sido suficientemente estudiados.

La reactivación se basa en la proliferación progresiva de la población bacteriana y un aumento del número de micobacterias [Khomenko A. G., 1986]. Sin embargo, hasta el día de hoy se desconoce exactamente qué y qué condiciones contribuyen a la reversión del patógeno de la tuberculosis, que se encontraba en un estado persistente. Se ha establecido que la reactivación de la tuberculosis y el desarrollo de sus diversas formas clínicas Se observan con mayor frecuencia en individuos con cambios residuales en presencia de factores que reducen la inmunidad.

Otra posible forma de desarrollar tuberculosis secundaria es exógena, asociada con una nueva (repetida) infección por Mycobacterium tuberculosis (sobreinfección). Pero incluso con la vía exógena de desarrollo de la tuberculosis secundaria, la penetración de micobacterias en un organismo ya infectado no es suficiente, incluso en el caso de una sobreinfección masiva repetida. Es necesaria una combinación de una serie de condiciones y factores de riesgo que reducen la inmunidad. La tuberculosis secundaria se caracteriza por una amplia variedad de formas clínicas. Los principales tipos de cambios patomorfológicos en los pulmones y otros órganos se caracterizan por: a) focos con una reacción tisular predominantemente productiva, un curso crónico favorable y una tendencia a curarse; b) cambios infiltrativos-neumónicos con reacción tisular predominantemente exudativa y tendencia a desarrollar necrosis caseosa o resolver la reacción inflamatoria resultante; c) cavidad tuberculosa: el resultado de la descomposición de las masas caseosas formadas y su rechazo a través de los bronquios de drenaje con la formación de una cavidad de descomposición.

Varias combinaciones de los principales cambios patomorfológicos de la tuberculosis crean los requisitos previos para una variedad extremadamente amplia de cambios tuberculosos, especialmente en el curso crónico de la enfermedad con períodos alternos de exacerbación y hundimiento del proceso. A esto hay que añadir que desde las zonas afectadas formadas, las micobacterias pueden propagarse a través del flujo de linfa o sangre a zonas no afectadas y a diversos órganos. El resultado de la enfermedad depende de su curso (progresivo o regresivo), de la eficacia del tratamiento y de la reversibilidad de los cambios que se forman durante el proceso de la enfermedad. Se ha demostrado que en condiciones de inanición e incluso desnutrición, especialmente cuando no hay suficientes proteínas y vitaminas en la dieta, a menudo se produce una reactivación de la tuberculosis. Los factores que contribuyen a la reactivación incluyen varias enfermedades: diabetes mellitus, linfogranulomatosis, silicosis, úlcera péptica estómago y duodeno, condición después de la resección del estómago y duodeno, enfermedades inflamatorias crónicas de los pulmones, enfermedad mental, que ocurre con síndrome depresivo, alcoholismo, situaciones estresantes, SIDA, uso prolongado de glucocorticoides, citostáticos e inmunosupresores. El curso y los resultados de la tuberculosis deben considerarse sólo en el contexto de la quimioterapia específica, que se utiliza para todos los pacientes con tuberculosis activa. Durante la quimioterapia, hay una disminución en la población de micobacterias debido al efecto destructivo de la quimioterapia sobre los patógenos de la tuberculosis. Como resultado, la cantidad de micobacterias disminuye drásticamente y se crean condiciones más favorables para los procesos reparativos y la sanogénesis. Al mismo tiempo, cuando se utilizan las combinaciones más efectivas de medicamentos de quimioterapia modernos, se observa un curso diferente del proceso de la tuberculosis: regresión seguida de curación, estabilización del proceso sin curación clínica con preservación de la cavidad, tuberculoma u otros cambios, temporales. hundimiento proceso inflamatorio con la posterior aparición de exacerbación, desarrollo de un proceso crónico o progresión de la enfermedad.

Por tanto, la reducción de la población de micobacterias bajo la influencia de fármacos quimioterapéuticos específicos no siempre conduce a una cura. La terminación del proceso tuberculoso y su posterior curación dependen no sólo de la reducción de la población de micobacterias, sino también de la capacidad de los procesos reparadores del organismo para garantizar la regresión del proceso tuberculoso y su cese.

1.3. ANATOMÍA PATOLÓGICA

1.3.1. Inflamación tuberculosa

Los cambios patomorfológicos en órganos y tejidos durante la tuberculosis son diversos y dependen de la forma, etapa, localización y prevalencia del proceso patológico.

En la mayoría de las formas de tuberculosis son comunes los cambios específicos en combinación con reacciones inespecíficas o paraespecíficas. Los cambios específicos incluyen inflamación tuberculosa, cuyo curso se acompaña de la formación de un tubérculo tuberculoso o granuloma y una lesión más grande. Los cambios inespecíficos son varias reacciones, provocando las llamadas máscaras de tuberculosis.

La morfología de la inflamación tuberculosa depende de la reactividad del organismo y de la virulencia del patógeno. En un foco tuberculoso pueden predominar los fenómenos de exudación, necrosis o proliferación, y el foco, en consecuencia, puede ser predominantemente exudativo, necrótico o productivo. Los procesos inmunológicos juegan un papel importante en el desarrollo de la inflamación tuberculosa. En la zona de la inflamación se desarrolla primero una reacción que no presenta signos típicos de la tuberculosis. En él se expresan en diversos grados los fenómenos de alteración y exudación. Lo primero son los trastornos del sistema microcirculatorio. Afectan la estructura fina de la pared alveolar y los mecanismos de su desarrollo se pueden rastrear en el nivel ultraestructural [Erokhin V.V., 1987]. En primeras etapas La inflamación, los cambios en la organización submicroscópica de los elementos constitutivos de la pared alveolar se asocian con un aumento de la permeabilidad capilar, el desarrollo de edema intersticial e intraalveolar intracelular con lixiviación del surfactante alveolar por el líquido edematoso.

En el futuro cambios distróficos en el tejido alveolar aumentan, pero junto a ellos también surgen procesos compensatorios y reparadores, encaminados a desarrollar la organización intracelular y aumentar la actividad funcional de las células restantes del tabique interalveolar. En la siguiente fase de inflamación, proliferativa, aparecen elementos específicos de la tuberculosis (células epitelioides y gigantes de Pirogov-Langhans), se forman áreas de una especie de necrosis caseosa homogénea (cuajada) en el centro del foco de la tuberculosis (Fig. 1.3). A partir de datos de microscopía electrónica y autorradiografía sobre la dinámica de la transformación celular, se ha establecido una conexión genética entre las células de granuloma a lo largo de la línea celular monocito-gigante [Serov V.V., Shekhter A.B., 1981; Erokhin V.V., 1978, 1987; Danneberg AM, 1982; Spector W. G., 1982]. Los macrófagos sintetizan y acumulan activamente enzimas lisosomales y realizan una función fagocítica. El material absorbido, que incluye Mycobacterium tuberculosis, se localiza y se digiere en fagosomas y fagolisosomas. Células epitelioides

se forman a partir de células mononucleares y macrófagos que se acumulan en el foco de la inflamación tuberculosa en las primeras fases de la reacción inflamatoria. Tienen un núcleo grande de forma ovalada, generalmente con 1-2 nucléolos. El citoplasma de estas células contiene mitocondrias, gránulos, el aparato de Golgi, un sistema bien desarrollado de túbulos y cisternas de retículo citoplásmico granular y no granular y un solo. pequeños fagosomas. El número de mitocondrias, elementos del retículo e inclusiones lisosomales varía ampliamente y está determinado estado funcional células.

Las células gigantes de Pirogov-Langhans pueden formarse a partir de células epitelioides o macrófagos durante su proliferación, así como como resultado de la fusión de células epitelioides. El citoplasma de las células gigantes contiene una gran cantidad de núcleos, generalmente ubicados en forma de anillo o herradura a lo largo de la periferia de las células, muchas mitocondrias, lisosomas, elementos del retículo citoplásmico granular y un complejo de Golgi bien desarrollado. Las células gigantes son capaces de fagocitosis; en su citoplasma se encuentran varias inclusiones residuales. Se caracterizan por una alta actividad de enzimas hidrolíticas y respiratorias.

Además de las células epitelioides y gigantes, el tejido de granulación tuberculoso suele contener una cantidad significativa de células linfoides y plasmáticas, así como leucocitos neutrófilos. Los fibroblastos se detectan en las partes periféricas de la capa de granulación. Alrededor del foco de inflamación suele haber una zona perifocal de reacción inflamatoria inespecífica. A medida que avanza el proceso, se observa un aumento de la necrosis caseosa, una mayor infiltración del tejido de granulación con células mononucleares y células linfoides, así como neutrófilos, y una expansión de la zona de inflamación perifocal. Un proceso específico se propaga por contacto y vía linfática.

Durante la curación de un foco tuberculoso, las masas de necrosis caseosa se vuelven más densas y en esta última se depositan pequeños granos de sales de calcio. En el tejido de granulación, aumenta la cantidad de fibroblastos y fibrillas de colágeno, que se combinan en fibras de colágeno, que forman una cápsula de tejido conectivo alrededor del foco de la tuberculosis. Posteriormente, el tejido de granulación específico se sustituye cada vez más por tejido fibroso. La cantidad de elementos celulares entre las fibras de colágeno disminuye y, a veces, las fibras de colágeno sufren hialinosis. En tales focos y focos post-tuberculosos se encontraron formas alteradas de Mycobacterium tuberculosis, en particular la forma L, lo que permite comprender mejor el papel de los focos antiguos de tuberculosis en la patogénesis de las formas secundarias de tuberculosis [Puzik V. I., Zemskova Z. S., Dorozhkova I. R., 1981, 1984]. La base para la reactivación de la tuberculosis y la formación. varias formas La tuberculosis pulmonar secundaria es causada por la reversión y proliferación de la población bacteriana en el contexto del desarrollo de una insuficiencia de protección específica e inespecífica del microorganismo.

Aquellas que han perdido total o parcialmente la pared celular o los precursores de su biosíntesis, creciendo en forma de pequeñas colonias características. Descubierto por primera vez en 1935 por E. Klieneberger en el cultivo de Streptobacillus moniliformis, aislado por K. Levaditi et al. en 1932 del líquido articular de un paciente con eritema articular epidémico. Streptobacillus moniliformis es un bacilo gramnegativo hemoglobinófilo con distintas hinchazones en los extremos, que crece bien en agar sangre (10-20%) y suero coagulado.

Al estudiar la infección experimental en ratas, Klineberger aisló varias cepas que contenían, además de las típicas formas bacterianas, microorganismos polimórficos, muy similares en apariencia de colonias y morfología a organismos similares a pleuropneumoniae (P PL O). Estos microorganismos recibieron el nombre del Instituto que lleva su nombre. Listera - Forma de L.

Durante muchos años, Klineberger consideró las formas L como representantes de los simbiontes PPLO de la bacteria Streptobacillus moniliformis. La evidencia de la existencia simbiótica de dos microorganismos diferentes fue la ausencia de reversión de bacterias de las formas L durante 13 años (350 resiembras).

Varios experimentos de Amer. El investigador L. Dienes y otros demostraron la falacia del concepto de Klineberger. Se ha demostrado que las formas L de Streptobacillus moniliformis, Fusiformis necrophorus y otras bacterias son capaces de volver a la forma original de bacteria. La formación de formas L de bacterias se describe con los nombres de “transformación L”, “conversión L”, “inducción de formas L”.

V. D. Timakov y G. Ya. Kagan obtuvieron formas L de muchos tipos de bacterias, estudiaron su biol, sus propiedades y su papel en la patología (carditis reumática, endocarditis séptica, meningoencefalitis, hron, gonorrea, etc.).

La conversión a la forma L es una propiedad probablemente compartida por todas las bacterias. Los fármacos que tienen un efecto L-transformador bloquean determinadas partes de la biosíntesis de las paredes celulares, principalmente el peptidoglicano (mureína), o las destruyen. Los fármacos que inducen las formas L de bacterias incluyen: 1) antibióticos del espectro de acción adecuado, por ejemplo, penicilina, cicloserina, lisostafina, etc.; 2) enzimas murolíticas: lisozima, endoacetilhexosaminidasa de lisina fagoasociada de estreptococos del grupo C, etc.; 3) ciertos aminoácidos (glicina, etc.).

La inducción de formas L de bacterias depende de las condiciones y medios de cultivo: es necesario crear físico-químico. un entorno que ayuda a estabilizar la membrana bacteriana osmóticamente frágil y protege a las formas L de la muerte.

La composición del medio y las condiciones de cultivo varían dependiendo del tipo de bacteria; una concentración de agar gel semisólido y semilíquido, la presencia de suero normal de caballo y la selección de la concentración osmótica de sales que ayudan a mantener la integridad de Se requieren la membrana citoplasmática de las bacterias en forma L.

Hay formas L de bacterias inestables y estables. Las formas inestables retienen ciertos elementos de la pared celular o sus precursores y, cuando se pasan por medios sin un agente inductor de L, vuelven a la forma original de bacteria. Las formas estables pierden completamente los componentes de la pared celular y no pueden restaurarla, por lo que no vuelven a la forma original de la bacteria, incluso con pases repetidos en medios sin un agente inductor, así como en medios que contienen succinato de sodio o gelatina, que promueven la reversión de bacterias de formas L.

Las formas L de bacterias crecen en forma de dos tipos de colonias: A. y B. Las colonias de tipo A son más características de las formas L estables de bacterias, son muy pequeñas (50-100 micrones) y crecen en agar. , crecen bien en grupos; las colonias individuales a menudo no producen crecimiento. Los elementos reproductores mínimos de las colonias de tipo A, que están completamente desprovistas de pared celular, no tienen receptores de fagos. Las colonias de tipo B son más características de las formas L inestables de bacterias; son más grandes, de 0,5 a 2 mm de tamaño, con un borde de encaje delicado y un centro que crece hacia el medio. Las colonias están dominadas por cuerpos esféricos de diferentes densidades ópticas; Contienen menos elementos submicroscópicos que en las colonias de tipo A. Conservan ciertos elementos de la pared celular, receptores sensibles a fagos y pueden ser aglutinados por el suero de la especie original.

La diferenciación de colonias en tipos A y B es condicional, al igual que el fenómeno de estabilización de las formas L. Los cultivos de formas L estables de bacterias pueden contener colonias de tipo B, y los cultivos de formas L inestables pueden contener colonias de tipo A.

Las colonias de bacterias en forma L contienen: 1) cuerpos esféricos de diferentes densidades y tamaños ópticos; 2) cuerpos elementales o gránulos, ubicados en grupos, así como intracelularmente en formaciones esféricas o vacuolas más grandes; 3) cuerpos mal contorneados, informes y en constante crecimiento; 4) formas complicadas; 5) cuerpos grandes con inclusiones en forma de vacuolas. Las formas L de bacterias difieren en el polimorfismo (Fig. 1, 1-6) y al mismo tiempo son fundamentalmente iguales en diferentes tipos de bacterias, lo que no permite diferenciarlas por características morfológicas.

Junto con la pérdida de la pared celular, las bacterias en forma L pierden mesosomas, lo que conduce a la unión directa de la membrana citoplasmática al nucleoide; no se observa restauración de mesosomas durante el proceso de reversión.

La ausencia de pared celular provoca desorganización de la división y multiplicidad de morfologías, manifestaciones durante la reproducción de las formas L de bacterias. Las formas L de bacterias se reproducen por división, gemación o desintegración de la célula en pequeños gránulos.

Las características fisiológicas, antigénicas y patógenas de estas formas están determinadas por la estructura de su membrana citoplasmática y, posiblemente, del citoplasma.

Las formas L de bacterias se forman no solo in vitro, sino también in vivo; pueden persistir en el cuerpo y revertirse a la forma bacteriana original;

La Figura 2 muestra los resultados de la obtención de formas L de S. typhi in vivo bajo la influencia de penicilina. Se administraron bacterias y antibióticos simultáneamente por vía intraperitoneal a ratones. Con la introducción de 100 unidades de penicilina por 1 g de peso, se formaron formas L inestables, volviendo a las formas bacterianas originales al cabo de 24-48 horas, lo que provocó la muerte de los animales. Con la introducción de 2000 unidades de penicilina por 1 g de peso durante 24-48 horas. se formaron formas L estables y se sometieron a fagocitosis; Muerte de animales en los próximos 5 días. no fue observado. Se obtuvieron datos similares al estudiar la inducción in vivo de formas L de otras bacterias.

Se ha desarrollado un esquema original para aislar formas L de material patol, que permitió aislar e identificar formas L de bacterias del líquido cefalorraquídeo de pacientes con meningitis purulenta y carditis reumática.

La Figura 3 muestra microfotografías de las formas L aisladas de la sangre de un paciente con carditis reumática y sus reversiones, formadas como resultado de la reversión a estreptococos, posteriormente identificadas como Streptococcus hemolyticus grupo A.

Se encontraron anticuerpos contra las formas L estables de Streptococcus hemolyticus en el 87,9% de los pacientes con reumatismo, en el 77% de los pacientes con miocarditis alérgica infecciosa y sólo en el 11%. gente sana(V.D. Timakov, G.Ya. Kagan, 1973). Las formas L de diferentes tipos de bacterias se encuentran en enfermedades crónicas, bacteriuria, pielonefritis, formas abacterianas de tuberculosis, carditis reumática, etc.

Se ha demostrado experimentalmente la patogenicidad de las formas L de bacterias, hron, artritis causada por la administración intraarticular de formas L de Streptococcus hemolyticus, amigdalitis de monos, complicada con miocarditis intersticial, inducida por la administración intravenosa de formas L de Streptococcus hemolyticus. Se conocen pielonefritis en ratas y conejos causadas por formas L de bacterias del género Proteus y Streptococcus faecalis, meningoencefalitis en conejos asociada con formas L de meningococos y listeriosis en ovejas y conejos causada por la administración de formas L de Listeria monocytogenes. . Patol, los procesos causados ​​por formas L de bacterias se distinguen por el desarrollo gradual de patol. fenómenos, curso prolongado y persistencia del patógeno en la forma L, que apoyan la transición de la enfermedad a una forma crónica. La persistencia de las formas L de bacterias se estableció experimentalmente en las formas L de Mycobacterium tuberculosis y Streptococcus hemolyticus.

Con una única infección intraperitoneal de ratones blancos con formas L estables de Streptococcus hemolyticus y observación posterior durante un año, el antígeno en forma L permanece en todos los órganos internos. La Figura 4, 1 muestra un ejemplo de la localización de las formas L de Streptococcus hemolyticus en el bazo después de 3 semanas. después de la infección, en la Figura 4, 2 - después de 27 semanas. La persistencia prolongada de las formas L en el cuerpo va acompañada de un aumento del efecto dañino; desarrollo de miocarditis intersticial y glomerulonefritis grave.

La formación de formas L de bacterias in vivo, su conexión con muchos procesos crónicos, la posibilidad de reversión de formas bacterianas con restauración de su virulencia y la aparición como resultado de intratables. terapia efectiva Las recaídas se antepusieron a la miel. microbiología, el problema de encontrar formas de combatir variantes de microorganismos que han perdido su pared celular (esferoplastos, protoplastos, formas L). La búsqueda se realiza desde dos posiciones diametralmente opuestas: 1) impedir la posibilidad de inducción de formas L in vivo (vía difícil de controlar); 2) el uso de agentes que inducen la formación de formas L, seguido del uso de otros fármacos que son ineficaces contra las células intactas, pero que penetran intracelularmente solo en las formas L de bacterias y las destruyen. Este camino es el más prometedor. Existe evidencia de la eficacia de las combinaciones de penicilina y kanamicina utilizadas para el tratamiento de la pielonefritis. La penicilina induce la formación de formas L de bacterias, que son destruidas por la penetración intracelular de kanamicina, que no tiene ningún efecto sobre las bacterias intactas.

Bibliografía: Peshkov M. A. Citología de bacterias, p. 151, M.-L., 1955; Timakov V.D. y Kagan G.Ya. Formas L de bacterias y la familia Mycoplasmataceae en patología, M., 1973, bibliogr.; también conocido como formas L de bacterias, la familia Mycoplasmataceae y el problema de la persistencia microbiana, Zhurn, mikr., epid, i imm., No. 4, p. 3, 1977, bibliografía; Di enes L. La morfología del Li de Klieneberger y su relación con streptobacillus monoliformis, J. Bact., v. 54, pág. 231, 1947; D i e-nes L. a. Weinberger H. Las formas L de las bacterias, Bact. Rev., v. 15, pág. 245, 1951; Klieneberger E. La aparición natural de organismos similares a la pleuroneumonía, su aparente simbiosis con streptobacillus moniliformis y otras bacterias, J. Path. Bact., v. 40, pág. 93, 1935; Kli eneb erger-N obel E. Organismos similares a la pleuroneumonía (PPLO) mycoplasmataceae, L.-N.Y., 1962; Protoplastos microbianos, esferoplastos y formas L, ed. por LB Guze, Baltimore, 1968.

V. D. Timakov, G. Ya.